專利名稱：揭示傳染性海棉狀腦病-tse輔助致病因子的實驗與方法
技術領域：
本發(fā)明涉及了一種揭示揭示傳染性海棉狀腦病-TSE輔助致病因子的實驗與方法。它涉及生命科學領域、及醫(yī)藥領域。
背景技術：
傳染性海棉狀腦病-TSE是一類可以侵襲多種不同物種動物及人類中樞神經(jīng)系統(tǒng)的退行性腦病，潛伏期長，具有100％致死率，并可在不同物種哺乳動物間傳播。自1730年首次報道羊瘙癢病以來，目前已經(jīng)在20多種哺乳動物動物及人類中發(fā)現(xiàn)了自然發(fā)生或感染的TSE，其中包括人類的克-雅氏病-CJD、羊瘙癢病-Scrapie、瘋牛病-BSE等。動物及人類傳染性海棉狀腦病-TSE典型病理學改變表現(xiàn)為，造成動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)腦組織出現(xiàn)海棉狀空泡變性，蛋白淀粉樣沉積、神經(jīng)元丟失與反應性膠質(zhì)增生。自美國科學家Prusiner在1992年，把能夠引發(fā)動物傳染性海棉狀腦病-TSE僅對被感染動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)造成嚴重病理損傷、對外周神經(jīng)系統(tǒng)及其它器官也有一定損傷的致病傳染因子確定為，一種不含核酸、具有自我復制能力的感染性蛋白顆?！狿rPSc-朊病毒以后，現(xiàn)代科學對傳染性海棉狀腦病-TSE進行了大量的相關科學研究。已經(jīng)揭示了傳染性海棉狀腦病-TSE的致病傳染因子，是由一種在人的細胞中和許多種哺乳動物的細胞中都存在的PrP基因正常表達的，蛋白分子三維空間構象含有40％α-螺旋沒有β折疊的正常PrP朊蛋白——PrPc所轉化出的，蛋白分子三維空間構象含有43％β-折疊的不正常PrP朊蛋白感染性蛋白顆粒——PrPSc朊病毒蛋白；因而使其獲得了能夠與細胞所表達的，蛋白分子三維空間構象含有40％α-螺旋沒有β折疊的正常PrP朊蛋白——PrPc相結合，再將PrPc復制為蛋白分子三維空間構象含有43％β-折疊的不正常PrP朊蛋白感染性蛋白顆粒——PrPSc朊病毒蛋白，造成動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)腦細胞組織出現(xiàn)海棉狀空泡變性，蛋白淀粉樣沉積、神經(jīng)元丟失與反應性膠質(zhì)增生的，超出了現(xiàn)代生命科學的傳統(tǒng)認識思維的朊病毒蛋白也能夠具有自我復制性、傳染性、致病性的特殊生物生命性質(zhì)。但是現(xiàn)代生命科學對感染性蛋白顆?！狿rPSc-朊病毒的致病機制、與相關輔助致病因子、及輔助致病因子的致病機制等許多相關細節(jié)問題仍然沒有搞清楚。
因而現(xiàn)代生命科學必須在針對傳染性海棉狀腦病-TSE致病傳染因子——PrPSc-朊病毒，嚴重損傷感染動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的綜合致病機制中所必不可少的各種相關輔助致病因子、與相關輔助致病因子的綜合致病機制的綜合基礎科學研究方面，及科學認識思維、科學方法取得具有開拓創(chuàng)新重大科學突破；需要從認識揭示傳染性海棉狀腦病-TSE致病傳染因子——PrPSc-朊病毒，嚴重損傷動物及人的中樞神經(jīng)系統(tǒng)綜合致病機制中所必不可少的各種相關輔助致病因子、及相關輔助致病因子的致病機制細節(jié)問題入手，進行系統(tǒng)的、深入細致的綜合生命科學研究，并取得科學突破，才能夠在PrPSc-朊病毒嚴重損傷動物及人的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的綜合致病機制的科學研究方面，取得科學突破。使現(xiàn)代生命科學未來能夠通過認識揭示PrPSc-朊病毒需要與某些必不可少的相關輔助致病因子協(xié)同、才能嚴重損傷動物及人的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的綜合分子致病機制，及它們的分子生物調(diào)控靶位，而尋找出可以有效抑制PrPSc-朊病毒嚴重損傷中樞神經(jīng)系統(tǒng)所必不可少的、相關輔助致病因子的分子生物損傷致病機制，進而才會尋找出可以有效抑制傳染性海棉狀腦病-TSE的治療方法、及藥物！

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明公開了一種揭示傳染性海棉狀腦病-TSE輔助致病因子的實驗與方法通過建立由TSE致病傳染因子——PrPSc所造成的，嚴重損傷腦中樞神經(jīng)組織、及腦中樞神經(jīng)元細胞的TSE模型，一定程度損傷脊髓中樞神經(jīng)組織、及脊髓中樞神經(jīng)元細胞的TSE模型，與僅輕微損傷或不損傷外周神經(jīng)組織、及某些種神經(jīng)元細胞和某些種非神經(jīng)細胞的對比NTSE模型；由增、減輔助致病因子的外加條件所造成的，能夠增強PrPSc損傷缺乏輔助致病因子的神經(jīng)元細胞和非神經(jīng)細胞的TSE模型、減輕PrPSc損傷中樞神經(jīng)元細胞的NTSE模型，與它們相應的那些缺乏輔助致病因子的神經(jīng)元細胞和非神經(jīng)細胞、僅會受到PrPSc輕微損傷或不會受到損傷的對比NTSE模型；并制作能夠清楚顯示表達那些模型的組織形態(tài)學、細胞形態(tài)學、亞分子形態(tài)學的變化與改變，可以通過計算機成象系統(tǒng)顯示出它們的高清晰立體成象的，高質(zhì)量的連續(xù)斷層切片電鏡標本。揭示傳染性海棉狀腦病-TSE致病傳染因子——PrPSc-朊病毒，嚴重損傷動物及人的中樞神經(jīng)系統(tǒng)綜合致病機制中所必不可少的某些種相關輔助致病因子、及相關輔助致病因子的致病機制。
本發(fā)明的目的是，提供一種揭示傳染性海棉狀腦病-TSE輔助致病因子的實驗與方法。通過系統(tǒng)的建立由TSE致病傳染因子——PrPSc所造成的，嚴重損傷腦中樞神經(jīng)組織、及腦中樞神經(jīng)元細胞的TSE模型，一定程度損傷脊髓中樞神經(jīng)組織、及脊髓中樞神經(jīng)元細胞的TSE模型，與僅輕微損傷或不損傷缺乏輔助致病因子的外周神經(jīng)組織、及某些種神經(jīng)元細胞和某些種非神經(jīng)細胞的對比NTSE模型；由增、減輔助致病因子的外加條件所造成的，能夠增強PrPSc損傷缺乏輔助致病因子的神經(jīng)元細胞和非神經(jīng)細胞的TSE模型、減輕PrPSc損傷中樞神經(jīng)元細胞的NTSE模型，與它們相應的那些缺乏輔助致病因子的神經(jīng)元細胞和非神經(jīng)細胞、僅會受到PrPSc輕微損傷或不會受到損傷的對比NTSE模型；并制作能夠清楚顯示表達那些模型的組織形態(tài)學、細胞形態(tài)學、亞分子形態(tài)學的變化與改變，可以通過計算機成象系統(tǒng)顯示出它們的高清晰二維、三維圖象的，高質(zhì)量的連續(xù)斷層切片電鏡標本。