專利名稱：蝴蝶蘭光周期相關(guān)基因PhalCOL的序列及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)、基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種在蝴蝶蘭中表達(dá)的，與光周
期相關(guān)的CONSTANS-like基因一P/w/CO丄基因、含有該基閑的重組植物表達(dá)載體、含有上述重組植物表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因植物轉(zhuǎn)化體，以及尸/^/09￡基因在促進(jìn)植物生長發(fā)育上的應(yīng)用，還有應(yīng)用原位雜交檢測Pto/CO丄基因在蝴蝶蘭植株組織中表達(dá)分布的方法。
背景技術(shù)：
日照長度(即光周期)是影響開花時間的主要因素之一。擬南芥是一種典型的長日照植物，長日照能促進(jìn)擬南芥開花，而短曰照則會抑制開花。目前的研究發(fā)現(xiàn)，光周期途徑中的主要調(diào)控基因有CONSTANS (CO)， CRY2/FHA， GIGANTEA(GI)， FT禾卩FWA，它們的突變體在長日照(LD)條件下延遲開花，但在短日照(SD)條件下開花時間與野生型相似。
C(9是植物光周期信號傳導(dǎo)途徑中的關(guān)鍵基因，在光受體和生物鐘的共同調(diào)控下，基因表達(dá)量在一天之內(nèi)呈節(jié)律性變化。Putterill等最早于1995年在擬南芥中找到一個比野生型開花延遲的突變體，然后采用圖位克隆的方法分離到了 CO基因，該基因在根和葉中表達(dá)，在長日照下CO促使擬南芥丌花，但是短日照條件下不起作用。后來，Yano等在水稻中克隆到擬南芥的CO同源基因//A ， //ZW突變后水稻對光周期的敏感性降低。
CO蛋白是一個轉(zhuǎn)錄因子，它不是決定植物開花的最終產(chǎn)物，而是通過調(diào)控下游基因和S(9C7的表達(dá)控制開花時間。超表達(dá)CO基因后，W和仰C7的表達(dá)量增加，開花時間提
前，但是在KT突變體中超表達(dá)co基因效果并不明顯，'說明co是依賴于Fr來調(diào)控植物開花時間。co位于生物鐘輸出途徑，在生物鐘和開花時間之間起著紐帶作用。
蝴蝶蘭是蘭科植物中栽培最廣泛、最受歡迎的種類之一，花形似蝴蝶，別致美麗、色彩艷麗，花期長達(dá)數(shù)月之久，觀賞價值極高，在熱帶蘭中素有"蘭花皇后"之美譽(yù)，國內(nèi)外一直視其為花中珍品，倍受人們青睞。在我國，蝴蝶蘭消費(fèi)主要集中在春節(jié)、中秋、國慶、元旦等重大節(jié)日，生產(chǎn)上確保蝴蝶蘭如期上市非常重要，花期調(diào)控是生產(chǎn)中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。影響蝴蝶蘭生長發(fā)育與開花的因子有肥料、基質(zhì)、溫度、光照、激素等，生產(chǎn)上主要通過調(diào)控這幾個因子來實(shí)現(xiàn)對蝴蝶蘭的花期調(diào)控。
光照是影響蝴蝶蘭花芽分化、花梗生長乃至開花的重要因素。Kubota等表明，冷處理中給以適當(dāng)光照可誘導(dǎo)蘭花產(chǎn)生花芽，完全黑暗下無花芽產(chǎn)生。曾愛平認(rèn)為在一定的范圍內(nèi)，光照越強(qiáng)，抽梗率越大、花梗生長越快、花朵數(shù)越多、始花期越早；在蝴蝶蘭栽培中特別是
3花芽分化期要給予充足的光照，否則抽梗率降低、花梗伸長緩慢、花期延遲。Vaz等研究指出在蝴蝶蘭生長期間每天給予20h或更長的光照時間會嚴(yán)重影響其花芽分化，抑制開花并縮短蝴蝶蘭的壽命。因此，在蘭花的花期調(diào)節(jié)中應(yīng)適時的給予適當(dāng)?shù)墓庹詹拍鼙ＷC正?；ㄑ康姆只烷_花，甚至提早開花。但光照影響蝴蝶蘭開花的分子機(jī)理尚無報(bào)道。發(fā)明內(nèi)容-
本發(fā)明的第一目的是提供了一種在蝴蝶蘭中表達(dá)的，與光周期相關(guān)的CONSTANS-like基因一P/w/C(9i:基因、以及含有該基因的重組植物表達(dá)載體、含有上述重組植物表達(dá)載體的植物細(xì)胞系和植物轉(zhuǎn)化體。
本發(fā)明的第二個目的是提供基因在促進(jìn)植物營養(yǎng)生長和縮短開花時間中的應(yīng)用。
本發(fā)明的第三個目的是提供了應(yīng)用原位雜交檢測/^0/09丄基因在蝴蝶蘭植株組織中表達(dá)分布的方法。
