專利名稱：揭示傳染性海棉狀腦病-tse病理機制的實驗?zāi)Ｐ团c方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及了一種揭示揭示傳染性海棉狀腦病-TSE病理機制的實驗?zāi)Ｐ团c方法。它涉及生命科學(xué)領(lǐng)域、及醫(yī)藥領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
傳染性海棉狀腦病-TSE是一類可以侵襲多種不同物種動物及人類中樞神經(jīng)系統(tǒng)的退行性腦病，潛伏期長，具有100％致死率，并可在不同物種哺乳動物間傳播。自1730年首次報道羊瘙癢病以來，目前已經(jīng)在20多種哺乳動物動物及人類中發(fā)現(xiàn)了自然發(fā)生或感染的TSE，其中包括人類的克-雅氏病-CJD、羊瘙癢病-Scrapie、瘋牛病-BSE等。動物及人類傳染性海棉狀腦病-TSE典型病理學(xué)改變表現(xiàn)為，造成動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)腦組織出現(xiàn)海棉狀空泡變性，蛋白淀粉樣沉積、神經(jīng)元丟失與反應(yīng)性膠質(zhì)增生。自美國科學(xué)家Prusiner在1992年，把能夠引發(fā)動物傳染性海棉狀腦病-TSE僅對被感染動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)造成嚴(yán)重病理損傷、對外周神經(jīng)系統(tǒng)及其它器官也有一定損傷的致病傳染因子確定為，一種不含核酸、具有自我復(fù)制能力的感染性蛋白顆?！狿rPSc-朊病毒以后，現(xiàn)代科學(xué)對傳染性海棉狀腦病-TSE進行了大量的相關(guān)科學(xué)研究。已經(jīng)揭示了傳染性海棉狀腦病-TSE的致病傳染因子，是由一種在人的細(xì)胞中和許多種哺乳動物的細(xì)胞中都存在的PrP基因正常表達的，蛋白分子三維空間構(gòu)象含有40％α-螺旋沒有β折疊的正常PrP朊蛋白——PrPc所轉(zhuǎn)化出的，蛋白分子三維空間構(gòu)象含有43％β-折疊的不正常PrP朊蛋白感染性蛋白顆粒——PrPSc朊病毒蛋白；因而使其獲得了能夠與細(xì)胞所表達的，蛋白分子三維空間構(gòu)象含有40％α-螺旋沒有β折疊的正常PrP朊蛋白——PrPc相結(jié)合，再將PrPc復(fù)制為蛋白分子三維空間構(gòu)象含有43％β-折疊的不正常PrP朊蛋白感染性蛋白顆?！狿rPSc朊病毒蛋白，造成動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)腦細(xì)胞組織出現(xiàn)海棉狀空泡變性，蛋白淀粉樣沉積、神經(jīng)元丟失與反應(yīng)性膠質(zhì)增生的，超出了現(xiàn)代生命科學(xué)的傳統(tǒng)認(rèn)識思維的朊病毒蛋白也能夠具有自我復(fù)制性、傳染性、致病性的特殊生物生命性質(zhì)。但是現(xiàn)代生命科學(xué)對感染性蛋白顆粒——PrPSc-朊病毒的致病機制、與相關(guān)輔助致病因子、及輔助致病因子的致病機制等許多相關(guān)細(xì)節(jié)問題仍然沒有搞清楚。
因而現(xiàn)代生命科學(xué)必須在針對傳染性海棉狀腦病-TSE致病傳染因子——PrPSc-朊病毒，嚴(yán)重?fù)p傷感染動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的綜合致病機制中所必不可少的各種相關(guān)輔助致病因子、與相關(guān)輔助致病因子的綜合致病機制的綜合基礎(chǔ)科學(xué)研究方面，及科學(xué)認(rèn)識思維、科學(xué)方法取得具有開拓創(chuàng)新重大科學(xué)突破；需要從認(rèn)識揭示傳染性海棉狀腦病-TSE致病傳染因子——PrPSc-朊病毒，嚴(yán)重?fù)p傷動物及人的中樞神經(jīng)系統(tǒng)綜合致病機制中所必不可少的各種相關(guān)輔助致病因子、及相關(guān)輔助致病因子的致病機制細(xì)節(jié)問題入手，進行系統(tǒng)的、深入細(xì)致的綜合生命科學(xué)研究，并取得科學(xué)突破，才能夠在PrPSc-朊病毒嚴(yán)重?fù)p傷動物及人的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的綜合致病機制的科學(xué)研究方面，取得科學(xué)突破。使現(xiàn)代生命科學(xué)未來能夠通過認(rèn)識揭示PrPSc-朊病毒需要與某些必不可少的相關(guān)輔助致病因子協(xié)同、才能嚴(yán)重?fù)p傷動物及人的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的綜合分子致病機制，及它們的分子生物調(diào)控靶位，而尋找出可以有效抑制PrPSc-朊病毒嚴(yán)重?fù)p傷中樞神經(jīng)系統(tǒng)所必不可少的、相關(guān)輔助致病因子的分子生物損傷致病機制，進而才會尋找出可以有效抑制傳染性海棉狀腦病-TSE的治療方法、及藥物！
