本發(fā)明屬分子檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域涉，具體涉及一種納米尺度下的可用于檢測(cè)四環(huán)素的分子印跡納米纖維及其制備方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

四環(huán)素類抗生素具有一定毒性，長(zhǎng)期食用含抗生素的食品對(duì)肝、腎功能具有一定的損傷，甚至有致癌、致畸、致突變作用，易引起體內(nèi)耐藥菌增加，使抗菌藥物失效，因而，其殘留檢測(cè)技術(shù)一直是食品安全研究領(lǐng)域的一個(gè)重要熱點(diǎn)。

目前檢測(cè)四環(huán)素的主要方法有微生物法、薄層色譜法、免疫分析法、毛細(xì)管電泳法、高效液相色譜法等，各種方法均有一定的優(yōu)缺點(diǎn)，歐盟法律對(duì)各種動(dòng)物源性食物中毒四環(huán)素(母體及異構(gòu)體總量)最大殘留限量作出如下規(guī)定：肌肉中不超過(guò)100ppb，肝臟中不超過(guò)300ppb，腎臟中不超過(guò)600ppb，蛋中不超過(guò)200ppb，牛奶中不超過(guò)100ppb。我國(guó)農(nóng)業(yè)部也規(guī)定動(dòng)物源性食品中四環(huán)素類抗生素的最大殘留限量為100ppb。

分子印跡技術(shù)(MIT)是指把某一個(gè)特定的目標(biāo)分子作為模板分子，制備對(duì)該目標(biāo)分子具有特異選擇性聚合物的過(guò)程，通常被定義為制備與識(shí)別“分子鑰匙”的“人工鎖”的技術(shù)。分子印跡聚合物由于具有與天然抗體同樣的識(shí)別性能力和與高分子同樣的抗腐蝕性能的雙重優(yōu)點(diǎn)，它具有結(jié)構(gòu)預(yù)定性、特異識(shí)別性和廣泛實(shí)用性三大特點(diǎn)，因此，它在許多領(lǐng)域，如色譜中對(duì)映體和異構(gòu)體的分離、固相萃取、化學(xué)仿生傳感器、模擬酶催化、臨床藥物分析、膜分離技術(shù)等領(lǐng)域均展現(xiàn)了良好的應(yīng)用前景。

對(duì)于一些生物樣品或環(huán)境樣品，被測(cè)組分濃度通常非常低，因此往往需要對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理，進(jìn)行富集，純化。固相萃取技術(shù)因其具有易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化、靈活多變以及對(duì)環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)，目前已被視為分析測(cè)定前對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理的標(biāo)準(zhǔn)方法。為了使被測(cè)組分獲得高的富集倍數(shù)并盡量純化基本成分，要求用于固相萃取的吸附劑材料對(duì)被測(cè)物質(zhì)要有更高的親和力和選擇性。然而傳統(tǒng)的吸附劑如C8和C18鍵合硅膠材料，選擇性差，往往難于滿足復(fù)雜樣品的要求；而具有高度選擇性的生物活性材料如免疫親和劑又有制備麻煩、費(fèi)時(shí)、成本高、穩(wěn)定性差及不宜在有機(jī)溶劑中使用等缺點(diǎn)。利用分子印跡化合物的分子識(shí)別能力，可望實(shí)現(xiàn)有選擇的固相萃取，克服生物樣品體系復(fù)雜、預(yù)處理手續(xù)繁瑣等因素，在富集待分析物的同時(shí)，除去大部分干擾組分，從而方便儀器分析。

目前，已有關(guān)于采用分子印跡技術(shù)分離四環(huán)素的相關(guān)研究報(bào)道，但大多為通過(guò)本體聚合制備印跡顆粒，以顆粒的形式直接裝填固相萃取柱，尚未有印跡納米纖維制備固相萃取填充材料的報(bào)道。

上述內(nèi)容改為：目前，已有關(guān)于基于分子印跡理論分離四環(huán)素的研究，如CN101397163，CN1011080等，其制備的分離核心材料為以四環(huán)素為模板，利用本體聚合技術(shù)獲得的固體顆粒，由于難以控制粒徑，導(dǎo)致顆粒的粒徑分布范圍比較大，粒徑不均一，在裝填時(shí)會(huì)不均勻，進(jìn)而影響分離效果。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是在現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)上，提供一種具有高親和性和高選擇性吸附的分子印跡纖維材料。

