專利名稱：一株高效降解嘔吐毒素的枯草芽孢桿菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及一株高效降解嘔吐毒素的枯草芽孢桿菌及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
隨著消費(fèi)者對(duì)食品衛(wèi)生和安全性的普遍關(guān)注和研究者對(duì)霉菌毒素研究的不斷深入，原料和飼料中的霉菌毒素污染情況也日益引起動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)界和飼料界的重視。有調(diào)查顯示中國(guó)飼料和原料霉菌毒素污染超標(biāo)的比例為60% 70%，其中嘔吐毒素的超標(biāo)比例接近70%。王若軍等(中國(guó)飼料及飼料原料受霉菌毒素污染的調(diào)查報(bào)告，飼料工業(yè)，2003，24 (7):53 54)對(duì)我國(guó)28個(gè)省市自治區(qū)194份飼料及原料玉米、麥麩的調(diào)查結(jié)果顯示，嘔吐毒素、T-2毒素和玉米赤霉烯酮的污染率分別為50.0%、18.1%和26%。王金勇等(2012年中國(guó)飼料和原料霉菌毒素檢測(cè)報(bào)告，《中國(guó)畜牧雜志》，2013年第4期，29 34頁(yè))對(duì)2012年我國(guó)各地841份飼料和原料樣品進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)目前飼料和原料中主要存在的霉菌毒素是嘔吐毒素、玉米赤霉烯酮、煙曲霉毒素及黃曲霉毒素。其中嘔吐毒素陽(yáng)性檢出率和平均值最高。嘔吐毒素(vomitoxin)廣泛存在于大麥、小麥、玉米和燕麥等糧食和飼料原料中。人畜攝入了被嘔吐毒素污染的食物后，會(huì)導(dǎo)致厭食、嘔吐、腹瀉、發(fā)燒、站立不穩(wěn)和反應(yīng)遲鈍等急性中毒癥狀，嚴(yán)重時(shí)損害造血系統(tǒng)造成死亡。不同動(dòng)物對(duì)嘔吐毒素的敏感程度不同，豬是對(duì)嘔吐毒素最敏感的動(dòng)物，斷奶仔豬尤其敏感。飼料中0.3 0.5mg/kg的微量毒素就會(huì)引起豬拒食、生長(zhǎng)下降以及對(duì)傳染病的抵抗力下降，飼料中含lmg/kg以上的嘔吐毒素時(shí)可引起豬拒食、嗜睡、生長(zhǎng)嚴(yán)重受阻、體增重減慢、免疫機(jī)能減退、肌肉協(xié)調(diào)性喪失以及嘔吐等癥狀。此外，嘔吐毒素可在人和動(dòng)物體內(nèi)蓄積，可誘發(fā)急性或慢性疾病，具有致畸性、神經(jīng)毒性、胚胎毒性和免疫抑制作用。在我國(guó)河北省食管癌胃癌高發(fā)區(qū)居民飲食中污染率和含量均相當(dāng)高。

嘔吐毒素對(duì)畜牧業(yè)及人類產(chǎn)生如此嚴(yán)重的危害，因此自上個(gè)世紀(jì)嘔吐毒素被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，科學(xué)工作者便不斷地研究該類毒素的預(yù)防和解毒、去毒方法。迄今為止已知的去除飼料原料中嘔吐毒素的方法包括物理、化學(xué)和生物學(xué)法。物理、化學(xué)脫毒方法，在實(shí)際應(yīng)用中對(duì)于目前飼料業(yè)、養(yǎng)殖業(yè)而言均不適用。因其操作困難，且大批量的飼料及原料用此類方法無(wú)法進(jìn)行，而且經(jīng)化學(xué)脫毒處理后往往會(huì)降低飼料的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)和適口性，目前還沒(méi)有切實(shí)有效的防止飼料霉菌毒素污染的方法。微生物或生物酶因其反應(yīng)的準(zhǔn)確性、有效性和環(huán)保性而成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)。