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明公開了一種揭示傳染性海棉狀腦病-TSE輔助致病因子的實驗與方法通過建立由TSE致病傳染因子——PrPSc所造成的，嚴(yán)重?fù)p傷腦中樞神經(jīng)組織、及腦中樞神經(jīng)元細(xì)胞的TSE模型，一定程度損傷脊髓中樞神經(jīng)組織、及脊髓中樞神經(jīng)元細(xì)胞的TSE模型，與僅輕微損傷或不損傷外周神經(jīng)組織、及某些種神經(jīng)元細(xì)胞和某些種非神經(jīng)細(xì)胞的對比NTSE模型；由增、減輔助致病因子的外加條件所造成的，能夠增強PrPSc損傷缺乏輔助致病因子的神經(jīng)元細(xì)胞和非神經(jīng)細(xì)胞的TSE模型、減輕PrPSc損傷中樞神經(jīng)元細(xì)胞的NTSE模型，與它們相應(yīng)的那些缺乏輔助致病因子的神經(jīng)元細(xì)胞和非神經(jīng)細(xì)胞、僅會受到PrPSc輕微損傷或不會受到損傷的對比NTSE模型；并制作能夠清楚顯示表達那些模型的組織形態(tài)學(xué)、細(xì)胞形態(tài)學(xué)、亞分子形態(tài)學(xué)的變化與改變，可以通過計算機成象系統(tǒng)顯示出它們的高清晰立體成象的，高質(zhì)量的連續(xù)斷層切片電鏡標(biāo)本。揭示傳染性海棉狀腦病-TSE致病傳染因子——PrPSc-朊病毒，嚴(yán)重?fù)p傷動物及人的中樞神經(jīng)系統(tǒng)綜合致病機制中所必不可少的某些種相關(guān)輔助致病因子、及相關(guān)輔助致病因子的致病機制。
本發(fā)明的目的是，提供一種揭示傳染性海棉狀腦病-TSE輔助致病因子的實驗與方法。通過系統(tǒng)的建立由TSE致病傳染因子——PrPSc所造成的，嚴(yán)重?fù)p傷腦中樞神經(jīng)組織、及腦中樞神經(jīng)元細(xì)胞的TSE模型，一定程度損傷脊髓中樞神經(jīng)組織、及脊髓中樞神經(jīng)元細(xì)胞的TSE模型，與僅輕微損傷或不損傷缺乏輔助致病因子的外周神經(jīng)組織、及某些種神經(jīng)元細(xì)胞和某些種非神經(jīng)細(xì)胞的對比NTSE模型；由增、減輔助致病因子的外加條件所造成的，能夠增強PrPSc損傷缺乏輔助致病因子的神經(jīng)元細(xì)胞和非神經(jīng)細(xì)胞的TSE模型、減輕PrPSc損傷中樞神經(jīng)元細(xì)胞的NTSE模型，與它們相應(yīng)的那些缺乏輔助致病因子的神經(jīng)元細(xì)胞和非神經(jīng)細(xì)胞、僅會受到PrPSc輕微損傷或不會受到損傷的對比NTSE模型；并制作能夠清楚顯示表達那些模型的組織形態(tài)學(xué)、細(xì)胞形態(tài)學(xué)、亞分子形態(tài)學(xué)的變化與改變，可以通過計算機成象系統(tǒng)顯示出它們的高清晰二維、三維圖象的，高質(zhì)量的連續(xù)斷層切片電鏡標(biāo)本。系統(tǒng)的對比分析由TSE致病傳染因子——PrPSc所造成的，那些TSE模型標(biāo)本與對比NTSE模型標(biāo)本的組織形態(tài)學(xué)、細(xì)胞組織形態(tài)學(xué)發(fā)生的變化與改變的不同；對比分析由增添含有輔助致病因子外加條件所造成的那些增強PrPSc損傷的TSE模型標(biāo)本，與它們相應(yīng)的那些缺乏輔助致病因子僅會受到PrPSc輕微損傷或不會受到損傷的對比NTSE模型標(biāo)本的，組織形態(tài)學(xué)、細(xì)胞組織形態(tài)學(xué)發(fā)生的變化與改變的不同。而能夠揭示出傳染性海棉狀腦病(TSE)致病傳染因子——PrPSc-朊病毒，嚴(yán)重?fù)p傷動物及人的中樞神經(jīng)系統(tǒng)綜合致病機制，與綜合致病機制中所必不可少的某些種相關(guān)輔助致病因子，及相關(guān)輔助致病因子的致病機制。使現(xiàn)代生命科學(xué)未來能夠通過認(rèn)識揭示PrPSc-朊病毒需要與某些必不可少的相關(guān)輔助致病因子協(xié)同，才能嚴(yán)重?fù)p傷動物及人的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的綜合分子致病機制，及它們的分子生物調(diào)控靶位，而尋找出可以有效抑制PrPSc-朊病毒嚴(yán)重?fù)p傷中樞神經(jīng)系統(tǒng)所必不可少的、相關(guān)輔助致病因子的分子生物損傷致病機制，進而才會尋找出可以有效抑制傳染性海棉狀腦病(TSE)的治療方法、及藥物！具體實施方式
為達到上述目的，實施本發(fā)明采用的方案準(zhǔn)備傳染性海棉狀腦病-TSE致病傳染因子——PrPSc。