本發(fā)明以蝴蝶蘭雜交種"婚宴，，CP/ a/ae"o^" /^6n'cfa cv. Wedding Promenade)的花芽為材料，提取其總RNA，再將mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA第一鏈，以該cDNA第一鏈模板，根據(jù)尸/w/C0L基因保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得572bp的核心片段，根據(jù)RACE方法，設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增獲得5'端和3'端序列，最后拼接獲得全長cDNA序列，該cDNA序列長度為1202bp，其序列如SEQ ID NO.l所示，其開放閱讀框?yàn)樽?，端第15位至第1001位堿基，共987bp，將此開放閱讀框命名為P/^/CO丄基因，其編碼的蛋白的氨基酸序列具有328個氨基酸殘基，其序列如SEQ ID N0.2所示，將該蛋白命名為PhalCOL。
將蝴蝶蘭的/^a/C<9￡基因編碼的蛋白質(zhì)序列用ClustalW2分析其同源性，結(jié)果顯示尸/w/C(9Z基因具有兩個保守的B-box-type鋅指域和一個CCT域，它分別和大麥的COL具有49%的同源性，和水稻/W/具有45%同源性，和擬南芥的JZCO丄4具有46%的同源性，AC(9丄3具有45%的同源性以及力Q9有36%的同源性。
本發(fā)明人將上述尸to/CO丄基因與植物表達(dá)載體連接，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)，將含有尸/z"/CO丄基因的重組植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到煙草的葉片中，經(jīng)組織培養(yǎng)成含有/^"/09丄基因的轉(zhuǎn)基因煙草。通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，該轉(zhuǎn)基因煙草與野生型煙草相比，轉(zhuǎn)基因煙草前期營養(yǎng)生長更旺盛，長得更快些，在開花時間上，轉(zhuǎn)基因植株都比野生型煙草提前開花，10個轉(zhuǎn)化株的平均開花時間為41天，而野生型的平均開花時間為65天。由此表明，外源/^37a^基因?yàn)榫哂泄δ艿慕Y(jié)構(gòu)基因，其在宿主煙草中實(shí)現(xiàn)了超量表達(dá)，促進(jìn)了轉(zhuǎn)基因煙草的營養(yǎng)生長和生殖生長，從而縮短了開花時間，因此該基因能影響植株的發(fā)育。
從上述結(jié)果分析可以表明，本發(fā)明的尸/w/CO丄基因是一個新的與光周期相關(guān)的CCWS7^VS-like基因，該基因能促進(jìn)植物的營養(yǎng)生長和生殖生長，縮短開花時間，從而影響
植株的發(fā)育。
因此可以將本發(fā)明的尸/^/co丄基因應(yīng)用到促進(jìn)植物生長發(fā)育和縮短開花時間中。本發(fā)明
的尸/^/CO丄基因與植物表達(dá)載體連接，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)進(jìn)入植物細(xì)胞、組織或器官，通過組織培養(yǎng)成轉(zhuǎn)基因的植物轉(zhuǎn)化體，從而實(shí)現(xiàn)促進(jìn)該植物的營養(yǎng)生長和生殖生長，縮短開花時間。所述的植物表達(dá)載體可為任意一種可用于根瘤農(nóng)桿菌或發(fā)根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物的雙元載體或可用于植物微彈轟擊的載體等，如pBI系列載體、pBin系列載體、GatewayTW系列載體、pCAMBIA系列載體或其它衍生植物表達(dá)載體等，上述載體均為公開銷售的商品。
本發(fā)明所述的檢測尸/^/09丄基因在蝴蝶蘭植株組織中表達(dá)分布的方法，包括以下步驟
(1) 制備蝴蝶蘭的組織切片；
(2) 將帶有標(biāo)記的特異性探針與蝴蝶蘭的組織切片雜交結(jié)合；
(3) 根據(jù)標(biāo)記對原位雜交結(jié)果進(jìn)行檢測；所述的帶有標(biāo)記的特異性探針的序列為如SEQ ID N0.3所示序列的反義RNA鏈，該反
義RNA鏈具體是指與SEQ ID NO.3所示序列互補(bǔ)的RNA鏈，該RNA鏈可以通過現(xiàn)有的很多方法獲得，然后使其帶上標(biāo)記作為與蝴蝶蘭的組織切片雜交的特異性探針。
所述的標(biāo)記可以為地高辛、生物素、堿性磷酸酶、辣根過氧化酶或熒光素，通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的技術(shù)手段結(jié)合到探針上。
本發(fā)明所述的制備蝴蝶蘭的組織切片是按照常規(guī)的方法制備的，其具體步驟如下取蝴蝶蘭的新鮮組織材料，立即置于4%多聚甲醛中固定12小時，再以乙醇梯度脫水，包埋于石蠟塊中，將包埋好的材料修塊后用切片機(jī)進(jìn)行8nm連續(xù)切片，并將切片粘片于預(yù)涂過多聚賴氨酸的載玻片上，然后切片在42'C上展片，4(TC烘烤過夜。所述的雜交結(jié)合過程如下石蠟樣品切片后脫蠟，復(fù)水并以蛋白酶消化組織蛋鹽酸白，經(jīng)預(yù)雜交后與事先變性處理的帶有標(biāo)記的特異性探針分子在雜交液中5(TC共浴16小時。雜交后，以血清封閉探針，利用特異性抗體與雜交上的探針分子結(jié)合，并進(jìn)行顯色反應(yīng)，用中性樹膠封片，顯微觀察并照相。所述的戶to/CO丄基因以藍(lán)色分布在切片上。因此可以利用本方法觀察到i^a/CO丄基因在各個器官，各個發(fā)育階段的表達(dá)量。
