專利名稱：用全息視頻顯微術來跟蹤和表征顆粒的制作方法
技術領域：
本系統和方法旨在通過對經由全息視頻顯微術記錄的全息圖的定量分析來測量 膠體顆粒在膠態(tài)分散體內的三維位置，此外還表征每個顆粒的形狀、尺寸、以及光學性質。 從此分析獲得的信息可以用來表征膠體顆粒本身。此信息還可以用來測量和檢驗顆粒分散 在其中的介質的性質。在所有此類應用中，定量全息視頻顯微術與先前已描述和實施的方 法和分析系統相比提供顯著的優(yōu)點。
背景技術：
顆粒成像測速技術被廣泛地應用于測量分散在透明介質中的膠體顆粒的軌跡。顆 粒成像測速技術的傳統實施方式包括使用標準光顯徽術來形成顆粒的圖像并隨后通過計 算機圖像分析方法來分析那些圖像。此類測量和分析通常提供關于單獨的顆粒在顯微鏡的 焦平面中的位置的信息，而不是提供關于顆粒相對于焦平面的軸向位移的信息。在提取軸 向跟蹤信息的情況下，結果通常具有本質上比平面內位置更差的空間分辨率。此外，軸向位 置的測量對于每個顆粒需要單獨的標定測量。此類傳統的顆粒成像方法通常很少提供關于 顆粒的尺寸、形狀、或組成的信息。因為移動至過于遠離焦平面的顆粒的圖像變得過于模糊 且擴散而無法進行分析，因此可以應用傳統顆粒成像方法的軸向位移的范圍受到顯微鏡的 焦深的限制?；趫D像的顆粒跟蹤的應用包括測量流動流體中的流線，評估膠態(tài)分散體對于 聚合和絮凝的熱力學穩(wěn)定性，測量膠體顆粒之間的相互作用，測量膠體顆粒與表面的相 互作用，評估顆粒對外部場和力的響應，表征顆粒的粘滯曳力特性，并使用顆粒的運動作 為包埋介質的粘彈性和流變性質的探測指標。后一類測量一般稱為顆粒跟蹤微流變學 (microrheology)，其中，使用膠體顆粒作為介質的流變性質的顯微鏡探測指標。所有此類 應用均得益于顆粒跟蹤技術，所述顆粒跟蹤技術提供較好的空間分辨率、三維跟蹤、和較寬 的軸向范圍。諸如微流變學的某些這種應用還需要關于探測顆粒的特性的信息，諸如其半 徑。通常，在單獨的測量中獲得該顆粒表征數據。在微流變學的特定情況下，有其它方法可用于獲得關于介質的粘彈性性質的等價 信息。其中有擴散波光譜、動態(tài)光散射和干涉儀顆粒跟蹤。所有此類方法相比基于顆粒成 像的方法提供更優(yōu)越的帶寬。然而，前兩種方法不提供在某些應用中需要的空間分辨測量。 干涉儀顆粒跟蹤提供優(yōu)良的帶寬和優(yōu)良的跟蹤分辨率。然而，其只能應用于樣本中的一點 或兩點，因此不能用于對流變性質的多點檢驗。這些方法中沒有一種適合于分析非均相樣本的性質。
單獨的膠體顆粒通常由其形狀、其尺寸、其總體成分、及其表面性質來表征。用這 些量的分布以及通過顆粒的總濃度來表征膠態(tài)分散體?？梢酝ㄟ^對干燥且另外制備的樣 本的電子顯微鏡檢查來評估尺寸和形狀。然而，制備可能改變顆粒的性質，因此，此類測量 的結果可能無法準確地現場反應顆粒的特性。通常將光散射法用于膠體顆粒尺寸的現場分 析。然而，此類測量提供分散體中的顆粒的樣本平均視圖，且通常需要以用于顆粒的尺寸分 布、形狀、和折射率的近似或現象學模型進行詳細解釋。一般使用的商用顆粒分選(sizing) 儀器基于這些方法并受到其限制。此外，這些方法不能用來表征在顆粒跟蹤測量中使用的 特定顆粒。諸如庫爾特計數器的其它顆粒分選儀器同樣依賴于間接方法來測量顆粒尺寸且 不能現場應用。還已知多種用于測量膠體顆粒的折射率的方法。傳統光散射法通常提供用 于折射率的樣本平均值并需要關于顆粒的尺寸和形狀的信息。特別有效的方法包括使流體 的折射率與顆粒的折射率匹配并隨后測量流體的折射率。該方法需要與膠體相容的折射率 匹配流體且在可以評估的折射率的范圍方面受到很大限制。

發(fā)明內容
對通過全息視頻顯微術獲得的圖像的定量分析提供同時跟蹤并表征大量膠體顆 粒所需的信息，并單獨地提供關于每個顆粒的信息。為了跟蹤顆粒，這種方法在軸向位置的 超大范圍內提供三維的納米級位置測量。該高分辨率寬范圍三維跟蹤數據對于微流變學的 應用是理想的，且類似地可以有利地在當前應用傳統顆粒跟蹤的任何應用中使用。全息顆 粒跟蹤用于尺寸從幾納米到至少幾微米的顆粒。其提供用來獲取全息圖的視頻照相機的全 時間分辨率。為了進行顆粒表征，全息分析提供具有納米分辨率的半徑和具有不劣于千分 之一的相對誤差的復折射率。其覆蓋從高折射率介質中的低折射率氣泡到其折射率過高而 不能用其它方式來評估的顆粒的整個范圍的折射率。這些規(guī)格超過單獨地專用于顆粒表征 許多方法的規(guī)格。高分辨率顆粒跟蹤與現場顆粒表征的精確性的組合使得不能以其它方式 執(zhí)行的測量成為可能。本文描述本發(fā)明的各種方面；并在下文(包括下文描述的附圖)中更詳細地描述 這些及其它改進。


圖IA示出全息視頻顯微鏡的示意性表示；圖IB示出圖IA中描繪的像平面中的所 得到的光散射；圖IC示出所得到的測量的全息圖且圖ID示出使用本發(fā)明的方法的擬合全 息圖；圖2A示出分析樣品以提供特性信息的優(yōu)選實施例的示意性流程圖；圖2B示出處 理樣品數據的計算機軟件驅動方法的細節(jié)；圖3A示出在牛頓流體中自由地擴散的聚苯乙烯珠的軌跡的三維圖；且圖3B示出 作為時間函數的每個X、1、Z坐標的均方位移；圖4A示出從圖3A和3B的數據提取的粘彈性模量G' (ω)和G" (ω)的度量；圖 4Β示出相關動態(tài)粘度η (ω)；圖4C示出水中的250k Da聚環(huán)氧乙烷(“ΡΕ0”)的17wt. % 樣本的粘彈性模量，插圖示出探測顆粒的軌跡的均方位移；且圖4D示出動態(tài)粘度；