系統(tǒng)的對比分析由TSE致病傳染因子——PrPSc所造成的，那些TSE模型標本與對比NTSE模型標本的組織形態(tài)學、細胞組織形態(tài)學發(fā)生的變化與改變的不同；對比分析由增添含有輔助致病因子外加條件所造成的那些增強PrPSc損傷的TSE模型標本，與它們相應的那些缺乏輔助致病因子僅會受到PrPSc輕微損傷或不會受到損傷的對比NTSE模型標本的，組織形態(tài)學、細胞組織形態(tài)學發(fā)生的變化與改變的不同。而能夠揭示出傳染性海棉狀腦病(TSE)致病傳染因子——PrPSc-朊病毒，嚴重損傷動物及人的中樞神經(jīng)系統(tǒng)綜合致病機制，與綜合致病機制中所必不可少的某些種相關輔助致病因子，及相關輔助致病因子的致病機制。使現(xiàn)代生命科學未來能夠通過認識揭示PrPSc-朊病毒需要與某些必不可少的相關輔助致病因子協(xié)同，才能嚴重損傷動物及人的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的綜合分子致病機制，及它們的分子生物調(diào)控靶位，而尋找出可以有效抑制PrPSc-朊病毒嚴重損傷中樞神經(jīng)系統(tǒng)所必不可少的、相關輔助致病因子的分子生物損傷致病機制，進而才會尋找出可以有效抑制傳染性海棉狀腦病(TSE)的治療方法、及藥物！具體實施方式
為達到上述目的，實施本發(fā)明采用的方案準備傳染性海棉狀腦病-TSE致病傳染因子—PrPSc。
PrPSc可取自于自然中存在的羊瘙癢病-Scrapie發(fā)病動物、瘋牛病-BSE發(fā)病動物、人克-雅氏病-CJD病人的TSE病變腦組織，可將其制作小塊或均勻漿或提取的PrPSc。
但是，最好還是要采用基因重組具有復制生物活性的PrPSc，因為腦組織中存在PrPSc輔助致病因子可能會對以下的TSE實驗造成干擾。可以通過克隆羊瘙癢病-Scrapie、人克-雅氏病-CJD、瘋牛病-BSE的PrP表達基因，在原核或真核表達系統(tǒng)表達生產(chǎn)基因重組的羊、人、牛的，三維空間構象正常的PrP朊蛋白——PrPc。應用液相色譜法-HIC、IEC、SEC、AFC對表達系統(tǒng)表達生產(chǎn)的基因重組的蛋白及羊、人、牛的PrP朊蛋PrPc，實施復性提純、及改變它的蛋白分子三維空間構象，獲得由人工改變出含有β-折疊三維構象的基因重組的PrPSc。自1994年就有人首先利用AFC法，對基因重組的人朊病毒-rhPrion實施成功的復性——1.Sinha D，Bakhshi M，Vora R。Bio Techniques，1994，17509～514——2.Zahn R，Von Schroetter C，Wuthrich K。FEBS Lett，1997，417(3)400～404。“如果疏水色譜固定相給變性蛋白提供過高的能量，變性蛋白可能折疊成某些自然中不存在，但構象穩(wěn)定的折疊中間體——摘自于耿信篤，白泉用疏水色譜復性并同時純化蛋白質(zhì)的機理及其應用；中國科學B輯，2002年10月等32卷第5期”。相關于能夠?qū)⒃嘶蛘婧吮磉_系統(tǒng)表達生產(chǎn)的基因重組蛋白實施復性提純的細節(jié)問題、與具體的科學方法，可向疏水色譜法HIC的發(fā)明人耿信篤等人直接請教、聯(lián)系。電話86-029-8303817，8302808；傳真86-029-8303817E-ailxdgeng@nwu.edu.cn。系統(tǒng)的建立由TSE致病傳染因子——PrPSc所造成的，嚴重損傷腦中樞神經(jīng)組織、及腦中樞神經(jīng)元細胞的TSE模型，一定程度損傷脊髓中樞神經(jīng)組織、及脊髓中樞神經(jīng)元細胞的TSE模型，與僅輕微損傷或不損傷缺乏輔助致病因子的外周神經(jīng)組織、及某些種神經(jīng)元細胞和某些種非神經(jīng)細胞的對比NTSE模型；由增、減輔助致病因子的外加條件所造成的，能夠增強PrPSc損傷缺乏輔助致病因子的神經(jīng)元細胞和非神經(jīng)細胞的TSE模型、減輕PrPSc損傷中樞神經(jīng)元細胞的NTSE模型，與它們相應的那些缺乏輔助致病因子的神經(jīng)元細胞和非神經(jīng)細胞、僅會受到PrPSc輕微損傷或不會受到損傷的對比NTSE模型；并制作能夠清楚顯示表達那些模型的組織形態(tài)學、細胞形態(tài)學、亞分子形態(tài)學的變化與改變，可以通過計算機成象系統(tǒng)顯示出它們的高清晰二維、三維圖象的，高質(zhì)量的連續(xù)斷層切片電鏡標本。
創(chuàng)造培養(yǎng)神經(jīng)元細胞TSE、NTSE的對比模型及形態(tài)學標本實驗1應用胚胎發(fā)育12～15周的綿羊胚胎，分別取出羊胚胎的腦灰質(zhì)組織、脊髓灰質(zhì)組織、頸上神經(jīng)結。按照常規(guī)分離神經(jīng)元方法，分別分離3種不同神經(jīng)組織的各自的神經(jīng)元細胞。應用含有25％胎牛血清的Eagle MEM培養(yǎng)基補加胰島素5ug/ml、轉鐵蛋白50ug/ml、孕銅20nmol/L、腐胺100umol/L、亞矽酸鈉20nmol/L、KCI至30mmol/L、葡萄糖至30mmol/L的培養(yǎng)液，按照30000～40000個/cm2神經(jīng)元細胞，每周換液2次的常規(guī)神經(jīng)元細胞培養(yǎng)法，分別培養(yǎng)3種不同的神經(jīng)元細胞。培養(yǎng)成活后，再把基因重組具有復制生物活性的PrPSc、或動物TSE病變腦組織提取的PrPSc，接種在分別培養(yǎng)3種神經(jīng)元細胞的各自的培養(yǎng)器皿中。培養(yǎng)6～12周，待其中有1種培養(yǎng)的神經(jīng)元細胞發(fā)生培養(yǎng)死亡其數(shù)量剩余至30％時，全部停止培養(yǎng)。將培養(yǎng)的3種神經(jīng)元細胞，分別制作出可以同時特異區(qū)分顯示出PrPc蛋白分子和PrPSc蛋白分子，在模型標本的細胞中、亞分子細胞器中表達存在形態(tài)，能夠清楚顯示表達標本的細胞形態(tài)、亞分子形態(tài)的，高質(zhì)量的透射電鏡切片標本。