本發(fā)明首次從蝴蝶蘭克隆中的CCWSL4iVS-like基因一Pto/COZ基因，并且通過實(shí)驗(yàn)證明該基因能夠影響植物生長發(fā)育進(jìn)程，促進(jìn)了營養(yǎng)生長，并促使植物提前開花。因此，本發(fā)明提供的蝴蝶蘭尸/^/09Z基因?yàn)榛蚬こ谈牧贾参锏纳L進(jìn)程，對植物的花期進(jìn)行調(diào)控提供了一種有效的技術(shù)手段，具有廣泛的應(yīng)用前景和極大的經(jīng)濟(jì)價值。


圖1是尸to/CO丄基因編碼的氨基酸序列與CO丄同源基因的氨基酸序列比較圖，其中AtCO (Acc. No, NP—197088)， AtCOL3 (Acc. No. Q9SK53.1)， AtCOL4 (Acc. No. Q940T9.2)， Hdl (Acc. No. ABB17664)， HvCOL (Acc. No. AAM74069)，具有一致性和相似性的氨基酸分別用黑色和 灰色陰影表示，COL基因的B-box域和CCT域在序列上用橫線注明，A暗示鋅指域中半胱氨 酸殘留基；
圖2是通過RT-PCR檢測不能發(fā)育花梗的幼年期植株的根、莖和葉中的/Vw/09丄基因表達(dá)量 的電泳顯示圖，其中1為根，2為莖，3為葉，A為尸to/09Z基因，B為蝴蝶蘭的ACTIN基 因(Genebank登錄號為AF246714);
圖3是通過RT-PCR檢測沒有發(fā)育花梗的成年植株的根、莖和葉中的i^a/CO丄基因表達(dá)量的 電泳顯示圖，其中1為根，2為蓬，3為葉，A為尸te/09Z基因，B為蝴蝶蘭的ACTIN基因 (Genebank登錄號為AF246714);
圖4是通過RT-PCR檢測剛發(fā)育花梗的成年植株，花梗長度小于lcm時，根、莖、花梗和葉 中的P/za/CO丄基因表達(dá)量的電泳顯示圖，其中1為根，2為莖，3為葉，4為花梗，A為P/w/09丄 基因，B為蝴蝶蘭的ACTIN基因(Genebank登錄號為AF246714);
圖5是通過RT-PCR檢測花梗長度為4cm的成年植株的根、莖、花梗和葉中的尸to/C(9i:基因 表達(dá)量的電泳顯示圖，其中l(wèi)為根，2為莖，3為葉，4為花梗，A為P^ZC(9i基因，B為蝴 蝶蘭的ACTIN基因(Genebank登錄號為AF246714);
圖6是目的基因(尸/w/CO丄)的PCR鑒定圖，其中M為Marker、 1— 10為P/z"/CO丄轉(zhuǎn)基因
煙草株系編號、CK為野生型煙草、PBI121為轉(zhuǎn)入空載體煙草。
圖7是根中蝴蝶蘭尸/2"/COL基因的原位雜交結(jié)果圖8是葉中蝴蝶蘭尸/^/CO丄基因的原位雜交結(jié)果圖9是花梗中蝴蝶蘭i^a/CO丄基因的原位雜交結(jié)果圖10是花柄中蝴蝶蘭P/w/COZ基因的原位雜交結(jié)果圖11是子房中蝴蝶蘭Pto/CO丄基因的原位雜交結(jié)果圖12是花柄中的蝴蝶蘭i^a/CO丄基因的正義探針原位雜交結(jié)果圖，為負(fù)對照； 圖13， 14是花芽中蝴蝶蘭尸/^/09丄基因的原位雜交結(jié)果圖15是花器官原基開始發(fā)育的花蕾中蝴蝶蘭Pto/C(9i:基因的原位雜交結(jié)果圖； 圖16是花芽中蝴蝶蘭尸/z"/CC^基因的正義探針原位雜交結(jié)果圖，為負(fù)對照； 圖17、 18和19是花器官都具備的花蕾中蝴蝶蘭/^"/C(9丄基因的原位雜交結(jié)果圖； 圖20是花蕾中蝴蝶蘭戶/w/09丄基因的正義探針原位雜交結(jié)果圖，為負(fù)對照；
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施實(shí)例進(jìn)一步闡釋本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)例僅以用于說明本發(fā)明而不 用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)例中未注明具體的實(shí)驗(yàn)方法，均可按照常規(guī)方法進(jìn)行。如J. 薩姆布魯克等《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》、F.奧斯伯等《精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》中所述條件， 或按照所用產(chǎn)品生產(chǎn)廠商的使用說明。 實(shí)施例1:
一、蝴蝶蘭尸/w/C(9丄基因的克隆，及其同源性分析。
(1) 以蝴蝶蘭雜交種"婚宴"CPto/ae"o/w^ ^&z'由cv. Wedding Promenade)為試驗(yàn)材料， 植物材料在溫室正常條件下生長(L/D， 16h/8h; 25-28°C)。
(2) RNA提取用Trizol reagent (購自Invitrogen公司)進(jìn)行試驗(yàn)材料的總RNA提取，整 個操作過程嚴(yán)格按照Trizol試劑的RNA提取流程說明。