本發(fā)明的另一目的是提供一種上述分子印跡纖維材料的制備方法。

本發(fā)明的第三目的是提供一種納米纖維在食品中四環(huán)素的分離或富集方面的應(yīng)用。

本發(fā)明的目的可以通過(guò)以下措施達(dá)到：

一種可用于檢測(cè)四環(huán)素的納米纖維，它由如下步驟制備而成：

(A)將四環(huán)素、甲基丙烯酸、二甲基丙烯酸乙二醇酯和乙腈充分混合后，加入引發(fā)劑充分混合，在惰性氣體保護(hù)下密封進(jìn)行聚合反應(yīng)；

(B)聚合反應(yīng)后分離出聚合物，用溶劑洗脫除去四環(huán)素，干燥，得到四環(huán)素分子印跡微球；

(C)將四環(huán)素分子印跡微球與聚苯乙烯、N,N-二甲基甲酰胺和四氫呋喃混合得到紡絲液，采用靜電紡絲裝置進(jìn)行靜電紡絲，紡出的纖維干燥后得到分子印跡的納米纖維。

一種可用于檢測(cè)四環(huán)素的納米纖維的制備方法，它包括如下步驟：

(A)將四環(huán)素、甲基丙烯酸、二甲基丙烯酸乙二醇酯和乙腈充分混合后，加入引發(fā)劑充分混合，在惰性氣體保護(hù)下密封進(jìn)行聚合反應(yīng)；

(B)聚合反應(yīng)后分離出聚合物，用溶劑洗脫除去四環(huán)素，干燥，得到四環(huán)素分子印跡微球；

(C)將四環(huán)素分子印跡微球與聚苯乙烯、N,N-二甲基甲酰胺和四氫呋喃混合得到紡絲液，采用靜電紡絲裝置進(jìn)行靜電紡絲，紡出的纖維干燥后得到分子印跡的納米纖維。

在上述各步驟(A)中，所述四環(huán)素與甲基丙烯酸、二甲基丙烯酸乙二醇酯和引發(fā)劑的摩爾比優(yōu)選為1:4～8:20～40:5～10；所述引發(fā)劑為偶氮二異丁氰。

在步驟(A)中，四環(huán)素、甲基丙烯酸、二甲基丙烯酸乙二醇酯和乙腈混合后可以進(jìn)行超聲處理或其他能夠充分混合的混合方式進(jìn)行處理。加入引發(fā)劑后可繼續(xù)進(jìn)行超聲處理或其他能夠充分混合的混合方式進(jìn)行處理。研究表明，若四環(huán)素與甲基丙烯酸的比例過(guò)低，則不利于模板分子與功能單體發(fā)生有效聚合，過(guò)高則會(huì)使得模板分子會(huì)泄露，而二甲基丙烯酸乙二醇酯的濃度過(guò)低，無(wú)法交聯(lián)，而濃度過(guò)高則會(huì)導(dǎo)致過(guò)度交聯(lián)，對(duì)后續(xù)洗脫操作造成困難。

在聚合反應(yīng)前，可以將已加入引發(fā)劑的液體置于容器中，通入氮?dú)庵脫Q氣體，再進(jìn)行聚合反應(yīng)。

在一種優(yōu)選方案中，聚合反應(yīng)的溫度為50～70℃，反應(yīng)時(shí)間為8～24小時(shí)。

一種具體的步驟(A)為：將四環(huán)素(模板)、甲基丙烯酸(功能單體)、二甲基丙烯酸乙二醇酯(交聯(lián)劑)，按模板：功能單體：交聯(lián)劑＝1:4～8:20～40的比例(摩爾比)投入到乙腈(致孔劑)中，混合溶解后，加入偶氮二異丁氰(引發(fā)劑)，混合溶解后，置于密封試管中，通入氮?dú)?，?0～70℃熱聚合反應(yīng)8-24小時(shí)。

在上述各步驟(B)中，聚合反應(yīng)后固液分離出固體聚合物，例如可采用離心的方式分離出聚合物。

對(duì)聚合物的洗脫可采用索氏提取器進(jìn)行。洗脫溶劑可以為冰醋酸和甲醇混合溶劑，洗脫至洗脫液中檢測(cè)不出四環(huán)素。在一種優(yōu)選方案中，洗脫溶劑中甲醇和冰醋酸的體積比為8～10:1。

一種具體的步驟(B)為：將反應(yīng)得到的聚合物溶液離心沉淀，所得固體裝入索氏提取器，用甲醇：冰醋酸＝8～10:1(體積比)作為提取溶劑進(jìn)行提取，直到洗脫液檢測(cè)不出四環(huán)素為止。將提取后的聚合物用甲醇洗滌并干燥，得到四環(huán)素分子印跡微球。