PrPSc可取自于自然中存在的羊瘙癢病—Scrapie發(fā)病動物、瘋牛病-BSE發(fā)病動物、人克-雅氏病-CJD病人的TSE病變腦組織，可將其制作小塊或均勻漿或提取的PrPSc。
但是，最好還是要采用基因重組具有復(fù)制生物活性的PrPSc，因為腦組織中存在PrPSc輔助致病因子可能會對以下的TSE實驗造成干擾?？梢酝ㄟ^克隆羊瘙癢病-Scrapie、人克-雅氏病-CJD、瘋牛病-BSE的PrP表達基因，在原核或真核表達系統(tǒng)表達生產(chǎn)基因重組的羊、人、牛的，三維空間構(gòu)象正常的PrP朊蛋白——PrPc。應(yīng)用液相色譜法-HIC、IEC、SEC、AFC對表達系統(tǒng)表達生產(chǎn)的基因重組的蛋白及羊、人、牛的PrP朊蛋白——PrPc，實施復(fù)性提純、及改變它的蛋白分子三維空間構(gòu)象，獲得由人工改變出含有β-折疊三維構(gòu)象的基因重組的PrPSc。自1994年就有人首先利用AFC法，對基因重組的人朊病毒-rhPrion實施成功的復(fù)性——1.Sinha D，Bakhshi M，Vora R.Bio Techniques，1994，17509～514-2.Zahn R，Von Schroetter C，Wuthrich K.FEBS Lett，1997，417(3)400～404?！叭绻杷V固定相給變性蛋白提供過高的能量，變性蛋白可能折疊成某些自然中不存在，但構(gòu)象穩(wěn)定的折疊中間體——摘自于耿信篤，白泉用疏水色譜復(fù)性并同時純化蛋白質(zhì)的機理及其應(yīng)用；中國科學(xué)B輯，2002年10月等32卷第5期”。相關(guān)于能夠?qū)⒃嘶蛘婧吮磉_系統(tǒng)表達生產(chǎn)的基因重組蛋白實施復(fù)性提純的細(xì)節(jié)問題、與具體的科學(xué)方法，可向疏水色譜法HIC的發(fā)明人耿信篤等人直接請教、聯(lián)系。電話86-029-8303817，8302808；傳真86-029-8303817E-ailxdgeng@nwu.edu.cn。系統(tǒng)的建立由TSE致病傳染因子——PrPSc所造成的，嚴(yán)重?fù)p傷腦中樞神經(jīng)組織、及腦中樞神經(jīng)元細(xì)胞的TSE模型，一定程度損傷脊髓中樞神經(jīng)組織、及脊髓中樞神經(jīng)元細(xì)胞的TSE模型，與僅輕微損傷或不損傷缺乏輔助致病因子的外周神經(jīng)組織、及某些種神經(jīng)元細(xì)胞和某些種非神經(jīng)細(xì)胞的對比NTSE模型；由增、減輔助致病因子的外加條件所造成的，能夠增強PrPSc損傷缺乏輔助致病因子的神經(jīng)元細(xì)胞和非神經(jīng)細(xì)胞的TSE模型、減輕PrPSc損傷中樞神經(jīng)元細(xì)胞的NTSE模型，與它們相應(yīng)的那些缺乏輔助致病因子的神經(jīng)元細(xì)胞和非神經(jīng)細(xì)胞、僅會受到PrPSc輕微損傷或不會受到損傷的對比NTSE模型；并制作能夠清楚顯示表達那些模型的組織形態(tài)學(xué)、細(xì)胞形態(tài)學(xué)、亞分子形態(tài)學(xué)的變化與改變，可以通過計算機成象系統(tǒng)顯示出它們的高清晰二維、三維圖象的，高質(zhì)量的連續(xù)斷層切片電鏡標(biāo)本。
創(chuàng)造動物神經(jīng)組織TSE、NTSE對比模型及形態(tài)學(xué)標(biāo)本實驗1應(yīng)用目前已有的生物個體遺傳差異最小的近交系實驗大鼠品種，特別繁殖出，實驗需要用8只必須是同胎出生的同性鼠，能夠使所創(chuàng)造的各種不同的TSE實驗動物模型、與對照NTSE實驗動物模型的生物個體遺傳差異再近一步減小而可以忽略不計，每組需要有8只必須是同胎出生的同性鼠的，3組共24只同性近交系實驗大鼠；將分為1、2、3組，每組8只實驗大鼠分別編號1、2、3、4、5、6、7、8號。在每組實驗鼠生長到80天時，分別給每組的1~2號鼠的中腦中央灰質(zhì)、腰椎脊髓灰質(zhì)、頸上神經(jīng)結(jié)3個部位，應(yīng)用腦定位儀和微量注射器分別定位、定量接種，10ug基因重組具有復(fù)制生物活性的PrPSc、或動物TSE病變腦組提取的PrPSc；在每組實驗鼠生長到130天時，分別給每組的3~4號鼠的中腦中央灰質(zhì)、腰椎脊髓灰質(zhì)、頸上神經(jīng)結(jié)3個部位，應(yīng)用腦定位儀和微量注射器分別定位、定量接種，10ug基因重組具有復(fù)制生物活性的PrPSc、或動物TSE病變腦組提取的PrPSc；在每組實驗鼠生長到180天時，分別給每組的5~6號鼠的中腦中央灰質(zhì)、腰椎脊髓灰質(zhì)、頸上神經(jīng)結(jié)3個部位，應(yīng)用腦定位儀和微量注射器分別定位、定量接種，10ug基因重組具有復(fù)制生物活性的PrPSc、或動物TSE病變腦組提取的PrPSc；創(chuàng)造具有不同PrPSc感染發(fā)病期的TSE的實驗動物模型，每組的7~8號作沒有受到PrPSc感染具有正常命機制的對照NTSE實驗動物模型。