應用胚胎發(fā)育15～18天大鼠胚胎，分別取出鼠胚胎的腦灰質(zhì)組織、脊髓灰質(zhì)組織、頸上神經(jīng)結。按照常規(guī)分離神經(jīng)元方法，分別分離3種不同神經(jīng)組織的各自的神經(jīng)元細胞。應用含有25％胎牛血清的Eagle MEM培養(yǎng)基補加胰島素5ug/ml、轉鐵蛋白50ug/ml、孕銅20nmol/L、腐胺100umol/L、亞矽酸鈉20nmol/L、KCI至30mmol/L、葡萄糖至30mmol/L的培養(yǎng)液，按照30000～40000個/cm2神經(jīng)元細胞，每周換液2次的常規(guī)神經(jīng)元細胞培養(yǎng)法，分別培養(yǎng)3種不同的神經(jīng)元細胞。培養(yǎng)成活后，再把基因重組具有復制生物活性的PrPSc、或動物TSE病變腦組織提取的PrPSc，接種在分別培養(yǎng)3種神經(jīng)元細胞的各自的培養(yǎng)器皿中。培養(yǎng)6～12周，待其中有1種培養(yǎng)的神經(jīng)元細胞發(fā)生培養(yǎng)死亡其數(shù)量剩余至30％時，全部停止培養(yǎng)。將培養(yǎng)的3種神經(jīng)元細胞，分別制作出可以同時特異區(qū)分顯示出PrPc蛋白分子和PrPSc蛋白分子，在模型標本的細胞中、亞分子細胞器中表達存在形態(tài)，能夠清楚顯示表達標本的細胞形態(tài)、亞分子形態(tài)的，高質(zhì)量的透射電鏡切片標本。
應用胚胎發(fā)育20～24周的人胚胎，分別取出入胚胎的腦灰質(zhì)組織、脊髓灰質(zhì)組織、頸上神經(jīng)結。按照常規(guī)分離神經(jīng)元方法，分別分離3種不同神經(jīng)組織的各自的神經(jīng)元細胞。應用含有20％胎牛血清、10％人AB型血清的EagleMEM培養(yǎng)基補加胰島素5ug/ml、轉鐵蛋白50ug/ml、孕銅20nmol/L、腐胺100umol/L、亞矽酸鈉20nmol/L、KCI至30mmol/L、葡萄糖至30mmol/L的培養(yǎng)液，按照30000～40000個/cm2神經(jīng)元細胞，每周換液2次的常規(guī)神經(jīng)元細胞培養(yǎng)法，分別培養(yǎng)3種不同的人胚胎神經(jīng)元細胞。培養(yǎng)成活后，再把基因重組具有復制生物活性的PrPSc、或動物TSE病變腦組織提取的PrPSc，接種在分別培養(yǎng)3種神經(jīng)元細胞的各自的培養(yǎng)器皿中。培養(yǎng)6～12周，待其中有1種培養(yǎng)的神經(jīng)元細胞發(fā)生培養(yǎng)死亡其數(shù)量剩余至30％時，全部停止培養(yǎng)。將培養(yǎng)的3種神經(jīng)元細胞，分別制作出可以同時特異區(qū)分顯示出PrPc蛋白分子和PrPSc蛋白分子，在模型標本的細胞中、亞分子細胞器中表達存在形態(tài)，能夠清楚顯示表達標本的細胞形態(tài)、亞分子形態(tài)的，高質(zhì)量的透射電鏡切片標本。
制作可以同時特異區(qū)分顯示出PrPc蛋白分子和PrPSc蛋白分子在培養(yǎng)神經(jīng)元細胞模型標本的細胞中、亞分子細胞器中表達存在形態(tài)，能夠清楚顯示表達培養(yǎng)神經(jīng)元細胞標本的細胞形態(tài)、亞分子形態(tài)的高質(zhì)量的透射電鏡切片標本的方法把終止培養(yǎng)的神經(jīng)元細胞用0.1mol/L PBS液漂洗2次；置于2％多聚甲醛、0.5％戊二醛、0.2％苦味酸、0.1mol/L磷酸緩沖液的4℃固定液中固定浸泡1～3h后，用PBS液漂洗5次，每次20mim；把貼壁細胞刮下，置于2％明膠液懸浮，4000g離心，使其成為細胞團塊；置于2.3/mol/L蔗糖溶液中，進行防冰晶保護處理；置于液氮中冷凍后，在超薄切片機上做60～80nm切片，載于銅網(wǎng)上；用適當稀釋的、由10nm膠體金標記的PrPc一抗，與用適當稀釋的、由20nm膠體金標記的PrPSc二抗，分別進行免疫染色；再用1％從醋酸鈾復染5～10mim；于室溫或燈下干燥，表面可覆蓋一層甲基纖維素膜。對培養(yǎng)神經(jīng)元細胞標本做30000倍放大透射電鏡圖像，儲存在計算機中。
利用上述那些能夠清楚顯示表達由相同培養(yǎng)液培養(yǎng)的綿羊胚胎、大鼠胚胎、人胚胎的，被PrPSc感染損傷的腦灰質(zhì)組織神經(jīng)元細胞、脊髓灰質(zhì)組織神經(jīng)元細胞、頸上神經(jīng)結神經(jīng)元細胞，所表達具有的細胞形態(tài)、亞分子形態(tài)，與PrPc蛋白分子和PrPSc蛋白分子在那些培養(yǎng)神經(jīng)元細胞模型標本的細胞中、亞分子細胞器中的表達存在形態(tài)的，各種TSE培養(yǎng)神經(jīng)元細胞模型標本的高質(zhì)量的透射電鏡圖像；分別做1種動物胚胎的、3種不同的培養(yǎng)神經(jīng)元細胞TSE模型標本圖像對比分析，做3種不同動物胚胎的、3種相同培養(yǎng)神經(jīng)元細胞TSE模型標本圖像對比分析，就可以顯示揭示3種不同動物胚胎的腦中樞神經(jīng)元培養(yǎng)細胞被PrPSc感染以后，都會表達具有相似的較嚴重的TSE病理損傷的細胞形態(tài)、亞分子形態(tài)，與PrPc蛋白分子和PrPSc蛋白分子在那些培養(yǎng)神經(jīng)元細胞模型標本的細胞中、亞分子細胞器中具有相似的表達存在形態(tài)；3種不同動物胚胎的脊髓中樞神經(jīng)元培養(yǎng)細胞被PrPSc感染以后，都會表達具有相似的一定程度TSE病理損傷的細胞形態(tài)、亞分子形態(tài)，與PrPc蛋白分子和PrPSc蛋白分子在那些培養(yǎng)神經(jīng)元細胞模型標本的細胞中、亞分子細胞器中具有相似的表達存在形態(tài)；3種不同動物胚胎的外神經(jīng)結神經(jīng)元培養(yǎng)細胞被PrPSc感染以后，都會表達具有相似的輕微TSE病理損傷的細胞形態(tài)、亞分子形態(tài)，與PrPc蛋白分子和PrPSc蛋白分子在那些培養(yǎng)神經(jīng)元細胞模型標本的細胞中、亞分子細胞器中具有相似的表達存在形態(tài)；綿羊胚胎的3種不同的培養(yǎng)神經(jīng)元細胞被PrPSc感染以后，會分別表達出較嚴重損傷、一定程度損傷、輕微損傷，3種不同的TSE病理損傷的細胞形態(tài)、亞分子形態(tài)，與PrPc蛋白分子和PrPSc蛋白分子在那些培養(yǎng)神經(jīng)元細胞模型標本的細胞中、亞分子細胞器中具有不同的表達存在形態(tài)；大鼠胚胎的3種不同的培養(yǎng)神經(jīng)元細胞被PrPSc感染以后，會分別表達出較嚴重損傷、一定程度損傷、輕微損傷，3種不同的TSE病理損傷的細胞形態(tài)、亞分子形態(tài)，與PrPc蛋白分子和PrPSc蛋白分子在那些培養(yǎng)神經(jīng)元細胞模型標本的細胞中、亞分子細胞器中具有不同的表達存在形態(tài)；人胚胎的3種不同的培養(yǎng)神經(jīng)元細胞被PrPSc感染以后，會分別表達出較嚴重損傷、一定程度損傷、輕微損傷，3種不同的TSE病理損傷的細胞形態(tài)、亞分子形態(tài)，與PrPc蛋白分子和PrPSc蛋白分子在那些培養(yǎng)神經(jīng)元細胞模型標本的細胞中、亞分子細胞器中具有不同的表達存在形態(tài)。能夠創(chuàng)造出一個，顯示揭示傳染性海棉狀腦病(TSE)致病傳染因子——PrPSc-朊病毒，嚴重損傷動物腦中樞神經(jīng)系統(tǒng)、與腦中樞神經(jīng)元細胞，一定程度損傷動物脊髓中樞神經(jīng)系統(tǒng)、與脊髓中樞神經(jīng)元細胞，僅輕微損傷動物外神經(jīng)結組織、與外神經(jīng)結組織神經(jīng)元細胞，具有不同的綜合致病機制的；多種不同神經(jīng)組織神經(jīng)元培養(yǎng)細胞TSE模型綜合科學實驗平臺。