圖5A示出重組S型多糖生物膜的粘彈性模量G' (ω)和G" (ω)，其具有均方位 移的插圖；圖5Β示出S型生物膜的動態(tài)粘度；圖5C示出用于同一濃度下的N型多糖的與圖 5Α相同的變量；且圖5D示出用于N型多糖的相同濃度的與圖5Β相同的變量；圖6Α示出商業(yè)乳品樣本的脂肪球半徑相對于折射率的關系，每個數據點表示單 個脂肪滴的結果(根據擬合參數的歸一化方差指數計算誤差棒)；圖6Β示出計數分布相對 于直徑的關系；且圖6C示出計數分布相對于折射率的關系；圖7Α示出對于水中的B分散型浸油的在具有和沒有表面活性劑的情況下的折射 率相對于液滴半徑的關系；圖7Β示出計數分布相對于直徑的關系，且圖7C示出計數分布相 對于折射率的關系；圖8Α(1)示出在Zp = 22. 7 μ m下來自水中的1. 43 μ m直徑的聚苯乙烯球的歸一化 全息圖B(P)；圖8A(2)是使用等式(18)的數值擬合；圖8A (3)示出對于所述球的方位角平 均徑向分布B(P)；圖8B(1)示出在zp = 7.0 μ m下分散在浸油(nm = 1.515)中的1.45 μ m 直徑1102球的全息圖數據；圖8B(2)示出如在圖8A(3)的方法中的數值擬合；圖8B(3)示出 相應的方位角平均徑向分布B(P)；圖8C(1)示出在2￡) = 38.84 111下的水中的4.54 111 SiO2 球的全息圖數據；圖8C(2)示出如在圖8A(3)的方法中的數值擬合；且圖8C(3)示出相應方 位角平均徑向分布B(P)；圖9A(1)示出軌跡開頭部分處的膠體硅石球的數字全息圖像；圖9A⑵示出該軌 跡的末尾處的膠體硅石球；圖9B(1)示出在軌跡的開頭部分處使用等式(18)的相應數值擬 合；且圖9B(2)示出在該軌跡的末尾處的相應擬合；圖10示出膠體硅石球的三維軌跡，該三維軌跡顯示已標記的其起始點(圓圈)和 終點(正方形)；圖11示出與熱沉淀相關的熱波動函數z(t)(插圖是與位置無關的折射率的擬 合)；以及圖12示出作為τ (sec.)的函數的均方位置波動，其具有愛因斯坦-斯莫盧霍夫 斯基X、ι、Z的定標并具有軌跡投影的X、y平面的插圖。
具體實施方式
在圖IA中示意性地描繪的該全息顯微鏡10基于商用倒置光學顯微鏡(Zeiss Axiovert TV 100S)。用在λ = 632. 8nm的真空波長下工作的準直IOmW氦氖激光器20 (例 如，Uniphase)來取代傳統白熾照明器。樣品散射平面波照明光的一小部分，所述樣品諸如 為設置在位置rp處的載物臺或保持器38上的介質35內的單獨顆粒12或不同相30。散射 的光50隨后傳播到顯微鏡10的焦平面60，在那里，光50與激光束光40的未散射部分干 涉。所得到的干涉圖案被顯微鏡的物鏡70 (諸如S PlanApo, IOOx, NA 1. 4，油浸)且在用 數字視頻記錄器18 (例如PanasonicDVR-HllO，未示出)記錄為未壓縮數字視頻之前被視頻 目鏡80 (0. 63x)投射到CCD照相機15 (諸如NEC TI-324AII)上，由執(zhí)行嵌入模塊120中的 各種計算機軟件的計算機100來處理累積數據。在本發(fā)明的優(yōu)選形式中，模塊120上的計 算機軟件包括用于對樣品的數據特性進行操作的一組指令。樣品12、30的數據特性涉及由 從樣品12、30散射的激光50與激光40的未散射部分的相互作用得到的干涉圖案。該組指 令還包括散射函數，該散射函數在執(zhí)行時提供描述樣品12、30的性質的收斂解，從而使得能夠表征樣品12、30的機械性質、光學性質、和化學性質中的至少一個。由記錄器18提供的視頻流中的每個全息圖像是顯微鏡的視場中的散射體的三維 分布的時間分辨快照。在附加實施例中，多個時間快照使得能夠跟蹤顆粒軌跡并獲得特性 性質。然后我們使用小顆粒12進行的光散射的洛倫茲-米氏理論(或作為程序嵌入軟件 模塊120中的其它適當光散射方法)的結果來測量每個顆粒12或不同相30的特性。在 圖IA的系統中，可以將從記錄器18輸出并經計算機100處理的樣 品數據輸出到控制系統 150，控制系統150用于為樣品12、30生成質量控制或生產控制信號100。在最優(yōu)選實施例中，顯微鏡10依照圖2A和2B所示的流程圖操作。全息圖像的獲 取從選擇用來照射樣品12、30的激光器20開始?？梢葬槍μ囟☉眠x擇的激光器20的特 性包括光40的波長、光40的不同波長的數目、相干長度、每個波長下的光40的強度、以及 激光器20是連續(xù)的還是脈動的。如果激光器20是脈動的，則可以針對不同的應用使脈沖的 形狀和定時優(yōu)化。通常考慮預期的應用和顯微鏡10中的其它硬件和軟件組件來進行這些 選擇。例如，激光器20的脈動形式對于快速移動對象的時間分辨成像而言可能是優(yōu)選的。 然后，可以使脈沖與用來記錄圖像的視頻記錄器18或其它照相機的快門同步?？梢灶愃频?選擇波長以利用樣品12、30的光學性質?？梢赃x擇激光器20的多個波長以通過對在不同 的波長下記錄的全息圖的分析來獲取光譜信息。可以用能夠記錄彩色信息的照相機(諸如 視頻記錄器18)來同時記錄不同波長下的全息圖?？梢酝ㄟ^各自被選擇用于特定波長的多 個照相機來記錄它們?；蛘?，可以通過一個或多個照相機來順序地記錄它們。對于同軸全息術，最優(yōu)選的是樣品12、30足夠透明以便充足的一部分照明激光20 在不失真的情況下通過，從而形成干涉圖案。因此，必須將樣品12、30設置在透明形式的樣 本保持器38中；且被剛性地設置在激光束20中的樣本保持器38被布置為使得所得到的干 涉圖案對于顯微鏡10而言是可見的。如果滿足這些條件，則被樣品12、30散射的光40將 提供光50，光50將與激光束20的未散射部分干涉而形成干涉圖案或全息圖。顯微鏡10的 作用是將全息圖放大并將放大的全系統投射到照相機18上。因此優(yōu)選地將顯微鏡的物鏡 70和目鏡80選擇為在所選的波長下使光40的聚集、放大和投射優(yōu)化?？赡芘c單獨的數字化系統耦合在一起的視頻記錄器或照相機18記錄全息圖，將 其數字化，并將數字化圖像傳輸到數字圖像存儲系統(例如，在圖IA中被示為25)。照相機 的像素計數、空間分辨率和幀速率確定可以用全息顯微術方法執(zhí)行的測量的空間范圍、空 間分辨率和時間帶寬。另外，其動態(tài)范圍確定獲取有用的圖像所需的激光20的強度和可從 每個圖像獲取的信息量。其記錄彩色信息的能力決定照相機18能夠在多個波長下獲取全 息圖時起到什么作用。可以記錄由照相機18獲取的圖像以供稍后分析所用，或者直接將其 傳輸到圖像分析例程以進行實時分析。