在230天時，分別將24只實驗大鼠麻醉后固定，應(yīng)用4％多聚甲醛、0.2％戊二醛、0.2％苦味酸的0.1mol/L磷酸緩沖液(PB)400ml冷的4℃固定液實施活體灌注，速度10ml/mim、15mim后，分別取出每只實驗大鼠的完整的腦組織、脊髓定位接種點處半徑0.5cm的脊髓組織、頸上神經(jīng)結(jié)。把取出的第1、2組實驗鼠的神經(jīng)組織保存在上述不含戊二醛的4℃固定液中備用。把取出的第3組實驗鼠的6個TSE腦組織、6個TSE被接種處的脊髓組織、6個TSE頸上神經(jīng)結(jié)、2個NTSE腦組織、2個NTSE對照處的脊髓組織、2個NTSE頸上神經(jīng)結(jié)，分別制作出可以同時特異區(qū)分顯示出PrPc蛋白分子和PrPSc蛋白分子，在模型標(biāo)本的組織中、細(xì)胞中、亞分子細(xì)胞器中表達存在形態(tài)，能夠清楚顯示表達標(biāo)本的組織形態(tài)、細(xì)胞形態(tài)、亞分子形態(tài)的，高質(zhì)量的掃描電鏡連續(xù)斷層切片標(biāo)本。通過計算機圖像分析儀，利用這些能夠清楚顯示表達標(biāo)本的組織形態(tài)、細(xì)胞形態(tài)、亞分子形態(tài)，可以特異區(qū)分顯示出PrPc蛋白分子和PrPSc蛋白分子在模型標(biāo)本的組織中、細(xì)胞中、亞分子細(xì)胞器中的表達存在形態(tài)的，各種TSE模型標(biāo)本、與對照NTSE模型標(biāo)本的高質(zhì)量的掃描電鏡連續(xù)斷層切片的標(biāo)本圖像，做各種不同的二維或三維TSE綜合圖像對比形象定量分析，二維或三維TSE、NTSE綜合圖像對比形象定量分析，就可以顯示揭示實驗大鼠的腦中樞神經(jīng)組織被PrPSc接種感染以后，腦中樞神經(jīng)組織、腦中樞神經(jīng)元細(xì)胞、及它們的亞分子細(xì)胞器逐漸發(fā)生TSE病理損傷改變形態(tài)的變量，PrPc蛋白分子在逐漸發(fā)生TSE病理損傷的腦中樞神經(jīng)組織中、腦中樞神經(jīng)元細(xì)胞中、及它們的亞分子細(xì)胞器中的表達存在形態(tài)逐漸發(fā)生改變的變量，PrPSc蛋白分子在逐漸發(fā)生TSE病理損傷的腦中樞神經(jīng)組織中、腦中樞神經(jīng)元細(xì)胞中、及它們的亞分子細(xì)胞器中的表達存在形態(tài)逐漸發(fā)生改變的變量；顯示揭示實驗大鼠的脊髓中樞神經(jīng)組織被PrPSc接種感染以后，脊髓中樞神經(jīng)組織、脊髓樞神經(jīng)元細(xì)胞、及它們的亞分子細(xì)胞器逐漸發(fā)生TSE病理損傷改變形態(tài)的變量，PrPc蛋白分子在逐漸發(fā)生TSE病理損傷的脊髓中樞神經(jīng)組織中、脊髓中樞神經(jīng)元細(xì)胞中、及它們的亞分子細(xì)胞器中的表達存在形態(tài)逐漸發(fā)生改變的變量，PrPSc蛋白分子在逐漸發(fā)生TSE病理損傷的脊髓中樞神經(jīng)組織中、脊髓中樞神經(jīng)元細(xì)胞中、及它們的亞分子細(xì)胞器中的表達存在形態(tài)逐漸發(fā)生改變的變量；顯示揭示實驗大鼠的頸上神經(jīng)結(jié)組織被PrPSc接種感染以后，頸上神經(jīng)結(jié)組織、頸上神經(jīng)結(jié)神經(jīng)元細(xì)胞、及它們的亞分子細(xì)胞器逐漸發(fā)生TSE病理損傷改變形態(tài)的變量，PrPc蛋白分子在逐漸發(fā)生TSE病理損傷的頸上神經(jīng)結(jié)組織中、頸上神經(jīng)結(jié)神經(jīng)元細(xì)胞中、及它們的亞分子細(xì)胞器中的表達存在形態(tài)逐漸發(fā)生改變的變量，PrPSc蛋白分子在逐漸發(fā)生TSE病理損傷的頸上神經(jīng)結(jié)組織中、頸上神經(jīng)結(jié)神經(jīng)元細(xì)胞中、及它們的亞分子細(xì)胞器中的表達存在形態(tài)逐漸發(fā)生改變的變量。而能夠創(chuàng)造出一個，可以綜合顯示揭示傳染性海棉狀腦病-TSE嚴(yán)重?fù)p傷動物實驗大鼠腦中樞神經(jīng)系統(tǒng)、與腦中樞神經(jīng)元細(xì)胞所表達發(fā)生的病理變化與改變的微觀量變，與微觀量變發(fā)生過程-機制，致病傳染因子——PrPSc-朊病毒，嚴(yán)重?fù)p傷動物腦中樞神經(jīng)系統(tǒng)、與腦中樞神經(jīng)元細(xì)胞的綜合致病機制；一定程度損傷動物實驗大鼠脊髓中樞神經(jīng)系統(tǒng)、與脊髓中樞神經(jīng)元細(xì)胞所表達發(fā)生的病理變化與改變的微觀量變，與微觀量變發(fā)生過程-機制，致病傳染因子——PrPSc-朊病毒，一定程度損傷動物脊髓中樞神經(jīng)系統(tǒng)、與脊髓中樞神經(jīng)元細(xì)胞的綜合致病機制；僅輕微損傷動物實驗大鼠外神經(jīng)結(jié)組織、與外神經(jīng)結(jié)組織神經(jīng)元細(xì)胞所表達發(fā)生的病理變化與改變的微觀量變，與微觀量變發(fā)生過程-機制，致病傳染因子——PrPSc-朊病毒，輕微損傷動物外神經(jīng)結(jié)組織、與外神經(jīng)結(jié)組織神經(jīng)元細(xì)胞的綜合致病機制的；綜合TSE、NTSE實驗動物模型科學(xué)實驗平臺。