能夠為進一步證實傳染性海棉狀腦病(TSE)致病傳染因子——PrPSc-朊病毒，嚴重損傷動物腦中樞神經(jīng)系統(tǒng)、與腦中樞神經(jīng)元細胞，一定程度損傷動物脊髓中樞神經(jīng)系統(tǒng)、與脊髓中樞神經(jīng)元細胞，僅輕微損傷動物實驗大鼠外神經(jīng)結組織、與外神經(jīng)結組織神經(jīng)元細胞，具有不同的綜合致病機制；是由于在腦中樞神經(jīng)元細胞中、表達分泌PrPSc綜合致病機制的某些種輔助致病因子，在脊髓中樞神經(jīng)元細胞中、不表達分泌PrPSc綜合致病機制的某些種輔助致病因子，外神經(jīng)結神經(jīng)元細胞中、不表達分泌PrPSc綜合致病機制的某些種必不可少的關鍵輔助致病因子，而提供相關科學依據(jù)。
創(chuàng)造培養(yǎng)神經(jīng)元細胞TSE、NTSE的對比模型及形態(tài)學標本實驗2應用胚胎發(fā)育12～15周的綿羊胚胎，取頸上神經(jīng)結，按照分離神經(jīng)元常規(guī)方法分離神經(jīng)元細胞。分為1、2、3組，1組應用含有25％胎牛血清的EagleMEM培養(yǎng)基補加胰島素5ug/ml、轉鐵蛋白50ug/ml、孕銅20nmol/L、腐胺100umol/L、亞矽酸鈉20nmol/L、KCI至30mmol/L、葡萄糖至30mmol/L的培養(yǎng)液，按照30000～40000個/cm2神經(jīng)元細胞，每周換液2次的常規(guī)神經(jīng)元細胞培養(yǎng)法培養(yǎng)；2組應用含有5％離乳小羊或小牛腦脊液與20％胎牛血清的EagleMEM培養(yǎng)基補加胰島素5ug/ml、轉鐵蛋白50ug/ml、孕銅20nmol/L、腐胺100umol/L、亞矽酸鈉20nmol/L、KCI至30mmol/L、葡萄糖至30mmol/L的培養(yǎng)液，按照30000～40000個/cm2神經(jīng)元細胞，每周換液2次的常規(guī)神經(jīng)元細胞培養(yǎng)法培養(yǎng)；3組應用含有10％離乳小羊或小牛腦組織提取液與20％胎牛血清的Eagle MEM培養(yǎng)基補加胰島素5ug/ml、轉鐵蛋白50ug/ml、孕銅20nmol/L、腐胺100umol/L、亞矽酸鈉20nmol/L、KCI至30mmol/L、葡萄糖至30mmol/L的培養(yǎng)液，按照30000～40000個/cm2神經(jīng)元細胞，每周換液2次的常規(guī)神經(jīng)元細胞培養(yǎng)法培養(yǎng)。培養(yǎng)成活后，再把基因重組具有復制生物活性的PrPSc、或動物TSE病變腦組織提取的PrPSc，分別接種在1、2、3組應用不同培養(yǎng)液培養(yǎng)的神經(jīng)元細胞各自的培養(yǎng)器皿中。培養(yǎng)6～12周，待其中有1組培養(yǎng)的神經(jīng)元細胞發(fā)生培養(yǎng)死亡其數(shù)量剩余至30％時，全部停止培養(yǎng)。將培養(yǎng)的1、2、3組神經(jīng)元細胞，分別制作出可以同時特異區(qū)分顯示出PrPc蛋白分子和PrPSc蛋白分子，在模型標本的細胞中、亞分子細胞器中表達存在形態(tài)，能夠清楚顯示表達標本的細胞形態(tài)、亞分子形態(tài)的，高質(zhì)量的透射電鏡切片標本。含有10％離乳小羊或小牛腦組織提取液的培養(yǎng)基的制取方法取110g離乳小羊或小牛腦組織在低于4℃的條件下，細細研磨制作成過200目的腦組織均勻漿，與1L配制好的Eagle MEM培養(yǎng)基混合，搖動5～10分鐘充分混合后，離心取上清液，再補加20％胎牛血清、胰島素5ug/ml、轉鐵蛋白50ug/ml、孕銅20nmol/L、腐胺100umol/L、亞矽酸鈉20nmol/L、KCI至30mmol/L、葡萄糖至30mmol/L。
應用胚胎發(fā)育15～18天大鼠胚胎，取頸上神經(jīng)結，按照分離神經(jīng)元常規(guī)方法分離神經(jīng)元細胞。分為1、2、3組，1組應用含有25％胎牛血清的Eagle MEM培養(yǎng)基補加胰島素5ug/ml、轉鐵蛋白50ug/ml、孕銅20nmol/L、腐胺100umol/L、亞矽酸鈉20nmol/L、KCI至30mmol/L、葡萄糖至30mmol/L的培養(yǎng)液，按照30000～40000個/cm2神經(jīng)元細胞，每周換液2次的常規(guī)神經(jīng)元細胞培養(yǎng)法培養(yǎng)；2組應用含有5％離乳小羊或小牛腦脊液與20％胎牛血清的EagleMEM培養(yǎng)基補加胰島素5ug/ml、轉鐵蛋白50ug/ml、孕銅20nmol/L、腐胺100umol/L、亞矽酸鈉20nmol/L、KCI至30mmol/L、葡萄糖至30mmol/L的培養(yǎng)液，按照30000～40000個/cm2神經(jīng)元細胞，每周換液2次的常規(guī)神經(jīng)元細胞培養(yǎng)法培養(yǎng)；3組應用含有10％離乳小羊或小牛腦組織提取液與10~20％胎牛血清的Eagle MEM培養(yǎng)基補加胰島素5ug/ml、轉鐵蛋白50ug/ml、孕銅20nmol/L、腐胺100umol/L、亞矽酸鈉20nmol/L、KCI至30mmol/L、葡萄糖至30mmol/L的培養(yǎng)液，按照30000～40000個/cm2神經(jīng)元細胞，每周換液2次的常規(guī)神經(jīng)元細胞培養(yǎng)法培養(yǎng)。培養(yǎng)成活后，再把基因重組具有復制生物活性的PrPSc、或動物TSE病變腦組織提取的PrPSc，分別接種在1、2、3組應用不同培養(yǎng)液培養(yǎng)的神經(jīng)元細胞各自的培養(yǎng)器皿中。培養(yǎng)6～12周，待其中有1組培養(yǎng)的神經(jīng)元細胞發(fā)生培養(yǎng)死亡其數(shù)量剩余至30％時，全部停止培養(yǎng)。將培養(yǎng)的1、2、3組神經(jīng)元細胞，分別制作出可以同時特異區(qū)分顯示出PrPc蛋白分子和PrPSc蛋白分子，在模型標本的細胞中、亞分子細胞器中表達存在形態(tài)，能夠清楚顯示表達標本的細胞形態(tài)、亞分子形態(tài)的，高質(zhì)量的透射電鏡切片標本。含有10％離乳小羊或小牛腦組織提取液的培養(yǎng)基的制取方法取110g離乳小羊或小牛腦組織在低于4℃的條件下，細細研磨制作成過200目的腦組織均勻漿，與1L配制好的Eagle MEM培養(yǎng)基混合，搖動5～10分鐘充分混合后，離心取上清液，再補加20％胎牛血清、胰島素5ug/ml、轉鐵蛋白50ug/ml、孕銅20nmol/L、腐胺100umol/L、亞矽酸鈉20nmol/L、KCI至30mmol/L、葡萄糖至30mmol/L。