可以以圖2B所示的方式將圖像準備好用于分析和隨后使用。由照相機18獲取的 圖像和可能的存儲在數字圖像存儲系統25中的數據由像素陣列組成，每個像素將本地強 度值記錄為數字。在用光散射理論分析這些數字之前，最優(yōu)選地將其適當地歸一化。如本 文所述，歸一化可以包括將該圖像除以先前記錄的背景圖像。這具有消除由于虛假干涉條 紋而引起的圖像的強度變化的益處?？蛇x地，其可以包括將整個圖像除以歸一化常數，或者 通過背景照明圖案的數字模型對圖像進行歸一化。一旦將圖像歸一化，則可以基于所選的適當光散射理論對預測結果的擬合來對其進行分析。光散射理論包括多個不同的數學表示法，包括洛倫茲-米氏理論、T矩陣理論、及預測由被照射對象散射的電波和磁波的其它方法?？梢允褂萌魏未祟惐硎痉▉矸治鰵w一 化圖像。在樣品12、30是球的特定情況下，洛倫茲-米氏理論是特別合適的。對于較復雜 的結構，T矩陣理論可能是優(yōu)選的。一旦已經選擇用于散射光場的適當表示法，則可以通過控制可調參數來將歸一化 圖像對該理論進行擬合。在樣品12、30的均質各向同性球對象的特定情況下，可調參數包 括球的三維位置、其半徑、及其復折射率。在更復雜對象的情況下，可能需要附加擬合參數。 通常，必要的擬合包括對可調參數的高度非線性優(yōu)化。在我們將此方法付諸實施時，我們采 用Levenberg-Marquardt非線性最小二乘優(yōu)化算法。對于某些應用，其它算法可能是優(yōu)選 的。可以使用計算機100的CPU逐個像素地執(zhí)行擬合。可選地，可以通過使用圖形處理單 元(GPU)或另一此類并行處理系統(在圖IA中也稱為“計算機100”)來加速計算?？梢栽诿總€記錄的全息圖像中對樣品12、30執(zhí)行擬合?？蛇x地，可以出于其它考 慮在每個圖像中選擇某些特定的樣品12、30。一旦已經分析了圖像，則可以以隔離方式或與 來自其它圖像的數據相結合地分析對象數據。該對象數據可以是供其使用的所期望的最終 產品(product)。對于檢驗樣品12、30的三維結構或評估樣品12、30的樣本的光學特性的 情況而言可能如此?？梢詫悠?2、30中的單獨一個的全息圖像的序列組合以導出該樣品的三維軌 跡的時間分辨測量結果。該軌跡本身可以用作用于進一步分析的輸入。例如，可以使用軌 跡數據的統計分析來導出流動流體的速度場的測量結果。通常，該測量稱為顆粒成像測速。 因此，可以將基于全息顆粒跟蹤的變化稱為全息顆粒成像測速?？蛇x地，可以分析軌跡數據 以獲得關于介質35的粘彈性質的信息，其中多個樣品顆粒18散布在介質35內，這可以稱 為全息微流變學(下面將在A部分中對此進行更詳細的描述)。如下文更詳細地描述的那樣，可以隨著時間的推移監(jiān)視樣品的尺寸和折射率數據 及單獨顆粒的尺寸和折射率。在穩(wěn)定系統中，這些值應保持恒定。這些值中的變化提供關 于系統內的變化條件的信息。該信息可能在諸如全息微流變學的應用中有用。可選地，可 以從多個全息圖像獲得顆粒18或相30的統計集合(ensemble)的尺寸和折射率?？梢苑?析該集合以估計主體樣品12、30內的尺寸和折射率的統計分布。該信息在對過程和產品進 行質量和一致性監(jiān)視時是有用的。在非球形樣品12、30的情況下，還可以獲得諸如形狀和 取向的附加信息，并執(zhí)行統計分析。在某些情況下，可以通過在多個波長下測量樣品12、30的折射率來評估其化學組 成。在諸如被涂覆球的異質樣品的情況下，組成分析可以檢測樣品12、30的表面上的涂層 的存在或組成。組成分析對于過程控制和產品質量保證是有用的，例如作為檢測乳狀液或 基于顆粒的產物中的摻雜物的手段。分子尺度涂層的檢測對于無標簽分子結合檢驗是有用 的。幾何和組成數據的其它應用也應是顯而易見的，包括同樣利用跟蹤數據的應用。A.介質的微流變學在各種實施例中，應用這種方法來分析許多不同類型的顆粒和相12、30。在一個優(yōu) 選實施例中，我們已通過直接地或通過介質對嵌入的探測顆粒的影響來分析其熱驅動波動 而執(zhí)行介質的粘彈性性質的全息微流變分析。在一個實施例中，該方法能夠監(jiān)視探測顆粒 的均方位置波動< Δ r2 (t) >，并使用廣義Stokes-Einstein關系式來提取介質的頻率相關儲能模量G' (ω)。這通過Kramer-Kronig關系式與頻率相關損耗模量G" (ω)相關，其完 成微觀機械性描述。我們的示例性探測顆粒是標稱半徑a = 0. 75 μ m(Duke Scientific, Catalog#5153A,Lot#26621)的填充穩(wěn)定(charge-stabilized)聚苯乙烯球，其通過漩渦而 隨機地分散到樣本介質中。該樣本介質隨后被填充到通過將1號蓋玻片結合到顯微鏡用載 玻片的表面形成的透明容器中。允許密封的樣本介質在T = 23士 1°C下在顯微鏡載物臺上 達到熱和機械平衡。 在數字視頻記錄器(Panasonic DMR-E100H)上以每秒30幀的速度記錄全息圖像 作為未壓縮數字視頻流。隨后分析每個圖像以測量探測顆粒相對于顯微鏡的焦平面中心的
三維位置。更具體而言，準直激光用平面波入射電場Etl(rp) = u0(rp)exp(-ikzp)在位置rp處 照射探測顆粒，其中，1 = 2πηω/λ是折射率為^的介質中的光的波數。被顆粒散射的場 Es(r) =u0(rp)fffl(r-rp)傳播至ζ = 0處的焦平面，在那里，其與入射射束干涉。用傳統洛倫 茲_米氏散射函數fm(r-rp)來描述散射光的分布，所述洛倫茲-米氏散射函數取決于顆粒 的位置rp、其半徑a、及其折射率np。實際上，入射照明隨著位置而變，因此我們通過測量入射照明IQ(r) = |u0(r) |2來 將所測量的干涉圖案I (r)歸一化而獲得 其中α ^ 1，考慮了 IJrp)中的變化?？梢杂妙w粒的位置、半徑、和折射率作為自 由參數將等式(1)擬合到諸如圖IB所示的實例的歸一化圖像。盡管同一儀器上的傳統明 場(bright-field)顆粒跟蹤提供IOnm的平面內分辨率和IOOnm軸向分辨率，全息顆粒跟 蹤以至少一個更好的數量級執(zhí)行。此外，與傳統顆粒跟蹤不同，全息跟蹤不需要用于軸向測