目前篩選和分離得到的能降解嘔吐毒素的芽孢桿菌數(shù)量極少，且未見(jiàn)芽孢桿菌降解飼料中的嘔吐毒素和對(duì)菌株抗逆性功能的特性研究的相關(guān)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一株高效降解嘔吐毒素的枯草芽孢桿菌及其應(yīng)用。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明提供一株高效降解嘔吐毒素的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)ANSB471，該菌是從發(fā)霉的糧食中篩選出的一株具有高效降解飼料中嘔吐毒素的枯草芽孢桿菌，現(xiàn)已保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址:北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編100101，保藏日期2013年3月21日，保藏號(hào)CGMCC N0.7344。上述枯草芽孢桿菌ANSB471的培養(yǎng)方法:取活菌濃度為109CFU/mL的枯草芽孢桿菌ANSB4710.5-2.5mL (優(yōu)選lmL)，接種于50_100mL (優(yōu)選50mL)培養(yǎng)基中進(jìn)行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，即得枯草芽孢桿菌ANSB471的發(fā)酵液。所述發(fā)酵培養(yǎng)基由如下組分組成:胰蛋白胨8_12g、酵母浸膏1.5_3g、葡萄糖1.5-4g、牛肉膏2-5g、氯化鈉3-6g、磷酸氫二鈉2.5_4g、七水硫酸鎂0.5-1.5g，加蒸餾水至800-1200mL，pH值7.0-7.4。優(yōu)選地，所述發(fā)酵培養(yǎng)基由如下組分組成:胰蛋白胨10g、酵母浸膏2g、葡萄糖2g、牛肉膏3g、氯化鈉4g、磷酸氫二鈉3g、七水硫酸鎂1.0g、蒸餾水IOOOmL,pH 值 7.2。所述搖瓶發(fā)酵條件為:發(fā)酵溫度30-40°C，發(fā)酵時(shí)間16-24h，轉(zhuǎn)速180_220r/min，pH值7.0-7.4。優(yōu)選地，所述發(fā)酵條件為:發(fā)酵溫度37°C，pH值7.0，轉(zhuǎn)速200r/min，發(fā)酵時(shí)間 20h。 枯草芽孢桿菌ANSB471的微生物學(xué)特性見(jiàn)表I。表1ANSB471的形態(tài)和理化特征
權(quán)利要求
1.一株高效降解嘔吐毒素的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)ANSB471，其保藏號(hào)為CGMCC N0.7344。
2.權(quán)利要求1所述枯草芽孢桿菌ANSB471的培養(yǎng)方法，其特征在于，取活菌濃度為109CFU/mL的枯草芽孢桿菌ANSB4710.5-2.5mL，接種于50_100mL培養(yǎng)基中進(jìn)行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，即得枯草芽孢桿菌ANSB471的發(fā)酵液； 發(fā)酵使用的培養(yǎng)基由如下組分組成:胰蛋白胨8-12g、酵母浸膏1.5-3g、葡萄糖1.5-4g、牛肉膏2-5g、氯化鈉3-6g、磷酸氫二鈉2.5_4g、七水硫酸鎂0.5-1.5g，加蒸餾水至800-1200mL, pH 值 7.0-7.4 ； 所述搖瓶發(fā)酵條件為:發(fā)酵溫度30-40°C，發(fā)酵時(shí)間16-24h，轉(zhuǎn)速180_220r/min，pH值7.0-7.4。