應用胚胎發(fā)育20～24周的人胚胎，取出頸上神經(jīng)結，按照分離神經(jīng)元常規(guī)方法分離神經(jīng)元細胞。分為1、2、3組，1組應用含有20％胎牛血清、5％人AB型血清的Eagle MEM培養(yǎng)基補加胰島素5ug/ml、轉鐵蛋白50ug/ml、孕銅20nmol/L、腐胺100umol/L、亞矽酸鈉20nmol/L、KCI至30mmol/L、葡萄糖至30mmol/L的培養(yǎng)液，按照30000~40000個/cm2神經(jīng)元細胞，每周換液2次的常規(guī)神經(jīng)元細胞培養(yǎng)法培養(yǎng)；2組應用含有5％離乳小羊或小牛腦脊液、5％人AB型血清、與15％胎牛血清的Eagle MEM培養(yǎng)基補加胰島素5ug/ml、轉鐵蛋白50ug/ml、孕銅20nmol/L、腐胺100umol/L、亞矽酸鈉20nmol/L、KCI至30mmol/L、葡萄糖至30mmol/L的培養(yǎng)液，按照30000～40000個/cm2神經(jīng)元細胞，每周換液2次的常規(guī)神經(jīng)元細胞培養(yǎng)法培養(yǎng)；3組應用含有10％離乳小羊或小牛腦組織提取液、5％人AB型血清、與15％胎牛血清的Eagle MEM培養(yǎng)基補加胰島素5ug/ml、轉鐵蛋白50ug/ml、孕銅20nmol/L、腐胺100umol/L、亞矽酸鈉20nmol/L、KCI至30mmol/L、葡萄糖至30mmol/L的培養(yǎng)液，按照30000～40000個/cm2神經(jīng)元細胞，每周換液2次的常規(guī)神經(jīng)元細胞培養(yǎng)法培養(yǎng)。培養(yǎng)成活后，再把基因重組具有復制生物活性的PrPSc、或動物TSE病變腦組織提取的PrPSc，分別接種在1、2、3組應用不同培養(yǎng)液培養(yǎng)的神經(jīng)元細胞各自的培養(yǎng)器皿中。培養(yǎng)6～12周，待其中有1組培養(yǎng)的神經(jīng)元細胞發(fā)生培養(yǎng)死亡其數(shù)量剩余至30％時，全部停止培養(yǎng)。將培養(yǎng)的1、2、3組神經(jīng)元細胞，分別制作出可以同時特異區(qū)分顯示出PrPc蛋白分子和PrPSc蛋白分子，在模型標本的細胞中、亞分子細胞器中表達存在形態(tài)，能夠清楚顯示表達標本的細胞形態(tài)、亞分子形態(tài)的，高質(zhì)量的透射電鏡切片標本。含有10％離乳小羊或小牛腦組織提取液的培養(yǎng)基的制取方法取110g離乳小羊或小牛腦組織在低于4℃的條件下，細細研磨制作成過200目的腦組織均勻漿，與1L配制好的EagleMEM培養(yǎng)基混合，搖動5～10分鐘充分混合后，離心取上清液，再補加5％人AB型血清、15％胎牛血清、胰島素5ug/ml、轉鐵蛋白50ug/ml、孕銅20nmol/L、腐胺100umol/L、亞矽酸鈉20nmol/L、KCI至30mmol/L、葡萄糖至30mmol。
制作高質(zhì)量的透射電鏡切片標本的方法同實驗1。
利用上述那些能夠清楚顯示表達由3種不同培養(yǎng)液分別培養(yǎng)的綿羊胚胎、大鼠胚胎、人胚胎的，被PrPSc感染損傷的頸上神經(jīng)結神經(jīng)元細胞，所表達具有的細胞形態(tài)、亞分子形態(tài)，與PrPc蛋白分子和PrPSc蛋白分子在那些培養(yǎng)神經(jīng)元細胞模型標本的細胞中、亞分子細胞器中的表達存在形態(tài)的，各種TSE培養(yǎng)神經(jīng)元細胞模型標本的高質(zhì)量的透射電鏡圖像分別做由3種不同培養(yǎng)液分別培養(yǎng)1種動物胚胎的外神經(jīng)元細胞的、3種培養(yǎng)外神經(jīng)元細胞TSE模型標本圖像對比分析，做由1種相同培養(yǎng)液培養(yǎng)3種不同動物胚胎的相同外神經(jīng)元細胞的、3種培養(yǎng)外神經(jīng)元細胞TSE模型標本圖像對比分析，就可以顯示揭示由普通培養(yǎng)液培養(yǎng)的，3種不同動物胚胎的相同外神經(jīng)元細胞被PrPSc感染以后，3種不同動物的外神經(jīng)元培養(yǎng)細胞都會表達具有相似的，僅受到輕微TSE病理損傷的細胞形態(tài)、亞分子形態(tài)，與PrPc蛋白分子和PrPSc蛋白分子在那些培養(yǎng)神經(jīng)元細胞模型標本的細胞中、亞分子細胞器中具有相似的表達存在形態(tài)；由含有腦脊液的培養(yǎng)液培養(yǎng)的，3種不同動物胚胎的相同外神經(jīng)元細胞被PrPSc感染以后，3種不同動物的外神經(jīng)元培養(yǎng)細胞都會表達具有相似的，受到一定程度TSE病理損傷的細胞形態(tài)、亞分子形態(tài)，與PrPc蛋白分子和PrPSc蛋白分子在那些培養(yǎng)神經(jīng)元細胞模型標本的細胞中、亞分子細胞器中具有相似的表達存在形態(tài)；由含有腦組織提取液的培養(yǎng)液培養(yǎng)的，3種不同動物胚胎的相同外神經(jīng)元細胞被PrPSc感染以后，3種不同動物的外神經(jīng)元培養(yǎng)細胞都會表達具有相似的，受到較嚴重TSE病理損傷的細胞形態(tài)、亞分子形態(tài)，與PrPc蛋白分子和PrPSc蛋白分子在那些培養(yǎng)神經(jīng)元細胞模型標本的細胞中、亞分子細胞器中具有相似的表達存在形態(tài)；由3種不同培養(yǎng)液分別培養(yǎng)1種動物胚胎的外神經(jīng)元細胞被PrPSc感染以后，那種動物的外神經(jīng)元培養(yǎng)細胞會分別表達出僅受到輕微損傷、一定程度損傷、較嚴重損傷，3種不同的TSE病理損傷的細胞形態(tài)、亞分子形態(tài)，與PrPc蛋白分子和PrPSc蛋白分子在那些培養(yǎng)神經(jīng)元細胞模型標本的細胞中、亞分子細胞器中具有3種不同的表達存在形態(tài)。表明動物的外神經(jīng)結細胞組織、及神經(jīng)元細胞，由于缺乏表達分泌PrPSc綜合致病機制的某些種必不可少的關鍵輔助致病因子，而僅會受到TSE致病傳染因子——PrPSc的輕微損傷；動物的腦中樞細胞組織、及神經(jīng)元細胞，由于能夠表達分泌PrPSc綜合致病機制必不可少的所有輔助致病因子，而會受到TSE致病傳染因子——PrPSc的嚴重損傷；動物的脊髓中樞細胞組織、及神經(jīng)元細胞，由于缺乏表達分泌PrPSc綜合致病機制的某些種輔助致病因子，及由于在腦脊液中缺乏由腦中樞細胞組織是以細胞接觸分泌表達型式所表達的、PrPSc綜合致病機制的某些種輔助致病因子，而會受到TSE致病傳染因子——PrPSc的一定程度損傷創(chuàng)。