量的單獨準直。我們可以通過跟蹤在諸如水的牛頓流體中自由擴散的探測顆粒來評估顆粒位置 上的測量誤差。如何顆粒距離邊界面足夠遠，則其沿著三個笛卡爾方向中的每一個的均方 位移應根據Stokes-Einstein關系式演化。
(2)其中，Dtl = kBT/(6 π na)是在絕對溫度T下粘度為η的流體中的球的擴散系數。 等式(2)中的尖括號表示起始時間內的集合平均。使該平均值局限于相隔間隔t的起始時 間保證對< Δ r/ (t) >的貢獻在統計上是獨立的。然而，當分析單個離散采樣的軌跡時，此選 擇在較長的延遲時間t的情況下提供異常大的統計誤差。在所有起始時間上求平均值改善 對<Ar/(t)>的估計且如果軌跡可作為馬爾可夫過程處理，則證明其是正確的。對于我們 考慮的熱驅動軌跡而言情況如此，且該窮盡采樣使我們能夠根據在幾千個時間步長內測量 的單個軌跡來估計均方位移。必須針對間隔t內的相關測量之間的協方差對< Δ r/(t) >中 的統計誤差進行修正。rj(t)的測量也受到隨機誤差影響，其平均值^確定跟蹤分辨率。這些誤差使顆 粒的視在均方偏移增加2 ε /，而與t無關。由于照相機的快門周期期間的運動模糊而引起的互補誤差Ts減小視在均方位移。結果由下式給出，
(3)其考慮了兩種效果，并使我們能夠測量ε」。< Δ r/ (t) >的傅立葉變換通過現象廣義Stokes-Einstein關系式與復頻率相關粘 彈性模量相關。
其中，Γ (χ)是伽瑪函數，且
(6)由此，我們獲得
(7)G' (ω)度量介質對剪切力的彈性響應，且G" ( ω )度量其粘度。它們是生物膜 對潛在治療劑的自然探測量(probe)。類似地，動態(tài)粘度
(8)提供生物膜與其周圍環(huán)境交換物質的能力的總體印象。為了確定我們的全息微流變學系統的準確度，我們首先分析在牛頓流體中擴散的 探測顆粒的運動。針對懸浮在水中的25% (w/w)甘油的密度匹配溶液中的標稱半徑為a =0. 75 μ m的單個聚苯乙烯球而獲得圖3A中繪制的五分鐘軌跡，所述溶液的粘度預期為 1. 7mPa s。用光學鑷子將顆粒設置在50 μ m厚的樣本容積的中平面處以使到玻璃壁的液力 耦合最小化并隨后將其釋放以獲取數據。將圖像擬合到洛倫茲-米氏散射公式提供ε χ = ε y = 4nm和ε x = 20nm的估計 的單圖像精度。每個坐標的均方位移在圖3B中連同對等式(3)的擬合一起繪出。全部三個 跡線與Dtl = 0. 1695 士 0. 0001 ym2/s—致。當與顆粒的測量半徑a = 0. 775 士 0. 014 μ m的 軌跡平均值組合時，這暗示η = 1. 67士0. OlmPa s的總粘度。給定ts = Ims的快門周期， 外推偏移提供、=￡y = 8±4mi^n ε z = 35士8nm。這些值與所估計的單幀分辨率一致 并暗示位置測量的準確度與其精度相當。高分辨率軸向跟蹤數據的可用性是微流變學的全息顆粒跟蹤的主要益處之一。在 這種情況下，三個數據組之間的一致性確認測量相對于與表面的液力耦合的自由性。更概 括地說，此類比較對于測量樣本的各向同性和均質性是有用的。由于來自三個坐標的結果是一致的，所以我們用等式(4)、(6)和⑶來分析三維
均方位移
)以獲得在圖4A中繪出的損耗模量G" (ω)和在圖4Β中繪出
的動態(tài)粘度η(ω)。如預期的那樣，甘油_水溶液充當牛頓流體，其儲能模量G' (ω)過 小而不能在所探測的頻率范圍內分辨。因此，其粘度Π (ω) = 1.680士0. OOlmPa s與頻率無關且與從主體測量獲得的值一致。已確定了三維顆粒法的準確度和我們的儀器的機械穩(wěn)定性，通過將其應用于標準 非牛頓樣本、高分子量PEO的水溶液而顯示出其顆粒跟蹤微流變學的效力。圖4C示出從分 散在去離子水中的200kDa PEO的17襯％溶液中的單個球獲得的G' (ω)和G" (ω)。關 于牛頓流體，在全部三個坐標中獲得一致的結果，因此，組合結果在圖4C和4D中給出。在圖4C中繪出的粘彈性模量在相當條件下在數量上與針對類似樣本報告的結果 一致。在整個頻率范圍內，損耗模量G" (ω)超過儲能模量G' (ω)，這將此樣本識別為流 體而不是凝膠。在圖4D中繪出的相關動態(tài)粘度隨著頻率的增加的單調遞減，這是剪 切稀釋 流體的標志。圖5中的數據示出對于生物膜多糖的相當結果。先前使用其它方法進行的生物膜 結構的研究已在亞毫米尺度下顯示出看起來不服從系統物理分析的非均質程度。事實上， 即使是對于名義上類似的樣本，對模型生物膜的宏觀流變性質的測量已提供相差大于三個 數量級的粘彈性模量。這些差已歸因于負荷、應變速率、總應變和樣本制備。微流變學通過探測處于平衡狀態(tài)的未加載樣本的局部尺度性質來解決這些問題 中的許多個。雖然已將顆粒跟蹤微流變學應用于大范圍的工業(yè)和生物學相關材料，但其對 生物膜的應用顯然是新的。可以在沒有游走細菌的復雜化的情況下制備模型生物膜，且其 因此有利于這種分析。對從在存在10%蔗糖的情況下在載玻片上生長的變異鏈球菌UA159(ATCC 700610)的5天的生物膜提取的變異鏈球菌多糖樣本執(zhí)行示例性研究。在室溫下用MiIIiQ 水提取水溶性(S)多糖。然后在IN NaOH中提取不可溶(N)多糖部分。將兩個提取物中和 至pH 7. 0士0. 5并在-18°C下用冷乙醇(75% ν/ν)沉淀至少24小時。所得到的多糖樣本 具有約IOkDa的平均分子量，聚合分散性為至少50%，并包含微量的蛋白質。在沉淀之后， 用75% (ν/ν)乙醇沖洗樣本幾次，吸干并以20% (ν/ν)溶解于水(S)或IN NaOH(N)中以 形成在微流變測量中使用的凝膠。聚苯乙烯探測顆粒這時隨機地分散在多糖中，并選擇密 封樣本室的中平面附近的顆粒進行測量。在圖5Α和5Β中繪出的S部分的結果與在圖4C和4D中的PEO溶液的那些結果類 似。生物膜的水溶性多糖形成大致上比水粘十倍的剪切稀釋流體。