(3) 采用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(購自Promgra公司)逆轉(zhuǎn)錄mRNA成cDNA第一鏈，方法按 照試劑說明書進(jìn)行。
(4) 基因的克隆以逆轉(zhuǎn)錄的蝴蝶蘭花芽cDNA第一鏈為模板，利用引物PCOF和PCOR 進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得572bp的核心片段。
引物PCOF: 5'-TTC ATT C(C/T)G C(A/C)A A(C/T)C C(A/T)C TTG C-3'
PCOR: 5'-CTC TGC ATA (C/G/T)GC (C/T)TT (C/T)CT (A/T/C)GA A-3'
采用Golden DNApolymerase (TIANGEN)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，加樣體系參照酶的說明書，其 PCR反應(yīng)程序?yàn)?4。C變性4min ，隨后進(jìn)行35個循環(huán)反應(yīng)(94°C 30s， 51°C 45s, 72°C lmin)， 72。C延伸5min。
利用該572bp的核心片段，根據(jù)RACE方法，設(shè)計(jì)擴(kuò)增3，端序列的引物PC03A和 PC03B，以及擴(kuò)增5'端序列的引物PC05A和PC05B，引物為
PC03A: 5-AAGAACAGGCGGTTTGAG-3
PC03B: 5陽GAGAAAACAATACGCTACGC-3
PC05A: 5'-GCAGTCCGCCGATTTCATTATTCC-3'
PC05B: 5'-CAAACAAGGGAACCACAGGCACT-3' 3，端序列PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椴捎肎olden DNA polymerase (TIANGEN)進(jìn)行PCR擴(kuò) 增，加樣體系參照酶的說明書，其PCR反應(yīng)程序?yàn)?4'C變性3min,隨后30個循環(huán)反應(yīng)(94 °C 30s, 53°C 45s,72。Clmin) , 72°C延伸5min。
5'端序列PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椴捎肎olden DNA polymerase (TIANGEN)進(jìn)行PCR擴(kuò) 增，加樣體系參照酶的說明書，其PCR反應(yīng)程序?yàn)?5'C變性lmin，接著5個循環(huán)反應(yīng)(94 °C 30s， 72°C 2min)，再接著5個循環(huán)反應(yīng)(94°C 30s， 70°C 30s， 72°C 1.5min)，最后30個循環(huán)反應(yīng)(94°C 30s， 65°C 30s， 72°C 1.5min)， 72'C延伸10min， 4°C終止反應(yīng)。
對5'端和3'端序列的擴(kuò)增序列進(jìn)行測序，最后與核心片段拼接獲得全長cDNA序列， 其序列如SEQ.ID.NO.l所示，該序列長度為1202bp，該序列的開放閱讀框?yàn)镾EQ.ID.NO.l的 自5'端第15位至第1001位堿基，共987bp，將該開放閱讀框命名為尸/7"/09￡基因，該基 因編碼由328個氨基酸殘基組成的多肽，蛋白質(zhì)的pI/Mw分別為5.60 / 34871.31。將蝴蝶蘭 戶/w/COL基因編碼的氨基酸序列用ClustalW2分析其同源性，結(jié)果顯示i^a/CO丄基因有兩個 保守的B-box-type鋅指域和一個CCT域，它分別和大麥的COL有49%的同源性，和水稻7W7 有45%同源性，和擬南芥的ACO丄4有46%的同源性，ACO丄3有45%的同源性以及ACO有 36%的同源性(見圖1)。
二、 蝴蝶蘭P/w/CO丄基因表達(dá)模式分析
在蝴蝶蘭不同的生長發(fā)育階段，用Trizolreagent (Invitrogen)分別提取蝴蝶蘭植株的根、 葉片、花梗以及莖的總RNA，測定OD260后定量取出2ugRNA，然后再使用oligo-dT引物 和PrimeScriptTM Reverse Transcriptase (購自Takara公司)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(方法參考說明 書)，以跨越內(nèi)含子的特異引物CF: 5' GTGCCTGTGGTTCCCTTG 3'與CR: 5' ACCGCCTGTTCTTTCTCT 3'，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)程序?yàn)?4。C變性4min ，隨后進(jìn)行32 個循環(huán)反應(yīng)(94°C 30s, 54°C 45s, 72°C lmin)， 72。C延伸5min。