能夠造出一個，顯示揭示傳染性海棉狀腦病-TSE致病傳染因子——PrPSc-朊病毒，嚴重損傷動物腦中樞神經(jīng)系統(tǒng)、與腦中樞神經(jīng)元細胞，一定程度損傷動物脊髓中樞神經(jīng)系統(tǒng)、與脊髓中樞神經(jīng)元細胞，僅輕微損傷動物外神經(jīng)結組織、與外神經(jīng)結組織神經(jīng)元細胞，具有不同的綜合致病機制的；多種不同神經(jīng)組織神經(jīng)元培養(yǎng)細胞TSE模型綜合科學實驗平臺。能夠為進一步證實傳染性海棉狀腦病-TSE致病傳染因子——PrPSc-朊病毒，嚴重損傷動物腦中樞神經(jīng)系統(tǒng)、與腦中樞神經(jīng)元細胞，一定程度損傷動物脊髓中樞神經(jīng)系統(tǒng)、與脊髓中樞神經(jīng)元細胞，僅輕微損傷動物實驗大鼠外神經(jīng)結組織、與外神經(jīng)結組織神經(jīng)元細胞，具有不同的綜合致病機制；是由于在腦中樞神經(jīng)細胞組織中、表達分泌PrPSc綜合致病機制的所有輔助致病因子，在脊髓中樞神經(jīng)細胞組織中、不表達分泌PrPSc綜合致病機制的某些種輔助致病因子，外神經(jīng)結神經(jīng)細胞組織中、不表達分泌PrPSc綜合致病機制的某些種必不可少的關鍵輔助致病因子，而提供足夠充分的科學依據(jù)。
創(chuàng)造培養(yǎng)神經(jīng)元細胞TSE、NTSE的對比模型及形態(tài)學標本實驗3應用胚胎發(fā)育15～18天大鼠胚胎，取頸上神經(jīng)結，按照分離神經(jīng)元常規(guī)方法分離神經(jīng)元細胞。分為1、2、3、4、5組，1組應用含有25％胎牛血清的Eagle MEM培養(yǎng)基補加胰島素5ug/ml、轉鐵蛋白50ug/ml、孕銅20nmol/L、腐胺100umol/L、亞矽酸鈉20nmol/L、KCI至30mmol/L、葡萄糖至30mmol/L的培養(yǎng)液，按照30000～40000個/cm2神經(jīng)元細胞，每周換液2次的常規(guī)神經(jīng)元細胞培養(yǎng)法培養(yǎng)；2組應用含有5％已應用層析技術濾除了大于7.4PH范圍所有細胞因子的、離乳小羊或小牛腦脊液與20％胎牛血清的Eagle MEM培養(yǎng)基補加胰島素5ug/ml、轉鐵蛋白50ug/ml、孕銅20nmol/L、腐胺100umol/L、亞矽酸鈉20nmol/L、KCI至30mmol/L、葡萄糖至30mmol/L的培養(yǎng)液，按照30000～40000個/cm2神經(jīng)元細胞，每周換液2次的常規(guī)神經(jīng)元細胞培養(yǎng)法培養(yǎng)；3組應用含有5％已應用層析技術濾除了小于7.4PH范圍所有細胞因子的、離乳小羊或小牛腦脊液與20％胎牛血清的Eagle MEM培養(yǎng)基補加胰島素5ug/ml、轉鐵蛋白50ug/ml、孕銅20nmol/L、腐胺100umol/L、亞矽酸鈉20nmol/L、KCI至30mmol/L、葡萄糖至30mmol/L的培養(yǎng)液，按照30000～40000個/cm2神經(jīng)元細胞，每周換液2次的常規(guī)神經(jīng)元細胞培養(yǎng)法培養(yǎng)；4組應用含有10％已應用層析技術濾除了大于7.4PH范圍所有細胞因子的、離乳小羊或小牛腦組織提取液與20％胎牛血清的Eagle MEM培養(yǎng)基補加胰島素5ug/ml、轉鐵蛋白50ug/ml、孕銅20nmol/L、腐胺100umol/L、亞矽酸鈉20nmol/L、KCI至30mmol/L、葡萄糖至30mmol/L的培養(yǎng)液，按照30000～40000個/cm2神經(jīng)元細胞，每周換液2次的常規(guī)神經(jīng)元細胞培養(yǎng)法培養(yǎng)；5組應用含有10％已應用層析技術濾除了小于7.4PH范圍所有細胞因子的、離乳小羊或小牛腦組織提取液與20％胎牛血清的Eagle MEM培養(yǎng)基補加胰島素5ug/ml、轉鐵蛋白50ug/ml、孕銅20nmol/L、腐胺100umol/L、亞矽酸鈉20nmol/L、KCI至30mmol/L、葡萄糖至30mmol/L的培養(yǎng)液，按照30000～40000個/cm2神經(jīng)元細胞，每周換液2次的常規(guī)神經(jīng)元細胞培養(yǎng)法培養(yǎng)。培養(yǎng)成活后，再把基因重組具有復制生物活性的PrPSc、或動物TSE病變腦組織提取的PrPSc，分別接種在1、2、3、4、5組應用不同培養(yǎng)液培養(yǎng)的神經(jīng)元細胞各自的培養(yǎng)器皿中。培養(yǎng)6～12周，待其中有1組培養(yǎng)的神經(jīng)元細胞發(fā)生培養(yǎng)死亡其數(shù)量剩余至30％時，全部停止培養(yǎng)。將培養(yǎng)的1、2、3、4、5組神經(jīng)元細胞，分別制作出可以同時特異區(qū)分顯示出PrPc蛋白分子和PrPSc蛋白分子，在模型標本的細胞中、亞分子細胞器中表達存在形態(tài)，能夠清楚顯示表達標本的細胞形態(tài)、亞分子形態(tài)的，高質(zhì)量的透射電鏡切片標本。
應用鼠神經(jīng)瘤細胞-ScN2a。分為1、2、3、4、5組，1組應用含有25％胎牛血清的Eagle MEM培養(yǎng)基補加胰島素5ug/ml、轉鐵蛋白50ug/ml、孕銅20nmol/L、腐胺100umol/L、亞矽酸鈉20nmol/L、KCI至30mmol/L、葡萄糖至30mmol/L的培養(yǎng)液，按照30000～40000個/cm2神經(jīng)元細胞，每周換液2次的常規(guī)神經(jīng)元細胞培養(yǎng)法培養(yǎng)；2組應用含有5％已應用層析技術濾除了大于7.4PH范圍所有細胞因子的、離乳小羊或小牛腦脊液與20％胎牛血清的EagleMEM培養(yǎng)基補加胰島素5ug/ml、轉鐵蛋白50ug/ml、孕銅20nmol/L、腐胺100umol/L、亞矽酸鈉20nmol/L、KCI至30mmol/L、葡萄糖至30mmol/L的培養(yǎng)液，按照30000～40000個/cm2神經(jīng)元細胞，每周換液2次的常規(guī)神經(jīng)元細胞培養(yǎng)法培養(yǎng)；3組應用含有5％已應用層析技術濾除了小于7.4PH范圍所有細胞因子的、離乳小羊或小牛腦脊液與20％胎牛血清的Eagle MEM培養(yǎng)基補加胰島素5ug/ml、轉鐵蛋白50ug/ml、孕銅20nmol/L、腐胺100umol/L、亞矽酸鈉20nmol/L、KCI至30mmol/L、葡萄糖至30mmol/L的培養(yǎng)液，按照30000～40000個/cm2神經(jīng)元細胞，每周換液2次的常規(guī)神經(jīng)元細胞培養(yǎng)法培養(yǎng)；4組應用含有10％％已應用層析技術濾除了大于7.4PH范圍所有細胞因子的、離乳小羊或小牛腦組織提取液與20％胎牛血清的Eagle MEM培養(yǎng)基補加胰島素5ug/ml、轉鐵蛋白50ug/ml、孕銅20nmol/L、腐胺100umol/L、亞矽酸鈉20nmol/L、KCI至30mmol/L、葡萄糖至30mmol/L的培養(yǎng)液，按照30000～40000個/cm2神經(jīng)元細胞，每周換液2次的常規(guī)神經(jīng)元細胞培養(yǎng)法培養(yǎng)；5組應用含有10％已應用層析技術濾除了小于7.4PH范圍所有細胞因子的、離乳小羊或小牛腦組織提取液與20％胎牛血清的Eagle MEM培養(yǎng)基補加胰島素5ug/ml、轉鐵蛋白50ug/ml、孕銅20nmol/L、腐胺100umol/L、亞矽酸鈉20nmol/L、KCI至30mmol/L、葡萄糖至30mmol/L的培養(yǎng)液，按照30000～40000個/cm2神經(jīng)元細胞，每周換液2次的常規(guī)神經(jīng)元細胞培養(yǎng)法培養(yǎng)。