相反，圖5C中的數據顯示N型部分形成具有IOPa的典型儲能模量的彈性凝膠。這 比在其它傳統現有技術中對于變異鏈球菌多糖的主體樣本報告的平均值小幾百倍。然而， 當將顯著的測量誤差考慮在內時，其與在最低加載下報告的值一致。低加載情況下的準確 測量結果是微流變學的強度之一，因此圖5C和5D中的結果很可能反應活體內的生物膜的 性質。即使在低加載的情況下，如圖5D中的其動態(tài)粘度所指示的，N型凝膠也是強剪切稀 釋的。這對于牙齒生物膜而言是期望的特性，因為其有利于通過刷牙來去除。這些觀察結果暗示兩個部分在確定活體內的生物膜機械性質和生物學性質時的 互補作用。N型材料顯然更適合于扮演機械腳手架的角色，在其內部，生物膜的菌落形成其 生態(tài)系統。因此，可以將使N型凝膠分裂的能力視為治療劑的有前途的特性。此類藥劑對N 型提取物的影響的微流變試驗應提供簡單且具有成本效益的篩選技術。此外，全息微流變 學同時跟蹤多個探測顆粒的能力產生根據濃度單獨地和以組合方式篩選多重治療劑的機石。
B.表征乳脂肪球在另一實施例中，我們已使用本發(fā)明的方法來分析來自一系列商售乳產品的乳脂 肪滴，所述乳產品包括多個級別的均質巴氏殺菌牛奶、綿羊奶和山羊奶。在每種情況下，在 樣本密封在顯微鏡用載玻片與蓋玻片之間并設置在顯微鏡的載物臺上之前按1000 1用 去離子水對其進行稀釋。給定成像系統的IOlnm/像素的標定放大倍率，典型的640X480 像素圖像I (r)捕獲大約10個可分辨小球。未處理的全息圖受到由于斑點、顯微鏡的光學裝置中的干涉作用以及灰塵和其它 缺陷的散射而引起的大的強度變化的影響。我們通過用在在視場中沒有樣本的情況下獲得 的背景全息圖Itl(r)對I(r)進行歸一化來對其進行修正。如在前面的部分中所述，然后可 以將歸一化全息圖向洛倫茲_米氏理論的預測進行擬合， 其中，k = 2πηω/λ是復折射率nm的介質中的光的波數，并且其中，fs(r_rp)是描 述偏振光S如何被位于rp處的球散射的洛倫茲-米氏函數。實際上，照明射束并不是完美 均勻的，可以使用因數α 1來考慮諸如位置相關變化的Itl(rp)的變化。假設散射體是被 沿著i方向線性偏振的光照射的均勻且均質的電介質球，
(10)其中fn= in(2n+l)/[n(n+l)]，并且其中，M。ln(3)(r)和 Neln(3) (r)是眾所周知的矢量 球諧波。
(11) 這里，PnHcos θ )是第一類關聯的勒讓德多項式，且jn(kr)是η階的第一類球貝塞 爾函數。由眾所周知的傳統關系式來給出等式(10)中的膨脹系數。
(U)以及
(14)其中，m = np/nffl是顆粒相對于介質的折射率，jn(x)是η階的第一類球貝塞爾函 數，hn(1) (χ)是η階的第一類球漢克爾函數函數，并且其中，“’”表示相對于自變量的導數。 等式(2)中的和在許多項之后收斂，n。= ka+4.05(ka)1/3+2，其取決于顆粒的尺寸。此計算中的唯一挑戰(zhàn)是準確且高效地計算貝塞爾函數及其比率。最優(yōu)選地，使用準確、計算密集型 的連續(xù)分數展開(continued fraction)算法，其為來自Lentz的計算系數an和bn的傳統 方法。另外，可以將由于Wiscombe而更高效的遞歸算法用于球貝塞爾函數。此權衡保證我 們可以將我們的裝置用于直徑在從IOnm至大于10 μ m的范圍內且折射率超過np = 2. 6的 球來獲得準確的結果。為了表征球，我們使用Levenberg-Marquardt最小二乘法將其歸一化全息圖擬合 到用于！^?。　盺和α的等式(9)至(14)。雖然有相當多的自由參數，但這些擬合快速并 穩(wěn)定地收斂，且通常提供具有納米尺度分辨率的顆粒位置和尺寸，且其折射率在千分之一 以內。我們將此技術應用于從本地超市獲得的經商業(yè)處理的乳品的5份樣本。其包括具 有在無脂至全乳范圍內的指定脂肪含量的巴氏殺菌均質牛奶以及山羊奶。針對每個樣本分 析上至100個隨機選擇的脂肪滴以獲得對每個樣本中的脂肪滴的尺寸和折射率分布的估 計。該結果在圖6Α 6C和表1中總結。 表1 商售乳品樣本的小球半徑和折射率脂肪球的半徑隨著脂肪含量的增加而增加，半徑的分散也是如此。來自牛奶的單 獨小球的平均折射率η = 1.464與通過光散射獲得的單液滴折射率的樣本平均值一致。其 基本上超過針對主體樣本的總折射率獲得的1. 3444至1. 3525的范圍。該值由水的光學性 質控制，水在室溫下的折射率為Hm= 1.333。相反，全息測量提供單獨液滴的值，并因此提 供比這些先前報告的方法中的任何一個更詳細地脂肪性質的視圖。事實上，可以基于此將 山羊奶與牛奶區(qū)別開，山羊奶具有可分辨的較低平均折射率。有趣的是，此關系隨著乳品的老化而變。表1顯示山羊奶液滴的平均折射率在一 個月的時間內增大，上升至1. 45。此結果表明全息表征不僅可用于區(qū)別乳品類型，而且可用 于評估樣本的齡期(其與化學變化相關)。訪問顆?？煞直鏀祿€顯示脂肪球的尺寸和具有其估計的折射率的分散體之間 的感興趣的相關性。較大顆粒的視在折射率在該測量技術的分辨率內是相互一致的。較小的液滴顯示出基本上較大的折射率范圍。這不是對該測量技術的固有限制，如圖7A 7C中的數據所表明的那樣。圓形數據點是針對由于劇烈剪切而作為球形液滴分散在水中的Cargille B型顯微鏡浸油的液滴 而獲得的。在25士C的溫度下，對于紅光而言，此油具有1.515的標稱主體折射率。此值與 在此研究中考慮的液滴半徑的整個范圍內、從0. 25 μ m到2.5 μ m范圍內獲得的單液滴結果 一致。液滴之間的變化可以歸因于通過等式(9)進行的對照明強度變化的不完美修正。當用表面活性劑使油滴穩(wěn)定時，獲得更使人想起乳脂肪滴的結果的結果。圖7A中 的方形點是針對添加了 0. 1% (v/v)Tergitol ΝΡ9、非離子表面活性劑的B型油而獲得的， 所述非離子表面活性劑的主體折射率是1. 491。此表面活性劑的添加減小了較大顆粒的單 液滴折射率。其還應增大針對較小顆粒測量的折射率的范圍。