特別繁殖出實驗需要用8只必須是同胎出生的同性鼠，能夠使所創(chuàng)造的各種不同的TSE實驗動物模型、與對照NTSE實驗動物模型的生物個體遺傳差異再近一步減小而可以忽略不計的，8只必須是同胎出生的同性近交系實驗大鼠的方法在目前已有的生物個體遺傳差異最小的近交系實驗大鼠品種繁殖種群的，青年繁殖母鼠中特別選出若干只剛生育過3~5胎、頭胎產(chǎn)仔不少于10只、以后產(chǎn)仔不少于12只、6~9月齡母性好的青年繁殖母鼠。從1只9~12月齡健康的青年種雄鼠體中人工采取精液，應(yīng)用流式細(xì)胞儀、或免疫磁珠細(xì)胞分離技術(shù)，分選出精液中的X精子、或Y精子，對發(fā)情的青年繁殖母鼠實施人工授精；使人工授精的青年繁殖母鼠能夠產(chǎn)出10~14只同性鼠。母乳哺育仔鼠2周后，對仔鼠實施定時、定量人工母乳哺育2周后，初選出不同個體之間的體重差不超過3g的仔鼠；再實施定時、定量飼養(yǎng)到80天，選出8只不同個體之間的體重差不超過5g的同胎出生的同性鼠。
制作可以同時特異區(qū)分顯示出PrPc蛋白分子和PrPSc蛋白分子在模型標(biāo)本的組織中、細(xì)胞中、亞分子細(xì)胞器中表達存在形態(tài)，能夠清楚顯示表達標(biāo)本的組織形態(tài)、細(xì)胞形態(tài)、亞分子形態(tài)的高質(zhì)量的掃描電鏡連續(xù)斷層切片標(biāo)本的方法把取出的第3組實驗鼠的腦組織置于2％多聚甲醛、0.5％戊二醛、0.2％苦味酸、0.1mol/L磷酸緩沖液的4℃固定液中固定浸泡4~6h后，把取出的脊髓組織、神經(jīng)結(jié)組織置于上述固定液中固定浸泡1~2h后，用PBS液漂洗5次，每次20mim；分別對每一個神經(jīng)組織塊做震動切片厚20μm連續(xù)斷層切片、或應(yīng)用恒凍箱冷凍切片機做10μm連續(xù)斷層切片；將每個神經(jīng)組織的連續(xù)斷層切片分別編號；將組織切片放入15％甘油、20％蔗糖的PBS液中浸泡沉底后，用液氮速0.5~1mim后，用PBS液迅速回溫，再用PBS液漂洗5次，每次5mim后；用0.1/mol/L甘氨酸漂洗10mim，滅活自由醛基；用含有1％BSA的無鈣Dulbecco’sPBS液漂洗15mim，以阻斷對一抗的非特異結(jié)合；組織切片用適當(dāng)稀釋的、由10nm膠體金標(biāo)記的PrPc一抗4℃孵育24h后，再在室溫繼續(xù)孵育2h，用無鈣Dulbecco’sPBS液漂洗5次，每次5mim，以除去未結(jié)合的一抗；用含有1％BSA的無鈣Dulbecco’sPBS液漂洗15mim；用適當(dāng)稀釋的、由20nm膠體金標(biāo)記的PrPSc二抗4℃孵育24h后，再在室溫繼續(xù)孵育2h，用無鈣Dulbecco’sPBS液漂洗5次，每次5mim，以除去未結(jié)合的二抗；室溫下用2％多聚甲醛、2％戊二醛的4℃固定液中再固定1h；用0.1/mol/L二甲砷酸鈉緩沖液漂洗；可在暗房中再進行銀加強染色、亦可不做銀加強染色；置于1％鋨酸、0.1mol/L磷酸緩沖液的4℃固定液中固定2h后；浸泡于2％單寧酸、5％戊二醛中做導(dǎo)電處理2h；用4℃雙蒸餾水沖洗3次，每次1h；再用1％鋨酸4℃固定2h；做脫水處理。首先制作出可以同時特異區(qū)分顯示出PrPc蛋白分子和PrPSc蛋白分子在模型標(biāo)本的組織中、細(xì)胞中、亞分子細(xì)胞器中表達存在形態(tài)的，掃描電鏡連續(xù)斷層切片標(biāo)本；先用掃描電鏡對切片標(biāo)本做30000倍掃描放大圖像，并在計算機中儲存圖像。而后將切片標(biāo)本鍍膜制作出能夠清楚顯示表達標(biāo)本的組織形態(tài)、細(xì)胞形態(tài)、亞分子形態(tài)的高質(zhì)量的掃描電鏡連續(xù)斷層切片標(biāo)本；再用掃描電鏡對切片標(biāo)本做30000倍掃描放大圖像，并在計算機中儲存圖像。再將同一切片標(biāo)本的2種掃描放大電鏡圖像，用計算機圖像分析儀做綜合圖像分析、處理制作出那個切片標(biāo)本的，可以同時特異區(qū)分顯示出PrPc蛋白分子和PrPSc蛋白分子在模型標(biāo)本的組織中、細(xì)胞中、亞分子細(xì)胞器中表達存在形態(tài)，能夠清楚顯示表達標(biāo)本的組織形態(tài)、細(xì)胞形態(tài)、亞分子形態(tài)的，高質(zhì)量的掃描放大電鏡圖像。