培養(yǎng)成活后，再把基因重組具有復制生物活性的PrPSc、或動物TSE病變腦組織提取的PrPSc，分別接種在1、2、3、4、5組應用不同培養(yǎng)液培養(yǎng)的鼠神經(jīng)瘤細胞-ScN2a各自的培養(yǎng)器皿中。培養(yǎng)6～8周，全部停止培養(yǎng)。將培養(yǎng)的1、2、3、4、5組鼠神經(jīng)瘤細胞-ScN2a，分別制作出可以同時特異區(qū)分顯示出PrPc蛋白分子和PrPSc蛋白分子，在模型標本的細胞中、亞分子細胞器中表達存在形態(tài)，能夠清楚顯示表達標本的細胞形態(tài)、亞分子形態(tài)的，高質(zhì)量的透射電鏡切片標本。
制作高質(zhì)量的透射電鏡切片標本的方法同實驗1。
第2組含有5％離乳小羊或小牛腦脊液的培養(yǎng)基的制取方法取100g離乳小羊或小牛腦脊液與2L配制好的Eagle MEM培養(yǎng)基混合，應用7.4～14PH范圍的離子交換樹脂層析柱，濾除大于7.4PH范圍所有細胞因子；取1L濾后液再補加20％胎牛血清、胰島素5ug/ml、轉鐵蛋白50ug/ml、孕銅20nmol/L、腐胺100umol/L、亞矽酸鈉20nmol/L、KCI至30mmol/L、葡萄糖至30mmol/L。
第3組含有5％離乳小羊或小牛腦脊液的培養(yǎng)基的制取方法取100g離乳小羊或小牛腦脊液與2L配制好的Eagle MEM培養(yǎng)基混合，應用1～7.4PH范圍的離子交換樹脂層析柱，濾除小于7.4PH范圍所有細胞因子；取1L濾后液再補加20％胎牛血清、胰島素5ug/ml、轉鐵蛋白50ug/ml、孕銅20nmol/L、腐胺100umol/L、亞矽酸鈉20nmol/L、KCI至30mmol/L、葡萄糖至30mmol/L。
第4組含有10％離乳小羊或小牛腦組織提取液的培養(yǎng)基的制取方法取200g離乳小羊或小牛腦組織在低于4℃的條件下，細細研磨制作成過200目的腦組織均勻漿，與2L配制好的Eagle MEM培養(yǎng)基混合，搖動5～10分鐘充分混合后，離心取上清液；應用7.4～14PH范圍的離子交換樹脂層析柱，濾除大于7.4PH范圍所有細胞因子；取1L濾后液再補加20％胎牛血清、胰島素5ug/ml、轉鐵蛋白50ug/ml、孕銅20nmol/L、腐胺100umol/L、亞矽酸鈉20nmol/L、KCI至30mmol/L、葡萄糖至30mmol/L。
第5組含有10％離乳小羊或小牛腦組織提取液的培養(yǎng)基的制取方法取200g離乳小羊或小牛腦組織在低于4℃的條件下，細細研磨制作成過200目的腦組織均勻漿，與2L配制好的Eagle MEM培養(yǎng)基混合，搖動5～10分鐘充分混合后，離心取上清液，應用1～7.4PH范圍的離子交換樹脂層析柱，濾除小于7.4PH范圍所有細胞因子；取1L濾后液再補加20％胎牛血清、胰島素5ug/ml、轉鐵蛋白50ug/ml、孕銅20nmol/L、腐胺100umol/L、亞矽酸鈉20nmol/L、KCI至30mmol/L、葡萄糖至30mmol/L。
利用上述那些能夠清楚顯示表達由5種不同培養(yǎng)液分別培養(yǎng)的大鼠胚胎頸上神經(jīng)結神經(jīng)元細胞、鼠神經(jīng)瘤細胞-ScN2a，所表達具有的細胞形態(tài)、亞分子形態(tài)，與PrPc蛋白分子和PrPSc蛋白分子在那些培養(yǎng)細胞模型標本的細胞中、亞分子細胞器中的表達存在形態(tài)的，各種TSE培養(yǎng)細胞模型標本的高質(zhì)量的透射電鏡圖像；分別做由5種不同培養(yǎng)液分別培養(yǎng)大鼠胚胎外神經(jīng)元細胞的、5種培養(yǎng)外神經(jīng)元細胞TSE模型標本圖像對比分析，做由5種不同培養(yǎng)液分別培養(yǎng)鼠神經(jīng)瘤細胞-ScN2a的、5種鼠神經(jīng)瘤細胞-ScN2a培養(yǎng)細胞TSE模型標本圖像對比分析，就可以顯示揭示由第1組普通培養(yǎng)液培養(yǎng)的，大鼠胚胎外神經(jīng)元細胞、鼠神經(jīng)瘤細胞-ScN2a被PrPSc感染以后，2種不同動物培養(yǎng)細胞都會表達具有相似的，僅受到輕微TSE病理損傷的細胞形態(tài)、亞分子形態(tài)，與PrPc蛋白分子和PrPSc蛋白分子在2種培養(yǎng)細胞模型標本的細胞中、亞分子細胞器中具有相似的表達存在形態(tài)；由第2組含有小于7.4PH細胞因子的腦脊液的培養(yǎng)液培養(yǎng)的，2種不同動物培養(yǎng)細胞被PrPSc感染以后，2種不同動物的培養(yǎng)細胞都會表達具有相似的，比第1組培養(yǎng)細胞受到更大程度TSE病理損傷的細胞形態(tài)、亞分子形態(tài)，與PrPc蛋白分子和PrPSc蛋白分子在2種培養(yǎng)神經(jīng)元細胞模型標本的細胞中、亞分子細胞器中具有相似的表達存在形態(tài)；由第3組含有大于7.4PH細胞因子的腦脊液的培養(yǎng)液培養(yǎng)的，2種不同動物培養(yǎng)細胞被PrPSc感染以后，2種不同動物的培養(yǎng)細胞都會表達具有相似的，比第1組培養(yǎng)細胞受到更大程度TSE病理損傷的細胞形態(tài)、亞分子形態(tài)，與PrPc蛋白分子和PrPSc蛋白分子在2種培養(yǎng)神經(jīng)元細胞模型標本的細胞中、亞分子細胞器中具有相似的表達存在形態(tài)；由第4組含有小于7.4PH細胞因子的腦組織提取液的培養(yǎng)液培養(yǎng)的，2種不同動物的培養(yǎng)細胞都會表達具有相似的，比第1組培養(yǎng)細胞受到更大程度TSE病理損傷的細胞形態(tài)、亞分子形態(tài)，與PrPc蛋白分子和PrPSc蛋白分子在2種培養(yǎng)神經(jīng)元細胞模型標本的細胞中、亞分子細胞器中具有相似的表達存在形態(tài)；由第5組含有大于7.4PH細胞因子的腦組織提取液的培養(yǎng)液培養(yǎng)的，2種不同動物的培養(yǎng)細胞都會表達具有相似的，比第1組培養(yǎng)細胞受到更大程度TSE病理損傷的細胞形態(tài)、亞分子形態(tài)，與PrPc蛋白分子和PrPSc蛋白分子在2種培養(yǎng)神經(jīng)元細胞模型標本的細胞中、亞分子細胞器中具有相似的表達存在形態(tài)。