此觀察結果使我們斷定全息顆粒表征對于表面性質、且特別是對于表面活性劑的 表面覆蓋度敏感。在乳液滴的情況下，其暗示全息顯微術對乳脂肪球膜(MFGM)敏感。此敏 感性是顯著的，因為僅僅在10至20nm厚度下，MEGM比光的波長薄得多并構成液滴體積的 非常小的一部分。針對較小液滴獲得的結果的可變性很可能反應基于等式10至14的推導的假設不 成立。洛倫茲-米氏散射理論的這種形式適合于具有突變界面的均質各向同性球。使用此 結果來解釋被涂覆球的全息圖可能導致所提取的參數的不一致性。這種影響對于其表面面 積與體積的比率較高的較小球而言更加明顯。應用考慮了核_殼結構的更完善形式的散射 函數將以較大的附加計算復雜性為代價減小此可變性。較小的乳脂肪滴還系統地顯示比較大液滴更大的折射率。這可以反應MFGM和甘 油三酸酯核的脂肪酸組成的尺寸相關變化。因此，甚至全息表征的最簡單實施方式也對評 估乳脂肪滴組成也可能是有用的?？梢酝ㄟ^同時在多個波長下執(zhí)行對單液滴的全息表征來獲得更多信息。所得到的 光譜信息可用于進一步量化單個小球的組成。然而，即使以其最簡單的形式，通過全息顯微 術進行的脂肪球表征也提供對乳脂肪組成的逐顆粒分析(以別的方式無法獲得)。其幾乎 不需要專用設備，因此可以容易地適合于過程控制和質量保證應用。全息表征對乳品的特定應用表明可以基于全息分析來確定乳品樣本的類型(母 牛、山羊等)和質量(無脂、全脂、新鮮、過時等)。此觀察結果暗示全息表征對乳品場工業(yè) 中的質量保證和過程控制的特定應用。更概括地說，基于本文的公開，全息表征針對諸如油 漆、其它食物、以及化妝品的其它基于乳狀液的系統的更廣泛使用很明顯可適用。還應注意的是全息表征對乳狀液滴的表面性質以及其主體性質敏感。表面表征可 以包括識別表面涂層的存在、表面覆蓋度的測量、以及表面涂層性質的表征。對更完善形式 理論的擬合可以提供關于表面涂層的厚度和組成的定量信息。這對于乳品表征是有用的， 且其還將在顆粒的表面可能不同于其主體的其它情況(如上所述)下有用。C.表征膠體顆粒在另一實施例中，分析并表征分散在水中的聚苯乙烯硫酸鹽球。如前文所 述，數字化全息圖提供顆粒的三維位置rp、其半徑a、及其折射率np。我們假設入射場
在 方向均勻地偏振，并在將被視為沿著i方向傳播的平面波的顆粒的尺寸內足夠緩慢地變化。因此，其在顆粒的平面ζ = Zp中的位置P = (x,y)處的振幅Utl(P)與其在焦平面Z = O中的振幅相同。該波沿著i方向傳播，波數為1 = 2πηω/λ，其中，λ 是光在真空中的波長且~是介質的折射率。對于25°C下的純水，在λ = 0.632下，nm = 1. 3326。rp處的顆粒將入射場的一部分散射到高度結構化的出射波Es (r) = QexpHkzp) u0(rp)fs(r-rp)中，其中，a = 1考慮了照明的變化，并且其中，fs(r)是洛倫茲-米氏函數， 其取決于a、np、nn^n λ。該散射場一般覆蓋由Iutl(P) I2的長波長變化所支配干涉圖案 的焦平面處的足夠大的區(qū)域。已表征了所得到的失真，但在I(P)的先前分析中 未進行修正。幸運的是，Iutl(P) I2可以在空視場中測量，并且可以將同軸全息圖歸一化以 便在平面Z = 0上獲得無失真圖像， 如果我們進一步假設準直入射射束的相位在視場內緩慢地變化，則該歸一化圖像 與通過下式在平面Z = 0中計算的米氏散射圖案fs(r)相關， 可以通過將顆粒的三維位置、其半徑及其折射率作為自由參數來將等式(18)擬 合到所測量的全息圖。先前的研究針對這些量中的某些而并非全部五個將非歸一化全息圖 擬合到現象學模型或米氏散射理論。由于可調參數的誤差在很大程度上是相關的，所以不 同時使其全部優(yōu)化提供不準確的結果。作為替代擬合到整個洛倫茲_米氏理論提供具有更 高精度的更多信息。通過使用照相機的測量信噪比來估計單像素誤差的Levenberg-Marquardt非線 性最小二乘極小化算法來執(zhí)行對數字化和歸一化全息圖像的數值擬合。我們報告的所有擬 合的χ2偏離具有一致的量級，因此，所計算的擬合參數中的不確定性準確地反應其精度。由于激光器的波長和介質的折射率兩者都是已知的，所以唯一的儀器標定是總放 大倍率。這與其它三維顆粒跟蹤技術形成對比，其它技術需要對于每種類型的顆粒進行獨 立標定(特別是為了深入地跟蹤顆粒)。圖8A(1)中的圖像(及圖8A⑵和8A(3)的隨附數據)示出用于分散在焦平面之 上的高度Zp = 22.7 μ m處的水中的聚苯乙烯硫酸鹽球的歸一化全息圖B (P)。此球是從具 有2a = 1. 48士0. 03 μ m的標稱直徑的商業(yè)樣本(Bangs Labs, Lot PS04N/6064)獲得的。 針對0. 25毫秒的曝光時間來設置照相機的電子快門以使由于布朗運動而引起的模糊最小 化。在將原始8位數字化圖像歸一化之后，每個像素大致包含5個有效信息位。對B(P) 的數值擬合不僅如實地再現干涉條紋的位置，而且還如實地再現其幅值?？梢愿鶕较蚪?平均值來判斷擬合的質量；實線曲線是B ( P )的中心附近的角平均值，虛線曲線指示平均 值的標準偏差，且離散點是通過擬合獲得的。對于半徑a = 0.73士0.01 μ m的擬合值(參見圖8A(2))落在樣本的特定范圍內，其反應用Beckman Z2庫爾特計數器獲得的0. 69士0. 07 μ m的下界和用分析離心分離獲得 的0. 76士0. 08 μ m的上界。引用與測量顆粒尺寸之間的一致性暗示本測量的準確度相當于 其精度。在這種情況下，精度和準確度兩者均超過先前通過對I(P)的分析獲得的結果。折 射率的軌跡平均值np = 1. 55 士0. 03也與從對主體分散體的光散射測量推斷的聚苯乙烯膠 體的性質一致。已通過分析光學捕獲中的膠體顆粒的動態(tài)特性而實現測量單個顆粒的折射率 時的相當精度。然而，這種方法只能應用于具有相對小的折射率的顆粒，因為具有大于 np 1.3nm的相對折射率的顆粒難以捕獲。相反，全息表征只需要單個全息快照而不是擴 展時間序列，不需要光學捕獲，因此不需要捕獲的單獨標定，并且在顆粒尺寸和折射率的更 寬范圍內有效。 