反應(yīng)產(chǎn)物以1.0%瓊脂糖凝 膠電泳分離，電泳結(jié)果如圖2、 3、 4禾n5所示，其中對照為來自蝴蝶蘭的ACTIN基因(登錄 號AF246714)，可通過常規(guī)方法擴(kuò)增得到，擴(kuò)增該對照的ACTIN基因(登錄號AF246714) 的引物為5 ，-TGGAAACTGCCA AGACG-3', 5 ， -GCAGCGAAGATTCAAAA-3 。從電泳圖中可 以看出，Pto/CO丄基因在幼年苗和成年苗的根、莖、葉和花梗中都能強(qiáng)烈表達(dá)，在不同的生 長階段，在葉片中的表達(dá)都很強(qiáng)，而在莖中的表達(dá)隨花梗的發(fā)育發(fā)生明顯的變化，推測該基 因與花梗的發(fā)育有著密切的關(guān)系。
三、 蝴蝶蘭i^a/09丄基因在煙草中的表達(dá)及轉(zhuǎn)基因植株的表型鑒定。 (1)含目的基因戶/za/CO丄表達(dá)載體的構(gòu)建
以前面逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，使用Takara公司的LA Taq酶進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系 按說明書，擴(kuò)增引物為
PhCOF:5， AATTCTAGAATGGGAGGCAAAGGTGTGGAAGGC3' PhCOR:5， CATGGATCCTTAGAAGGATGGAACTACGCCGTA3， 反應(yīng)程序?yàn)?4。C 4min; 94°C 30sec, 60°C 45sec, 72°C 2min,35cycles; 72°C 5min。 將擴(kuò)增得到的尸/^/CO丄基因與Takara公司的pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌中 (具體流程參見T載體的說明書)。提取含有尸/za/COi:基因的T載體質(zhì)粒，利用酶切位點(diǎn)Xba I和BamH I將尸/ a/COZ基因 從T載體上切下，與帶有3 5s啟動子和nos終止子的植物表達(dá)載體pBI 121同樣用Xba I和BamH I酶切后連接，連接酶用T4DNALigase (購自Takara公司)，具體操作按說明書方法進(jìn)行， 構(gòu)建表達(dá)載體pBI121-35s-PhalCOL。
(2) 將重組質(zhì)粒pBI121-35s-PhalCOL采用電擊法轉(zhuǎn)化到根瘤農(nóng)桿菌LBA4404中。
>取1 u 1重組質(zhì)粒pBI121-35s-PhalCOL與剛制好的農(nóng)桿菌LBA4404感受態(tài)細(xì)胞混勻，
冰上放置10min。 >將此混合物轉(zhuǎn)移至已預(yù)冷的電極杯電擊。
>向電擊杯中加入1000pl的YM液體培養(yǎng)基，重懸細(xì)胞后，轉(zhuǎn)移到1.5ml的離心管中，
28°C， 220—250rpm復(fù)蘇2-4小時。所述的YM液體培養(yǎng)基為本領(lǐng)域常用培養(yǎng)基，其
配方參考J.薩姆布魯克等《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》。 >將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于YM + Kan (卡那霉素)50mg/L+硫酸鏈霉素25mg/L的平板上，放
于28'C培養(yǎng)箱培養(yǎng)48小時。 >挑取單克隆進(jìn)行菌落PCR鑒定，選取含有目的基因片段的根瘤農(nóng)桿菌LBA4404克隆
作為陽性克隆。
(3) 利用葉盤法轉(zhuǎn)化煙草
>挑取陽性克隆，接種于含有Kan (卡那霉素)50mg/L和硫酸鏈霉素25mg/L的YM液體
培養(yǎng)基中，28°C 200rpm振蕩培養(yǎng)24—36h，使OD6。。=0. 5左右。 >將菌液轉(zhuǎn)入無菌的50ml離心管中，5000rpm， 15min離心收集菌種，再用同等體積的
MS液體培養(yǎng)基懸浮菌種，準(zhǔn)備浸染葉片。所述的MS培養(yǎng)基是本領(lǐng)域常用培養(yǎng)基，其
配方參考(Mumshige T and Skoog F, 1962)。 >于無菌條件下將煙草無菌苗的成熟葉片除去葉邊緣，切成0.5x1.0 cm的小塊，浸泡
在制備好的菌液中。
> 10 min后取出葉片于滅菌的濾紙上吸去菌液，放在含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%蔗糖和質(zhì)量分
數(shù)為0.6-0. 7%瓊脂的MS培養(yǎng)基中，置于24土rC光照培養(yǎng)箱中，14h光照/10h黑暗
條件下共培養(yǎng)48小時。 >當(dāng)看到葉片與培養(yǎng)基接觸邊緣長出白色農(nóng)桿菌時，將葉片轉(zhuǎn)移至不加激素的MS液體
培養(yǎng)基中，于28士rC恒溫?fù)u床上振蕩漂洗45-60 min，夾出葉片放于滅菌的濾紙上除