表明動物的外神經(jīng)結神經(jīng)元細胞、鼠神經(jīng)瘤細胞-ScN2a，由于缺乏表達分泌PrPSc綜合致病機制的某些種必不可少的關鍵輔助致病因子，而僅會受到TSE致病傳染因子——PrPSc的輕微損傷；在小于7.4PH細胞因子的動物腦脊液中至少存在有1種，致病傳染因子——PrPSc綜合致病機制的輔助致病因子，在大于7.4PH細胞因子的動物腦脊液中至少存在有1種，致病傳染因子——PrPSc綜合致病機制的輔助致病因子，而且它不同于小于7.4PH細胞因子的動物腦脊液中那種輔助致病因子，即在動物的腦脊液中至少存在有2種不同的致病傳染因子——PrPSc綜合致病機制的輔助致病因子；在小于7.4PH細胞因子的腦組織提取液中至少存在有1種致病傳染因子——PrPSc綜合致病機制的輔助致病因子，在大于7.4PH細胞因子的腦組織提取液中至少存在有1種，致病傳染因子——PrPSc綜合致病機制的輔助致病因子，而且它不同于小于7.4PH細胞因子的動物腦組織提取液中那種輔助致病因子，即在動物的腦組織提取液中至少存在有2種不同的致病傳染因子——PrPSc綜合致病機制的輔助致病因子。
可以采用與創(chuàng)造培養(yǎng)神經(jīng)元細胞TSE、NTSE的對比模型及形態(tài)學標本實驗3相類似科學方法，分別應用普通培養(yǎng)液與含有動物的腦脊液或含有動物腦組織提取液的培養(yǎng)液，分別培養(yǎng)動物的某些種被TSE致病傳染因子——PrPSc感染的細胞、或腫瘤細胞系-株，對比分析應用含有動物的腦脊液或含有動物腦組織提取液的培養(yǎng)液那種細胞、或腫瘤細胞系-株，如鼠神經(jīng)瘤的某種細胞系-株是否會受到TSE致病傳染因子——PrPSc更大損傷；即可應用此法選擇出動物的某些種細胞由于缺乏表達分泌PrPSc綜合致病機制的某些種必不可少的關鍵輔助致病因子，而僅會受到TSE致病傳染因子——PrPSc的輕微損傷、或不會受到損傷的，那一類缺乏表達分泌PrPSc綜合致病機制輔助致病因子的細胞、或腫瘤細胞系-株。
可以采用與創(chuàng)造培養(yǎng)神經(jīng)元細胞TSE、NTSE的對比模型及形態(tài)學標本實驗3相類似科學方法，應用動物的那一類缺乏表達分泌PrPSc綜合致病機制輔助致病因子的細胞、或腫瘤細胞系-株，如鼠神經(jīng)瘤細胞-ScN2a，通過應用含有動物的腦脊液或腦組織提取液中某種提取成分的培養(yǎng)液、與普通培養(yǎng)液分別培養(yǎng)的方法對比分析在動物的腦脊液或腦組織提取液中哪種提取成分，會增加缺乏表達分泌PrPSc綜合致病機制輔助致病因子的細胞所受到的損傷，即可證實在那種動物的腦脊液或腦組織提取液的提取成分中，含有PrPSc綜合致病機制輔助致病因子。例如應用各種不同的層析技術，分別從動物的腦脊液或腦組織提取液中提取出各種不同的成分，分別加入普通培養(yǎng)液中，制作出各種含有不同的成分的腦脊液或腦組織提取液的培養(yǎng)液，分別培養(yǎng)鼠神經(jīng)瘤細胞-ScN2a，對比分析腦脊液或腦組織提取液中那些種不同的成分，會增加對鼠神經(jīng)瘤細胞-ScN2a的損傷，在那種動物的腦脊液或腦組織提取液的提取成分中，即含有PrPSc綜合致病機制輔助致病因子。可通過不斷縮小層析技術的提取范圍、結合應用電泳分離技術，即可在含有PrPSc綜合致病機制輔助致病因子的腦脊液或腦組織提取液中，提取出PrPSc綜合致病機制各種不同的輔助致病因子。而后再克隆出那種輔助致病因子的表達基因——那種輔助致病因子的分子生物調(diào)控靶位，將那種輔助致病因子的表達基因，在原核或真核表達系統(tǒng)表達生產(chǎn)基因重組的那種輔助致病因子。而后再應用基因重組的那種輔助致病因子制作出，抗那種輔助致病因子的單克隆抗體；即可應用揭示傳染性海棉狀腦病-TSE病理機制的實驗模型與方法，揭示出那種輔助致病因子的致病機制。
權利要求
1.一種揭示傳染性海棉狀腦病-TSE輔助致病因子的實驗與方法，其特征在于將動物的缺乏表達分泌PrPSc綜合致病機制輔助致病因子的細胞(1).用傳染性海棉狀腦病-TSE致病傳染因子PrPSc(3).感染，置于含有動物腦組織液(2).成分的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，揭示PrPSc綜合致病機制輔助致病因子。
2.根據(jù)權利要求1中所述的揭示傳染性海棉狀腦病-TSE輔助致病因子的實驗與方法，其特征在于動物的缺乏表達分泌PrPSc綜合致病機制輔助致病因子的細胞(1).是由動物神經(jīng)組織中分離的神經(jīng)元細胞。
3.根據(jù)權利要求1中所述的揭示傳染性海棉狀腦病-TSE輔助致病因子的實驗與方法，其特征在于動物的缺乏表達分泌PrPSc綜合致病機制輔助致病因子的細胞(1).是由動物神經(jīng)結組織中分離的神經(jīng)元細胞。
4.根據(jù)權利要求1中所述的揭示傳染性海棉狀腦病-TSE輔助致病因子的實驗與方法，其特征在于動物的缺乏表達分泌PrPSc綜合致病機制輔助致病因子的細胞(1).是動物神經(jīng)瘤細胞系-株。
5.根據(jù)權利要求1中所述的揭示傳染性海棉狀腦病-TSE輔助致病因子的實驗與方法，其特征在于動物的缺乏表達分泌PrPSc綜合致病機制輔助致病因子的細胞(1).是鼠神經(jīng)瘤細胞系-株。
6.根據(jù)權利要求1中所述的揭示傳染性海棉狀腦病-TSE輔助致病因子的實驗與方法，其特征在于動物的缺乏表達分泌PrPSc綜合致病機制輔助致病因子的細胞(1).是鼠神經(jīng)瘤細胞-ScN2a。
7.根據(jù)權利要求1至6中所述的揭示傳染性海棉狀腦病TSE輔助致病因子的實驗與方法，其特征在于傳染性海棉狀腦病-TSE致病傳染因子PrPSc(3).是動物TSE病變腦組織。
8.根據(jù)權利要求1至6中所述的揭示傳染性海棉狀腦病TSE輔助致病因子的實驗與方法，其特征在于傳染性海棉狀腦病-TSE致病傳染因子PrPSc(3).是由動物TSE病變腦組織中提取的PrPSc。
9.根據(jù)權利要求1至6中所述的揭示傳染性海棉狀腦病TSE輔助致病因子的實驗與方法，其特征在于傳染性海棉狀腦病-TSE致病傳染因子PrPSc(3).是基因重組PrPSc。
10.根據(jù)權利要求1至9中所述的揭示傳染性海棉狀腦病TSE輔助致病因子的實驗與方法，其特征在于動物腦組織液(2).是動物腦脊液。
11.根據(jù)權利要求1至9中所述的揭示傳染性海棉狀腦病TSE輔助致病因子的實驗與方法，其特征在于動物腦組織液(2).是動物腦組織提取液。
全文摘要
本發(fā)明名稱為揭示傳染性海棉狀腦病－TSE輔助致病因子的實驗與方法，涉及生命科學領域及醫(yī)藥領域。提供了一個能夠系統(tǒng)的、逐步深入地揭示傳染性海棉狀腦?。璗SE致病因子PrP
文檔編號G01N33/569GK1529166SQ0315444
公開日2004年9月15日 申請日期2003年9月29日 優(yōu)先權日2003年9月29日
發(fā)明者葉新新 申請人:葉新新