圖8B⑴至8B(3)中的附加數據是針對焦平面之上的zp = 7 μ m處的1. 45 μ m直 徑TiO2球而獲得的。此樣本是由四乙氧基鈦合成且經過加熱處理以增加其密度。除非介 質與蓋玻片是折射率匹配的，否則此類高折射率顆粒的強前向散射產生成像偽象。將顆粒 分散在浸油Oim= 1.515)中消除這些偽象，但引入我們使用的透鏡的球面像差，這必須進 行修正以獲得可靠的結果。1. 45士0. 03nm的擬合直徑和2. 01 士0. 05的折射率分別與通過 電子顯微術和主體光散射獲得的結果一致。此結果是值得注意的，因為沒有其它單個顆粒 表征方法用于此類高折射率。圖8C(1)至8C(3)中的數據示出針對在焦平面之上的zp = 38. 8 μ m處分散在水中 的標稱5 μ m硅石球(Bangs Labs, Lot SS05N/4364)的結果。擬合折射率np = 1. 434士0. 001 適合于多孔硅石且直徑a = 4. 15 士0.01 μ m與用Beckman Z2庫爾特計數器針對此樣本獲得 的4. 82 士0. 59 μ m值相符。我們已成功地將全息表征應用于直徑小到IOOnm并大到10 μ m 的膠體球。與基于模型的分析方法不同，擬合到精確的洛倫茲-米氏散射理論在寬得多的 顆粒尺寸范圍內是穩(wěn)定且可靠的，條件是注意在計算fs(r)時保持數值穩(wěn)定性。相同的擬合以平面內Inm和沿光軸IOnm的精度分辨顆粒的位置?？梢杂脗鹘y照 明來獲得相當的納米尺度跟蹤分辨率，但其不需要針對每個顆粒的詳細標定。全息成像的 另一益處是與傳統顯微術相比非常大的焦深。我們的系統提供在大于100 μ m的范圍內的 有用數據，其與使用傳統照明的士 3 μ m可用焦深形成對比。全息視頻顯微術適用于三維顆粒跟蹤，如圖9A(1)至9B(2)中的數據針對分散在 水中的膠體硅石球(Bangs Labs,Lot SS04N/5252)所證明的那樣。用光學鑷子將此顆粒在 焦平面之上提高30 μ m，并隨后將其釋放且允許其沉淀。圖9A(1)和9B(1)中的圖像示出其 軌跡的開頭部分附近和末尾附近的顆粒。對等式18的擬合在圖9A(2)和9B(2)中示出。在圖10中繪出顆粒在其下降的15秒期間以1/30秒為間隔的測量軌跡。圖11中 的其垂直位置ζ (t)顯示關于均勻沉淀速度的波動，ν = 1.021±0.005ym/s。這通過Pp =Pm+9nv/(2a2g)來提供對顆粒密度的估計，其中，P m = 0. 997g/cm3是水的密度，且η =0. 0105Ρ是其在T = 21°C下的粘度，并且其中，g = 9. 8m/s2是由于重力而引起的加速 度。在a = 0.729 士 0.012μπι處，顆粒半徑的擬合值隨著顆粒的沉淀而保持恒定。此值與 用BeCkmanZ2庫爾特計數器測量的制造商指定的0. 76士0. 04 μ m的半徑一致。因此，我們 獲得Pp = 1.92士0.02g/cm3，其比該樣本的制造商額定值小幾個百分數。然而，折射率的 擬合值np = 1. 430士0. 007也比額定值低1. 5%，暗示顆粒的密度確實比指定的低。
顆粒位置的分量的均方位移
提供附加的一致性檢查。如 圖12中的數據所示，單獨笛卡爾分量的軌跡中的波動相互一致，且三個全部顯示出線性 Einstein-Smoluchowsky 定標
擴散系數 D = 0. 33士0. 03ym2/s。這與預期的 Stokes-Einstein 值 Dtl = kBT/(6 π η a) = 0. 30士0. 03 μ m2/s—致，其中，kB 是玻爾茲曼常 數。從對Ar/(t)的線性擬合獲得的偏移在整個軌跡中也是一致的，不劣于針對平面內位 置的Inm和針對軸向位置的IOnm精度。因此，對顆粒性質的光學表征與所測量的顆粒動態(tài) 特性一致。通過視頻全息顯微術使其成為可能的對探測顆粒的三維軌跡的精確測量本質上適合于在顆粒成像微流變學中的應用。特別地，將此技術應用于生物膜對于候選醫(yī)療或治 療劑的高吞吐量組合篩選很有前途。全息微流變學不評估其生物學或生物化學影響，而是 提供對這些藥劑對生物膜物理性質的影響的直接了解。在牙齒生物膜的情況下，模型多糖 凝膠的可用性將大大地簡化用于治療劑的標準試驗的開展。由于微流變測量僅需要微米尺 度的樣本，所以在厘米尺度的體系中獨立試驗的非常大的陣列應是可能的，每個試驗只需 要幾分鐘的全息記錄。很容易針對其折射率具有大虛部的顆粒和介質擴展我們已描述的技術。針對核殼 顆粒和諸如圓柱形納米線的具有更復雜形狀的顆粒的擴展類似地應是可行的。我們已證明可以使用來自同軸全息顯微鏡的單個快照來以納米尺度分辨率測量 膠體球的位置和尺寸，并以通常超過的精度來測量其折射率。因此，此類圖像的視頻流組成用于軟物質和生物系統的強大的六維顯微術。對于 三維微流變學、對于測量膠體相互作用和作為用于生物物理學的力探測，全息顆粒跟蹤是 理想的。我們已描述的方法可以應用于同時跟蹤視場中的大量顆粒以進行高度并行的測 量。在諸如光子設備的全息組件等應用中，對大顆粒集合的實時單顆粒表征和跟蹤將是無 法估價的。應用于諸如生物細胞和膠體異質結構等更高度結構化的樣本時，可以將其用作 血細胞分析和組合合成的基礎。另外，可以應用多波長全息表征的構思來獲得光譜信息，諸如折射率對波長的依 賴性。這可以用于量化乳品和相關系統中的營養(yǎng)濃度。其可以用于將摻雜物與純產品區(qū)別 開。多波長表征還提供無標定測量的機會。該構思在于所測量的顆粒尺寸應與激光波長無 關。如果用來照射樣本的激光器的波長是已知的，則可以從顆粒的視在半徑在所有波長下 應相同的條件獲得整個長度尺度的標定。雖然已示出并描述了優(yōu)選實施例，但應理解的是在本發(fā)明的較廣泛方面在不脫離 本發(fā)明的情況下本領域的技術人員可以對其進行修改和變更。本發(fā)明的各種特征在所附權 利要求中定義。
權利要求
一種用于光學地表征樣品的方法，包括提供全息顯微鏡；向所述全息顯微鏡提供準直激光束；從樣品散射準直激光束以產生散射部分；由所述準直激光束的未散射部分和所述散射部分產生干涉圖案；記錄該干涉圖案以供后續(xù)分析；以及測量樣品的空間位置、機械性質、光學性質和化學性質中的至少一個。