去多余的液體培養(yǎng)基。
(羧芐青霉素)、300 mg Kanamicine (卡那霉素)、O.lmgNAA (a-萘乙酸)、l.OmgBA (6-芐基腺嘌呤)、0.59gMES[2- (N-嗎啉代)乙磺酸]、30g蔗糖、6-7g瓊脂、pH 5.7-5.8; >約20天后可見分化芽長出，待芽長大后，切下并轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，置于24±1 'C光照培養(yǎng)箱中，14 h光照/10 h黑暗條件下培養(yǎng)篩選，所述的生根培養(yǎng)基為每升 MS培養(yǎng)基含有200 mg Carbenicillin、 100 mg Kanamicine、 15g蔗糖和6-7g瓊脂、pH 5.7-5.8;
>待根系發(fā)達(dá)后，將植株取出，用無菌水洗凈附著的固體培養(yǎng)基，移入土壤中，溫室中 培養(yǎng)。
(4) 轉(zhuǎn)基因植株的分子鑒定。
DNA的提取采用Takara的"Universal Genomic DNA Extraction Kit"。以轉(zhuǎn)基因植株的基因
組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以
PhCOF: 5' AATTCTAGAATGGGAGGCAAAGGTGTGGAAGGC3' PhCOR: 5' CATGGATCCTTAGAAGGATGGAACTACGCCGTA3， 為擴(kuò)增引物，采用Golden DNA polymerase (TIANGEN)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，加樣體系參照酶
的說明書，反應(yīng)程序?yàn)?4。C變性4min,隨后35個循環(huán)(94。C 30sec， 60°C 45sec,72°C 2min),
72。C延伸5min。電泳檢測，檢測結(jié)果如圖6所示。PCR結(jié)果表明攜帶有外源蝴蝶蘭
基因的表達(dá)質(zhì)粒巳經(jīng)插入到煙草基因組中。
(5) 轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行表型鑒定。 將轉(zhuǎn)基因煙草植株和野生型煙草同等條件下進(jìn)行培養(yǎng)，與野生型煙草相比，轉(zhuǎn)基因煙草
前期營養(yǎng)生長更旺盛，長得更快些。在開花時間上，轉(zhuǎn)基因植株都比野生型煙草提前開花， 同等培養(yǎng)條件下，野生型煙草需要65天開花，而轉(zhuǎn)入化aJOX基因的煙草只需要41天開花。 根據(jù)結(jié)果表明，外源尸力WO^基因在宿主煙草中實(shí)現(xiàn)了超量表達(dá)，促進(jìn)了轉(zhuǎn)基因煙草的營養(yǎng) 生長和生殖生長，從而促進(jìn)了開花時間。試驗(yàn)結(jié)果表明，蝴蝶蘭/^s/C汰基因?yàn)橛泄δ艿幕?因，可以影響植株的發(fā)育，具有促進(jìn)營養(yǎng)生長和生殖生長，從而縮短開花時間的作用。
由上述結(jié)果分析表明，本發(fā)明的/^70^基因是一個新的與光周期相關(guān)的CCWOT4A/S-like 基因，該基因能促進(jìn)植物的營養(yǎng)生長和生殖生長，縮短開花時間，從而影響植株的發(fā)育。 四、應(yīng)用原位雜交檢測尸/^/C(9丄基因在蝴蝶蘭植株組織中表達(dá)分布的方法
(1) 取蝴蝶蘭的根、葉、花梗、花柄、花芽、頂芽、腋芽及剛發(fā)育的花蕾。將所取的新鮮 材料立即置于4%多聚甲醛中固定12小時。再以乙醇梯度脫水，包埋于石蠟塊中。
(2) 將包埋好的材料修塊后用切片機(jī)進(jìn)行8um連續(xù)切片，并將切片粘片于預(yù)涂有多聚賴氨
酸的載玻片上，然后切片在42'C上展片，4(TC烘烤過夜。(3) 將尸力WO^基因中一段特異的長573bp的片段(序列如SEQ ID NO.3所示)PCR擴(kuò)增， 其引物為5 ， -TTTCATTCTGCCAACCCTCTTG-3', 5' -CTCTGCATAGGCTTTTCTCGAA-3' 利用Golden DNA polymerase (TIANGEN)酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，加樣體系參照酶的說明 書，其PCR反應(yīng)程序?yàn)?4。C變性4min ，隨后進(jìn)行30個循環(huán)反應(yīng)(94°C 30s, 51 °C 45s, 72°C lmin)， 72。C延伸5min。
將上述擴(kuò)增出573bp的片段連接在pGEM-T載體(購自promega公司)的多克隆位點(diǎn)上， 用Sphl (購自Takara公司)酶切該質(zhì)粒DNA，使其線性化，用DIG RNA Labeling Kit (購 自Roche公司)中的Sp6 RNA多聚酶轉(zhuǎn)錄上述線性化的DNA，將得到的帶有地高辛標(biāo)記的 antisense RNA為探針；同樣，用Spel (Takara)酶切該質(zhì)粒DNA，使其線性化，用DIG RNA Labeling Kit (Roche)中的T7 RNA多聚酶轉(zhuǎn)錄線性化的DNA，將得到的帶有地高辛標(biāo)記的 sense RNA作為反應(yīng)的對照。具體步驟參考試劑說明書。