除不加模板分子四環(huán)素外，基于同樣的(A)和(B)的步驟，可得到空白微球。

在上述各步驟(C)中，將分子印跡微球與聚苯乙烯、N,N-二甲基甲酰胺、四氫呋喃混合，加入到注射器中，使用微量注射泵，以一定的流速，通過(guò)高壓直流靜電場(chǎng)，在距離注射器針頭一定距離的位置設(shè)置鋁箔接收器，開(kāi)始靜電紡絲，紡好的絲經(jīng)干燥后，最終得到分子印跡的納米纖維。

步驟(C)中四環(huán)素分子印跡微球與聚苯乙烯、N,N-二甲基甲酰胺和四氫呋喃的優(yōu)選質(zhì)量比為1:5～10:50～100:50～100。

在步驟(C)中，所述紡絲液可以加入到注射器中，使用微量注射器，使紡絲液從注射器針頭噴出通過(guò)高壓直流靜電場(chǎng)至所述注射器針頭前方的接收器，進(jìn)行靜電紡絲

在步驟(C)的一種優(yōu)選方案中，靜電紡絲時(shí)電壓為10～18KV，微量注射器的推進(jìn)速度為0.5～0.8mL/h，接收器與注射器針頭的距離在15～20cm。紡絲液中聚苯乙烯的濃度在10％～50％之間。研究表明，聚苯乙烯的濃度低于10％時(shí)，導(dǎo)致出絲困難，而濃度大于50％，會(huì)產(chǎn)生明顯串珠，過(guò)高或過(guò)低的濃度都會(huì)導(dǎo)致紡絲失敗，按照本法所紡的纖維直徑在300-500納米之間。

一種具體的步驟(C)的方法為：將分子印跡微球與聚苯乙烯、N,N-二甲基甲酰胺、四氫呋喃以1:5～10:50～100:50～100(質(zhì)量比)混合，攪拌過(guò)夜，將懸浮液加入到注射器中，排掉空氣后，將注射器裝入到推進(jìn)器上，同時(shí)設(shè)置鋁箔接收裝置，將高壓靜電紡絲機(jī)的電壓設(shè)置在10～18KV，微量推進(jìn)器的速度為0.5～0.8mL/h，接收器的距離在15～20cm。開(kāi)始靜電紡絲，直至結(jié)束。將獲得的纖維置于50℃真空干燥箱內(nèi)烘干。

用步驟(C)同樣的方法采用空白微球可制備空白纖維，用同樣的方法不使用分子印跡微球可制備不含微球的纖維。

本發(fā)明的納米纖維在制備后，可將其填充到萃取柱的下端，壓實(shí)。用甲醇淋洗，依次用乙腈、冰醋酸、雙蒸水對(duì)固相萃取柱活化處理，處理后的固相萃取柱即可使用。

本發(fā)明的納米纖維可應(yīng)用在食品中，特別是牛奶、蜂蜜、水產(chǎn)、肉類等食品中，四環(huán)素的分離或富集方面的應(yīng)用。例如本發(fā)明的分子印跡纖維材料可用作固相萃取填料，結(jié)合高效液相色譜技術(shù)實(shí)現(xiàn)對(duì)動(dòng)物源食品中獸藥殘留的分離、富集與測(cè)定。

本發(fā)明以四環(huán)素分子為模板，通過(guò)沉淀聚合制備分子印跡微球，通過(guò)靜電紡絲制備分子印跡纖維，然后將四環(huán)素分子印跡纖維填充到固相萃取柱中，得到四環(huán)素分子印跡固相萃取柱，再應(yīng)用四環(huán)素分子印跡固相萃取柱，純化、富集蜂蜜中的四環(huán)素殘留，與高效液相色譜連用，能夠建立一種基于印跡纖維技術(shù)的全新的獸用抗生素四環(huán)素的檢測(cè)方法。

本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明基于分子印跡理論，以纖維為基材，將顆粒負(fù)載到纖維上，既具有特異性的識(shí)別能力，又能克服顆粒粒徑布不均一的缺點(diǎn)，因其具有更大的比表面積，故吸附容量更優(yōu)越，且制備纖維時(shí)用到更少的印跡分子，故成本更低，纖維本身制備工藝成熟，故而有更好的應(yīng)用前景。

附圖說(shuō)明

圖1是本發(fā)明所用的四環(huán)素高效液相圖；

圖2是本發(fā)明所用的四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；

圖3是本發(fā)明實(shí)施例1所得的四環(huán)素分子印跡微球電鏡圖；

圖4是本發(fā)明實(shí)施例3所得的四環(huán)素分子印跡纖維電鏡圖。

具體實(shí)施方式

下面對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式和操作過(guò)程做詳細(xì)說(shuō)明，本發(fā)明的保護(hù)范圍包含但不限于下述的實(shí)施例。