2.如權利要求1所述的方法，其中，所述樣品包括能夠包含顆粒的介質和被放置在介 質中的顆粒中的至少一個。
3.如權利要求1所述的方法，其中，記錄干涉圖案的步驟包括獲得關于樣品的尺寸和 關于樣品的復折射率中的至少一個的信息。
4.如權利要求1所述的方法，還包括應用散射函數來分析所記錄的干涉圖案的步驟。
5.如權利要求4所述的方法，其中，所述散射函數包括洛倫茲-米氏函數。
6.如權利要求2所述的方法，其中，所述樣品選自球形樣品、均質樣品、非均質樣品、乳 品滴、膠體顆粒、固體顆粒、乳狀液滴、核殼顆粒、薄膜和凝膠的組。
7.如權利要求1所述的方法，其中，所述全息顯微鏡包括焦平面且測量步驟包括識別 樣品相對于該焦平面的軸向位移，其中，所述樣品包括放置在介質內的顆粒。
8.如權利要求7所述的方法，其中，識別軸向位移的步驟不要求至少一個標定，或者不 受所述全息顯微鏡的焦深的限制。
9.如權利要求1所述的方法，其中，測量步驟包括在一次快照中識別樣品中的顆粒的 位置并表征該顆粒的性質，從而生成顆粒數據。
10.如權利要求1所述的方法，其中，測量步驟包括在多次快照中識別樣品中的顆粒的 軌跡并表征沿著該軌跡的性質，從而生成顆粒數據。
11.如權利要求9所述的方法，其中，所述顆粒數據包括顆粒與表面之間的相互作用、 至少兩個顆粒之間的相互作用、樣品的流體的速度場和此樣品的介質的粘彈性性質中的至 少一個。
12.如權利要求10所述的方法，其中，所述顆粒數據包括顆粒與表面之間的相互作用、 至少兩個顆粒之間的相互作用、樣品的流體的速度場和此樣品的介質的粘彈性性質中的至 少一個。
13.如權利要求1所述的方法，其中，所述樣品包括保持顆粒的膠狀懸浮的介質且測量 步驟包括分析介質以及懸浮體的顆粒之間的相互作用中的至少一個。
14.如權利要求1所述的方法，其中，測量機械性質的步驟包括測量顆粒形狀。
15.如權利要求1所述的方法，其中，測量步驟包括以下中的至少一個測量樣品的流 動流體中的流線、評估樣品的膠態(tài)分散體對于聚合和絮凝的熱力學穩(wěn)定性、測量樣品的膠 體顆粒之間的相互作用、測量膠體顆粒與樣品表面的相互作用、評估顆粒對樣品的外部場 和力的反應、表征樣品的顆粒粘滯曳力特性、以及使用顆粒的運動作為包括樣品的介質的 粘彈性和流變性質的探測指標。
16.如權利要求2所述的方法，其中，測量步驟包括同時測量樣品的尺寸和樣品的空間 位置。
17.如權利要求1所述的方法，其中，測量步驟還包括執(zhí)行流變性質的多點試驗。
18.如權利要求1所述的方法，其中，測量步驟包括對樣品的性質的現場測量。
19.如權利要求1所述的方法，其中，所述樣品包括多個顆粒且測量步驟包括對每個顆 粒單獨地執(zhí)行測量。
20.如權利要求1所述的方法，其中，由視頻照相機全時地獲取干涉圖案。
21.如權利要求1所述的方法，其中，測量步驟包括分析探測顆粒的性質。
22.如權利要求21所述的方法，其中，分析探測顆粒的性質的步驟包括評估樣品性質 的熱驅動波動，從而確定包括樣品的介質的粘彈性性質。
23.如權利要求21所述的方法，其中，測量步驟包括確定均方波動Ar2(t)，從而使得 能夠表征包含探測顆粒的介質。
24.如權利要求23所述的方法，其中，介質的表征步驟包括確定介質的流變性質。
25.如權利要求1所述的方法，其中，測量光學性質的步驟包括確定顆粒的折射率和半 徑中的至少一個，所述顆粒包括樣品并作為溫度、化學組成和化學濃度中的至少一個的函 數而被測量，從而使得能夠表征樣品的穩(wěn)定性、樣品的化學變化和樣品的可選材料族的不 同化學態(tài)中的至少一個。
26.如權利要求1所述的方法，其中，所述準直激光束包括使用多個不同的光波長來獲 得關于樣品的光譜信息。
27.如權利要求1所述的方法，其中，將所述干涉圖案歸一化并將歸一化干涉圖案對光 散射的特定預測方法進行選擇性擬合，從而提供關于樣品的特性信息。
28.如權利要求1所述的方法，其中，測量空間位置的范圍包括動態(tài)跟蹤介質中的顆 粒，從而使得能夠表征顆粒的性質。
29.如權利要求28所述的方法，其中，顆粒的性質包括液力半徑、半徑和折射率。
30.一種全息顯微鏡，包括激光束源，其用于提供相干激光束；載物臺，其設置在所述激光束源的下游，用于接收激光束；物鏡，其設置在所述載物臺的下游；視頻目鏡和成像系統，其設置在所述物鏡的下游以收集樣品數據。
31.如權利要求26所述的全息顯微鏡，還包括用于執(zhí)行嵌入計算機軟件模塊中的計算 機軟件的計算機。
32.如權利要求31所述的全息顯微鏡，其中，所述計算機軟件執(zhí)行分析干涉圖案從而 使得能夠表征樣品的方法。
33.如權利要求32所述的全息顯微鏡，其中，所述方法包括洛倫茲_米氏函數。
34.如權利要求30所述的全息顯微鏡，還包括響應于樣品數據控制樣品的質量的控制 系統。
35.一種用于處理信息以表征樣品的計算機可讀介質，包括計算機軟件模塊，其包括計算機軟件，所述計算機軟件具有用于對樣品的數據特性進 行操作的一組指令；與干涉圖案有關的樣品的數據特性，所述干涉圖案由從樣品散射的激光束與激光束的 未散射部分的相互作用引起；并且該組指令還包括散射函數，該散射函數在執(zhí)行時提供表示樣品的性質的收斂解，從而使得能夠表征樣品的機械性質、光學性質、和化學性質中的至少一個。
全文摘要
本發(fā)明提供了產生諸如分散在透明介質中的一個或多個顆粒等樣品的圖像的同軸全息術。用來自光散射理論的結果來分析這些圖像提供具有納米尺寸分辨率的顆粒尺寸、在千分之一以內的其折射率、及具有納米分辨率的其三維空間位置。此程序快速并直接地表征樣品及其介質的機械、光學和化學性質。
文檔編號G03H1/04GK101842751SQ200880114008
公開日2010年9月22日 申請日期2008年10月30日 優(yōu)先權日2007年10月30日
發(fā)明者D·G·格瑞爾, 張福倡, 李相赫 申請人:紐約大學