(4) 石蠟樣品切片后脫蠟，復(fù)水，在0.2M HC1中變性20min，清洗后用1%牛血清白蛋白 封阻反應(yīng)再與事先變性處理的探針分子在雜交液中5(TC共浴16小時。
(5) 雜交后，用2XSSC溶液(配方參考J.薩姆布魯克等《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》)清洗玻片， 以2%兔血清(購自北京鼎國公司)封閉探針，再用anti-Dig-AP (購自Roche公司) 進(jìn)行免疫反應(yīng)。
(6) 在載玻片上滴加氮藍(lán)四唑(NBT)和5-溴-4-氯_3-吲哚磷酸(BCIP)(購自sigma公 司)配成顯色液，37"黑暗處顯色反應(yīng)6-12hrs。
(7) 用中性樹膠封片，顯微觀察并照相。 原位雜交陽性結(jié)果呈藍(lán)紫色分布在細(xì)胞中，結(jié)果如圖7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、
15、 16、 17、 18、 19和20所示，在上述圖中，im為花序分生組織，fm為花分生組織，fp為 花原基，lp為唇瓣原基，sp為萼片原基，pp為花瓣原基，b為苞片，s為萼片，l為唇瓣，p 為花瓣，ac為藥帽，c為柱頭，pl為花粉粒，r為蕊喙。P/za/09丄基因在根、葉、花梗、花柄 及子房中都有表達(dá)，它顯著地累積在細(xì)胞分裂區(qū)域和微管束區(qū)域，其中，在葉片微管束、葉 肉細(xì)胞及子房中累積的更多。在蝴蝶蘭花發(fā)育的早期階段，尸/^/CO丄基因主要在花序分生組 織、花分生組織及花原基中表達(dá)?；òl(fā)育的后期階段，大量的i^fl/09丄基因轉(zhuǎn)錄的mRNA 累積在萼片原基、唇瓣原基及花瓣原基中。當(dāng)花蕾形成后，i^a/CO丄mRNA在所有的花器官 中都能觀察到，其中，在花粉粒和蕊喙中的信號強(qiáng)于在其它花器官中的信號。
因此可以利用原位雜交的方法檢測P/za/C(^基因在蝴蝶蘭植株組織中表達(dá)分布。序列表
<110>中國科學(xué)院華南植物園
<120>蝴蝶蘭光周期相關(guān)基因Pto/COZ的序列及其應(yīng)用 <160> 3 <210> 1 <211> 1202 <212> DNA
<213>蝴蝶蘭"婚宴"CP/zate"o戸、Zz少6r油cv. Wedding Promenade)
<220>
<221> CDS
<222> (15)..,(讓)
<400> 1
ACGCGGGGAGAAAAATGGGAGGCAAAGGTGTGGAAGGCGGGGGAGCCTACTGGGAACTAG60
AAGCGCGGAAGTGCGACGGCTGCAAGGGGCCGCCGGCGGCGGCGGTGCTCTTCTGCAGGG120
CTGATGCCGCTTTCCTCTGCGCCACTTGCGATGCGCGCGTGCACGGCGCGAATAAGCTCG180
CTTCCCGGCACGAGCGCGTCTGGCTCTGCGAGGTGTGCGAGCAAGCGCCGGCCGCCGTCA240
CCTGCAAGGCTGACGCCGCCGCACTCTGCTCCGCTTGCGACGCTGATATCCACACAGCCA300
ATCCCCTCGCAAGCCGCCACCAACGAGTGCCTGTGGTTCCCTTGTTTGAATCCCCTGTCC360
CCGACCCGGACCTCCTTTATGATGCCGATGAAGGCGAAGAAGACAGCGCTGGTGCTGCAT420
CTTGGATACTGCCTGCTCCGGCGAAGGATACGGTTCAAGGAATAATGAAATCGGCGGACT480
GCTTCGCCGATGTCCATCCGTACCTGGATCTGGAGTACGCTTCGTCGGTGGAAGCCGGGA540
TTTATCAGTCTGACAGCGTCGTGCCGGCGGGAGCGGGAGCTTCGTCAGGTCTCATCATGC600
TCGATTTCGGTAAACCCAAGCCGAAGACTCATAGCTACACCATCAGCCACAGCATGTCGT660
CATCAGAGGTGGCAGTGGTACCGGACGGTGGCGGTAGCGCCTTGGCGGACGTGTCTAATT720
GTGCCGGCGGCAGCGGCGGCATGGGGGAGAGATCGGCGATGATGGATCGGGAGGCGAGGG780
TGATGAGATACAGGGAAAAGAGAAAGAACAGGCGGTTTGAGAAAACAATACGCTACGCTT840
CGAGGAAGGCGTACGCAGAGACGAGACCGAGAATAAAGGGGAGGTTTGCGAAGAGGACGG900