由于本項實驗是應(yīng)用生物個體遺傳差異最小的近交系實驗大鼠品種特別繁殖出的8只同胎出生的同性鼠，創(chuàng)造揭示傳染性海棉狀腦病-TSE病理機制的綜合TSE、NTSE實驗動物模型科學(xué)實驗平臺，能夠使這個綜合科學(xué)實驗平臺中的所有TSE實驗動物模型、與對照NTSE實驗動物模型的生物個體遺傳差異再進一步減小，而可以忽略不計。因而能夠通過計算機圖像分析儀，對這個綜合TSE、NTSE實驗動物模型科學(xué)實驗平臺所獲得的，能夠清楚顯示表達各種TSE模型標(biāo)本、與對照NTSE模型標(biāo)本的組織形態(tài)、細(xì)胞形態(tài)、亞分子形態(tài)，可以特異區(qū)分顯示出PrPc蛋白分子和PrPSc蛋白分子在模型標(biāo)本的組織中、細(xì)胞中、亞分子細(xì)胞器中的表達存在形態(tài)的，高質(zhì)量的掃描電鏡連續(xù)斷層切片的標(biāo)本圖像，做各種不同的二維或三維TSE綜合圖像處理、對比形象定量分析，二維或三維TSE、NTSE綜合圖像處理、對比形象定量分析；顯示揭示傳染性海棉狀腦病-TSE的綜合病理機制，TSE傳染致病因子——PrPSc的綜合致病機制，與綜合致病機制中所必不可少的相關(guān)輔助致病因子、及相關(guān)輔助致病因子的致病機制。例如將具有不同PrPSc感染發(fā)病期的TSE的實驗動物模型、對照NTSE實驗動物模型的腦中組織相同部位切片標(biāo)本的高質(zhì)量的掃描放大電鏡圖像，用計算機圖像分析儀做各種不同的二維或三維TSE綜合圖像處理、對比形象定量分析，二維或三維TSE、NTSE綜合圖像處理、對比形象定量分析；能夠顯示揭示實驗大鼠的腦中樞神經(jīng)組織被PrPSc接種感染以后，腦中樞神經(jīng)組織、腦中樞神經(jīng)元細(xì)胞、及它們的亞分子細(xì)胞器逐漸發(fā)生TSE病理損傷改變形態(tài)的變量，它們的TSE病理損傷改變發(fā)生過程-機制；PrPc蛋白分子在逐漸發(fā)生TSE病理損傷的腦中樞神經(jīng)組織中、腦中樞神經(jīng)元細(xì)胞中、及它們的亞分子細(xì)胞器中的表達存在形態(tài)逐漸發(fā)生改變的變量，與調(diào)控它們的PrPc蛋白分子表達形態(tài)發(fā)生病理改變的過程-機制，及它的病理改變的過程-機制必須依賴某種或某些種能夠調(diào)控PrPc蛋白分子發(fā)生病理表達改變的輔助因子——即由腦中樞神經(jīng)細(xì)胞組織所表達分泌的、PrPSc綜合致病機制中所必不可少的輔助致病因子；PrPSc蛋白分子在逐漸發(fā)生TSE病理損傷的腦中樞神經(jīng)組織中、腦中樞神經(jīng)元細(xì)胞中、及它們的亞分子細(xì)胞器中的表達存在形態(tài)逐漸發(fā)生改變的變量，與PrPSc蛋白分子能夠趨向病變組織、細(xì)胞中濃縮沉積損傷病理改變的過程-機制，及它的病理改變的過程-機制必須依賴某種或某些種PrPSc濃縮沉積的趨化輔助因子、或結(jié)合載體蛋白輔助因子——即由腦中樞神經(jīng)細(xì)胞組織所表達分泌的、PrPSc綜合致病機制中所必不可少的輔助致病因子。應(yīng)用相同的方法能夠顯示揭示傳染性海棉狀腦病-TSE一定程度損傷動物實驗大鼠脊髓中樞神經(jīng)系統(tǒng)、與脊髓中樞神經(jīng)元細(xì)胞所表達發(fā)生的病理變化與改變的微觀量變，與微觀量變發(fā)生過程-機制，致病傳染因子——PrPSc-朊病毒，一定程度損傷動物脊髓中樞神經(jīng)系統(tǒng)、與脊髓中樞神經(jīng)元細(xì)胞的綜合致病機制；以及它與嚴(yán)重?fù)p傷動物實驗大鼠腦中樞神經(jīng)系統(tǒng)、與腦中樞神經(jīng)元細(xì)胞所表達發(fā)生的病理變化與改變的微觀量變，與微觀量變發(fā)生過程-機制的不同，和綜合致病機制的不同，是由在脊髓中樞神經(jīng)細(xì)胞組織中、不表達分泌PrPSc綜合致病機制中某些種輔助致病因子。應(yīng)用相同的方法能夠顯示揭示傳染性海棉狀腦病-TSE僅輕微損傷動物實驗大鼠外神經(jīng)結(jié)組織、與外神經(jīng)結(jié)組織神經(jīng)元細(xì)胞所表達發(fā)生的病理變化與改變的微觀量變，與微觀量變發(fā)生過程-機制，致病傳染因子——PrPSc-朊病毒，輕微損傷動物外神經(jīng)結(jié)組織、與外神經(jīng)結(jié)組織神經(jīng)元細(xì)胞的綜合致病機制；以及它與嚴(yán)重?fù)p傷動物實驗大鼠腦中樞神經(jīng)系統(tǒng)、與腦中樞神經(jīng)元細(xì)胞所表達發(fā)生的病理變化與改變的微觀量變，與微觀量變發(fā)生過程-機制的不同，和綜合致病機制的不同，是由在外神經(jīng)結(jié)細(xì)胞組織中、不表達分泌PrPSc綜合致病機制中某些種所必不可少起關(guān)鍵作用的輔助致病因子。