3.一種降解嘔吐毒素的活性蛋白的制備方法，其特征在于，取權(quán)利要求2所述枯草芽孢桿菌ANSB471的發(fā)酵液，離心，取上清液，加入2-4倍體積的無(wú)水乙醇進(jìn)行沉淀0.5_2h，離心，將得到的沉淀用0.01mol/L PBS緩沖液洗滌，離心，將得到的沉淀溶于0.01mol/L PBS緩沖液，凍干濃縮得到降解嘔吐毒素的活性蛋白。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，制備所述0.0lmol/L PBS緩沖液的方法為:稱取8g NaCl.0.2g KC1、1.44gNa2HP04和 0.24g KH2PO4，溶于 800mL蒸餾水中，用 NaOH調(diào)節(jié)溶液的PH值至7.5，加蒸餾水定容至1000mL。
5.由權(quán)利要求3或4所述方法制備得到的降解嘔吐毒素的活性蛋白。
6.權(quán)利要求1所述枯草芽孢桿菌ANSB471或權(quán)利要求5所述活性蛋白在降解飼料中嘔吐毒素中的應(yīng)用。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，將權(quán)利要求2所述枯草芽孢桿菌ANSB471的發(fā)酵液與被嘔吐毒素污染的飼料混合，將反應(yīng)體系的PH值調(diào)至7.0-7.4，36-38°C，轉(zhuǎn)速180-220r/min,反應(yīng) 2_72h ;或者， 將權(quán)利要求5所述活性蛋白溶于0.01mol/L PBS緩沖液中，然后將活性蛋白溶液與被嘔吐毒素污染的飼料混合，36-380C，轉(zhuǎn)速180-220r/min，反應(yīng)2_72h。
8.一種動(dòng)物飼料添加劑，其特征在于，其有效成分為枯草芽孢桿菌ANSB471菌劑或權(quán)利要求5所述降解嘔吐毒素的活性蛋白。
9.權(quán)利要求1所述枯草芽孢桿菌ANSB471在抗模擬胃液和/或模擬膽鹽環(huán)境中的應(yīng)用，其特征在于，取權(quán)利要求2所述枯草芽孢桿菌ANSB471的發(fā)酵液，加入到模擬胃液和/或模擬膽鹽的環(huán)境中，36-380C，培養(yǎng)24h，活菌純活率可達(dá)79%-82%。
10.由權(quán)利要求1所述枯草芽孢桿菌ANSB471發(fā)酵產(chǎn)生的淀粉酶，其特征在于，產(chǎn)酶方法為:取權(quán)利要求2制備的枯草芽孢桿菌發(fā)酵液0.5-2mL，接種到產(chǎn)酶培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵溫度為36-38°C，pH值7.0-7.4，轉(zhuǎn)速180_220r/min，發(fā)酵時(shí)間20_30h，發(fā)酵液離心除菌體后得上清粗酶液； 其中，所述產(chǎn)酶培養(yǎng)基的配方為:胰蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，可溶性淀粉5g/L，KH2P042g/L, MgSO4.7Η200.5g/L, CaCl2.2Η200.2g/L,以水配制。
全文摘要
本發(fā)明提供一株高效降解飼料中嘔吐毒素的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)ANSB471及其應(yīng)用。本發(fā)明還涉及該菌株的培養(yǎng)方法，及菌株發(fā)酵液用于降解飼料中嘔吐毒素的方法，反應(yīng)72小時(shí)后，枯草芽孢桿菌ANSB471對(duì)飼料中嘔吐毒素的降解率可達(dá)到95%，且經(jīng)傳代培養(yǎng)后，對(duì)嘔吐毒素的降解率仍保持在90%左右。該菌株還能夠分泌淀粉酶，且酶活力較高，可提高動(dòng)物對(duì)飼料中淀粉的利用率。本發(fā)明的枯草芽孢桿菌ANSB471降解嘔吐毒素的活性高、特異性強(qiáng)、作用效果溫和，不會(huì)破壞飼料中的營(yíng)養(yǎng)成分。
文檔編號(hào)A62D3/02GK103243047SQ20131016963
公開(kāi)日2013年8月14日 申請(qǐng)日期2013年5月9日 優(yōu)先權(quán)日2013年5月9日
發(fā)明者計(jì)成, 馬秋剛, 趙麗紅, 李笑櫻 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)