實(shí)施例1

將0.0444克的四環(huán)素，85微升的甲基丙烯酸，二甲基丙烯酸乙二醇酯940微升，與10毫升乙腈混合，超聲10分鐘，加入偶氮二異丁氰10毫克，超聲10分鐘，將溶液倒入試管，通氮?dú)?0分鐘，密封。置于50℃恒溫水浴中反應(yīng)8小時(shí)，得到乳白色渾濁液，離心得到沉淀，甲醇洗滌，50℃真空干燥得到白色微球。將微球裝入索氏提取器，用10％的冰醋酸甲醇溶液洗脫，直至洗脫液無(wú)四環(huán)素為止。用純甲醇再次洗脫，50℃真空干燥得到脫去模板分子的印跡微球。

實(shí)施例2

將140微升的甲基丙烯酸，二甲基丙烯酸乙二醇酯1400微升，與10毫升乙腈混合，超聲10分鐘，加入偶氮二異丁氰15毫克，超聲10分鐘，將溶液倒入試管，通氮?dú)?0分鐘，密封。置于50℃恒溫水浴中反應(yīng)16小時(shí)，得到乳白色渾濁液，離心得到沉淀，甲醇洗滌，50℃真空干燥得到空白微球。

實(shí)施例3

將分子印跡微球0.1克與聚苯乙烯1克、N,N-二甲基甲酰胺5毫升、四氫呋喃7毫升混合，室溫?cái)嚢?4小時(shí)，將懸浮液加入到針筒注射器中，排掉空氣后，將注射器裝入到螺旋推進(jìn)器上，同時(shí)距針頭15厘米處設(shè)置鋁箔接收裝置，將高壓靜電紡絲機(jī)的正電壓設(shè)置在18KV，微量螺旋推進(jìn)器的速度為0.8毫升/小時(shí)，控制濕度在50％以下，開(kāi)始靜電紡絲，直至結(jié)束。將獲得的纖維置于50℃真空干燥箱內(nèi)烘干。

實(shí)施例4

將空白微球0.1克與聚苯乙烯0.5克、N,N-二甲基甲酰胺6毫升、四氫呋喃6毫升混合，室溫?cái)嚢?4小時(shí)，將懸浮液加入到針筒注射器中，排掉空氣后，將注射器裝入到螺旋推進(jìn)器上，同時(shí)距針頭15厘米處設(shè)置鋁箔接收裝置，將高壓靜電紡絲機(jī)的正電壓設(shè)置在15KV，微量螺旋推進(jìn)器的速度為0.6毫升/小時(shí)，控制濕度在50％以下，開(kāi)始靜電紡絲，直至結(jié)束。將獲得的纖維置于50℃真空干燥箱內(nèi)烘干。

實(shí)施例5

將聚苯乙烯1克、N,N-二甲基甲酰胺7.5毫升、四氫呋喃7.5毫升混合，室溫?cái)嚢?4小時(shí)，將懸浮液加入到針筒注射器中，排掉空氣后，將注射器裝入到螺旋推進(jìn)器上，同時(shí)距針頭15厘米處設(shè)置鋁箔接收裝置，將高壓靜電紡絲機(jī)的正電壓設(shè)置在17KV，微量螺旋推進(jìn)器的速度為0.7毫升/小時(shí)，控制濕度在50％以下，開(kāi)始靜電紡絲，直至結(jié)束。將獲得的纖維置于50℃真空干燥箱內(nèi)烘干。

實(shí)施例6

取自制的固相萃取小柱，將制得的纖維5毫克填充到柱的下端，壓實(shí)。用1毫升甲醇淋洗，再依次用1ml乙腈、冰醋酸、雙蒸水對(duì)固相萃取柱活化處理，處理后的固相萃取柱即可使用。

將市售蜂蜜1克，加入5毫升Na₂EDTA-Mcllvaine緩沖溶液，渦旋，離心，取上清液，上固相萃取柱，用5毫升5％的甲醇水溶液洗脫，棄去洗脫液，抽干，用乙酸乙酯(0.1毫升*3)洗脫，將濾液過(guò)0.22微米濾膜，進(jìn)高效液相檢測(cè)。檢測(cè)儀器：安捷倫1200高效液相色譜，色譜條件：C18ODS柱，檢測(cè)波長(zhǎng)374nm，流動(dòng)相比例：乙腈：水：磷酸＝20:80:0.1，采用外標(biāo)法，做四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)曲線，濃度范圍從10μg-50μg/mL。計(jì)算加入量分別為1μg和3μg印跡球纖維，空白球纖維、空白纖維、印跡微球和空白微球加標(biāo)的回收率和RSD(n＝3)

表一 實(shí)際樣品中四環(huán)素的測(cè)定