在目前已有的近交系實驗動物小鼠的品種中，能夠?qū)ふ业奖冉幌祵嶒灤笫笃贩N生物個體遺傳差異更小的近交系實驗小鼠品種；可以應(yīng)用近交系實驗動物小鼠的品種中，生物個體遺傳差異最小的近交系實驗動物小鼠品種，創(chuàng)造綜合TSE、NTSE實驗動物模型科學(xué)實驗平臺。應(yīng)用近交系實驗動物兔，繁殖出多只同胎出生的同性兔，創(chuàng)造綜合TSE、NTSE實驗動物模型科學(xué)實驗平臺，由于實驗兔的體型大于實驗大鼠10倍，而具有更好的操作性。傳染性海棉狀腦病-TSE羊瘙癢病-Scrapie的傳染致病因子——PrPSc，是引發(fā)瘋牛病-BSE的、再由瘋牛病-BSE傳染致病因子——PrPSc引發(fā)人類的克-雅氏病-CJD的傳染源。通過應(yīng)用羊創(chuàng)造綜合TSE、NTSE實驗動物模型科學(xué)實驗平臺，與應(yīng)用近交系實驗大鼠創(chuàng)造綜合TSE、NTSE實驗動物模型科學(xué)實驗平臺，近交系實驗小鼠創(chuàng)造綜合TSE、NTSE實驗動物模型科學(xué)實驗平臺，近交系實驗動物兔創(chuàng)造綜合TSE、NTSE實驗動物模型科學(xué)實驗平臺，綜合揭示多種不同物種哺乳動物的傳染性海棉狀腦病(TSE)嚴(yán)重?fù)p傷動物腦中樞神經(jīng)系統(tǒng)、與腦中樞神經(jīng)元細(xì)胞所表達發(fā)生的病理變化與改變的微觀量變，與微觀量變發(fā)生過程-機制，致病傳染因子——PrPSc-朊病毒，嚴(yán)重?fù)p傷動物腦中樞神經(jīng)系統(tǒng)、與腦中樞神經(jīng)元細(xì)胞的綜合致病機制；一定程度損傷動物脊髓中樞神經(jīng)系統(tǒng)、與脊髓中樞神經(jīng)元細(xì)胞所表達發(fā)生的病理變化與改變的微觀量變，與微觀量變發(fā)生過程-機制，致病傳染因子——PrPSc-朊病毒，一定程度損傷動物脊髓中樞神經(jīng)系統(tǒng)、與脊髓中樞神經(jīng)元細(xì)胞的綜合致病機制；僅輕微損傷動物外神經(jīng)結(jié)組織、與外神經(jīng)結(jié)組織神經(jīng)元細(xì)胞所表達發(fā)生的病理變化與改變的微觀量變，與微觀量變發(fā)生過程-機制，致病傳染因子——PrPSc-朊病毒，輕微損傷動物外神經(jīng)結(jié)組織、與外神經(jīng)結(jié)組織神經(jīng)元細(xì)胞的綜合致病機制；在不同哺乳動物物種間存在的相同性、相似性、相異性，具有重大科學(xué)研究意義。創(chuàng)造動物羊神經(jīng)組織TSE、NTSE對比模型及形態(tài)學(xué)標(biāo)本實驗2實驗應(yīng)用10只新出生的綿羊；最好是能夠應(yīng)用曾經(jīng)過長期自我封閉繁殖的小繁殖種群中，特別選出不同個體的形態(tài)性狀、與遺傳差異都盡可能相似的新生綿羊；分別編號1、2、3、4、5、6、7、8、9、10號。在新生羊出生后0~3天，分別給1~2號羊的中腦中央灰質(zhì)、腰椎脊髓灰質(zhì)、頸上神經(jīng)結(jié)3個部位，應(yīng)用微量注射器分別定位、定量接種，10ug基因重組具有復(fù)制生物活性的PrPSc、或動物TSE病變腦組提取的PrPSc；在新生綿羊生長到50天時，分別給3~4號羊的中腦中央灰質(zhì)、腰椎脊髓灰質(zhì)、頸上神經(jīng)結(jié)3個部位，應(yīng)用微量注射器分別定位、定量接種，10ug基因重組具有復(fù)制生物活性的PrPSc、或動物TSE病變腦組提取的PrPSc；在新生綿羊生長到100天時，分別給5~6號羊的中腦中央灰質(zhì)、腰椎脊髓灰質(zhì)、頸上神經(jīng)結(jié)3個部位，應(yīng)用微量注射器分別定位、定量接種，10ug基因重組具有復(fù)制生物活性的PrPSc、或動物TSE病變腦組提取的PrPSc；在新生綿羊生長到150天時，分別給7~8號羊的中腦中央灰質(zhì)、腰椎脊髓灰質(zhì)、頸上神經(jīng)結(jié)3個部位，應(yīng)用微量注射器分別定位、定量接種，10ug基因重組具有復(fù)制生物活性的PrPSc、或動物TSE病變腦組提取的PrPSc；創(chuàng)造具有不同PrPSc感染發(fā)病期的TSE的實驗動物模型，9~10號羊作沒有受到PrPSc感染具有正常命機制的對照NTSE實驗動物模型。在1~2號實驗羊中有一羊表現(xiàn)出病態(tài)時、或?qū)嶒炑蛏L到200天時；分別將10只實驗羊麻醉后固定，取出頸上神經(jīng)結(jié)置于4℃固定液中，應(yīng)用4％多聚甲醛、0.2％戊二醛、0.2％苦味酸的0.1mol/L磷酸緩沖液(PB)冷的4℃固定液，分別對中腦腦室、脊髓腔室內(nèi)實施活體灌注，速度10ml/mim、30mim后，分別取出每只實驗羊的中腦定位接種點處半徑1.5~2cm的腦組織、脊髓定位接種點處半徑1.5~2cm的脊髓組織。
將上述實驗羊的神經(jīng)組織分別制作出，可以同時特異區(qū)分顯示出PrPc蛋白分子和PrPSc蛋白分子，在模型標(biāo)本的組織中、細(xì)胞中、亞分子細(xì)胞器中表達存在形態(tài)，能夠清楚顯示表達標(biāo)本的組織形態(tài)、細(xì)胞形態(tài)、亞分子形態(tài)的，高質(zhì)量的掃描電鏡連續(xù)斷層切片標(biāo)本。通過用計算機圖像分析儀做各種不同的二維或三維TSE綜合圖像處理、對比形象定量分析，二維或三維TSE、NTSE綜合圖像處理、對比形象定量分析，創(chuàng)造出一個，可以綜合顯示揭示傳染性海棉狀腦病-TSE嚴(yán)重?fù)p傷動物實驗羊腦中樞神經(jīng)系統(tǒng)、與腦中樞神經(jīng)元細(xì)胞所表達發(fā)生的病理變化與改變的微觀量變，與微觀量變發(fā)生過程-機制，致病傳染因子——PrPSc-朊病毒，嚴(yán)重?fù)p傷動物腦中樞神經(jīng)系統(tǒng)、與腦中樞神經(jīng)元細(xì)胞的綜合致病機制；一定程度損傷動物實驗羊脊髓中樞神經(jīng)系統(tǒng)、與脊髓中樞神經(jīng)元細(xì)胞所表達發(fā)生的病理變化與改變的微觀量變，與微觀量變發(fā)生過程-機制，致病傳染因子——PrPSc-朊病毒，一定程度損傷動物脊髓中樞神經(jīng)系統(tǒng)、與脊髓中樞神經(jīng)元細(xì)胞的綜合致病機制；僅輕微損傷動物實驗羊外神經(jīng)結(jié)組織、與外神經(jīng)結(jié)組織神經(jīng)元細(xì)胞所表達發(fā)生的病理變化與改變的微觀量變，與微觀量變發(fā)生過程-機制，致病傳染因子——PrPSc-朊病毒，輕微損傷動物外神經(jīng)結(jié)組織、與外神經(jīng)結(jié)組織神經(jīng)元細(xì)胞的綜合致病機制的；綜合TSE、NTSE實驗動物模型科學(xué)實驗平臺的方法，完全類同于實驗1。
權(quán)利要求
1.一種揭示傳染性海棉狀腦病-TSE病理機制的實驗?zāi)Ｐ团c方法，其特征在于應(yīng)用傳染性海棉狀腦病-TSE致病傳染因子PrPSc(3)。接種多只近交系實驗動物(1)。的神經(jīng)組織(2)。創(chuàng)造具有不同神經(jīng)組織(2)。TSE病理改變的實驗動物模型；分別把TSE實驗動物模型的TSE病變神經(jīng)組織(2)。制作標(biāo)本，對比分析不同TSE神經(jīng)組織標(biāo)本形態(tài)的不同，揭示傳染性海棉狀腦病-TSE病理機制。
2.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的揭示傳染性海棉狀腦病-TSE病理機制的實驗?zāi)Ｐ团c方法，其特征在于多只近交系實驗動物(1)。是同胎出生的同性近交系實驗動物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的揭示傳染性海棉狀腦病-TSE病理機制的實驗?zāi)Ｐ团c方法，其特征在于多只近交系實驗動物(1)。是同胎出生的同性近交系實驗動物小鼠。
4.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的揭示傳染性海棉狀腦病-TSE病理機制的實驗?zāi)Ｐ团c方法，其特征在于多只近交系實驗動物(1)。是同胎出生的同性近交系實驗動物大鼠。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中所述的揭示傳染性海棉狀腦病-TSE病理機制的實驗?zāi)Ｐ团c方法，其特征在于神經(jīng)組織(2)。是動物的腦中樞神經(jīng)組織。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至4中所述的揭示傳染性海棉狀腦病-TSE病理機制的實驗?zāi)Ｐ团c方法，其特征在于神經(jīng)組織(2)。是動物的脊髓中樞神經(jīng)組織。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至4中所述的揭示傳染性海棉狀腦病-TSE病理機制的實驗?zāi)Ｐ团c方法，其特征在于神經(jīng)組織(2)。是動物的神經(jīng)結(jié)組織。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至7中所述的揭示傳染性海棉狀腦病-TSE病理機制的實驗?zāi)Ｐ团c方法，其特征在于傳染性海棉狀腦病-TSE致病傳染因子PrPSc(3)。是動物TSE病變腦組織。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至7中所述的揭示傳染性海棉狀腦病-TSE病理機制的實驗?zāi)Ｐ团c方法，其特征在于傳染性海棉狀腦病-TSE致病傳染因子PrPSc(3)。是由動物TSE病變腦組織中提取的PrPSc。
10.根據(jù)權(quán)利要求1至7中所述的揭示傳染性海棉狀腦病-TSE病理機制的實驗?zāi)Ｐ团c方法，其特征在于傳染性海棉狀腦病-TSE致病傳染因子PrPSc(3)。是基因重組PrPSc。
全文摘要
揭示傳染性海棉狀腦?。璗SE病理機制的實驗?zāi)Ｐ团c方法，涉及生命科學(xué)領(lǐng)域、及醫(yī)藥領(lǐng)域。提供了一個能夠系統(tǒng)的、逐步深入地揭示傳染性海棉狀腦?。璗SE致病因子PrP
文檔編號G09B23/00GK1529298SQ031544
公開日2004年9月15日 申請日期2003年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月29日
發(fā)明者葉新新 申請人:葉新新