AAGTGGAGTTGGAGATCGATCAGATCTACTCGTCGGCGGCAGCCGCCACGGCTGCTTTCA960
TGGAATCTGTTCAAGACTACGGCGTAGTTCCATCCTTCTAAGACATCATGCGAACTCTTA1020TCACTCTGCT TTCGCCATGA TTGACTGCAA GAAGCGTATT GCCGTTTGTG GGAGTGAAAT 1080 CATCGTAGTC GGAGCAGATA AAGGCTCCTT GTTTTTGCAG CCTTCTTAAT TATTGTATAC 1140 TTTTTGGATA TTTCGACTTT TTCGATTCTG ATAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA 1200
AA
<210>2 <211>328 <212> PRT <213〉蝴蝶蘭 <400> 2 Met Gly Gly 1
Glu Ala Arg
"婚宴"(尸/2o/"e"o/)j7'j1 /j少6n'c/a cv. Wedding Promenade)
Lys Gly Val Glu Gly Gly Gly Ala Tyr Trp
Gly 5
Gly 10
Glu
Lys Cys Asp Gly Cys Lys Gly Pro Pro Ala Ala 20 25 Val Leu Phe Cys Arg Ala Asp Ala Ala Phe Leu Cys Ala Thr
35 40 Asp Ala Arg Val His Gly Ala Asn Lys Leu Ala Ser Arg His
50 55 Arg Val Trp Leu Cys Glu Val Cys Glu Gin Ala Pro Ala Ala
65 70 Thr Cys Lys Ala Asp Ala Ala Ala Leu Cys Ser Ala Cys Asp
80 85 Asp lie His Thr Ala Asn Pro Leu Ala Ser Arg His Gin Arg
95 100 Pro Val Val Pro Leu Phe Glu Ser Pro Val Pro Asp Pro Asp
110 115 Leu Tyr Asp Ala Asp Glu Gly Glu Glu Asp Ser Ala Gly Ala
125 130 Ser Trp lie Leu Pro Ala Pro Ala Lys Asp Thr Val Gin Gly
140
Met Lys Ser Ala Asp Cys Phe Ala Asp
145
Val His 13
Pro Tyr Leu
Leu 15 Ala 30 Cys 45 Glu 60 Val 75 Ala 90 Val 105 Leu 120 Ala 135 lie 150 Asp155 160 165
Leu Glu Tyr Ala Ser Ser Val Glu Ala Gly lie Tyr Gin Ser Asp
170 175 180
Ser Val Val Pro Ala Gly Ala Gly Ala Ser Ser Gly Leu lie Met
185 190 195
Leu Asp Phe Gly Lys Pro Lys Pro Lys Thr His Ser Tyr Thr lie
200 205 210
Ser His Ser Met Ser Ser Ser Glu Val Ala Val Val Pro Asp Gly
215 220 225
Gly Gly Ser Ala Leu Ala Asp Val Ser Asn Cys Ala Gly Gly Ser
230 235 240
Gly Gly Meu Gly Glu Arg Ser Ala Met Met Asp Arg Glu Ala Arg
245 250 255
Val Met Arg Tyr Arg Glu Lys Arg Lys Asn Arg Arg Phe Glu Lys
260 265 270
Thr lie Arg Tyr Ala Ser Arg Lys Ala Tyr Ala Glu Thr Arg Pro
275 280 285
Arg lie Lys Gly Arg Phe Ala Lys Arg Thr Glu Val Glu Leu Glu
290 295 300
lie Asp Gin lie Tyr Ser Ser Ala Ala Ala Ala Thr Ala Ala Phe
305 310 315
Met Glu Ser Val Gin Asp Tyr Gly Val Val Pro Ser Phe
320 325 328
<210> 3 <211>573 <212> DNA
<213>蟲胡蝶蘭"婚宴"CP/za/ae"o/^51/i[yZ)n,fi a cv. Wedding Promenade) <400> 3
TTCATTCCGC CAATCCTCTT GCAAGCCGCC ACCAACGAGT GCCTGTGGTT CCCTTGTTTG 60
AATCCCCTGT CCCCGACCCG GACCTCCTTT ATGATGCCGA TGATGGCGAA GAAGACAGCG 120ATCTTGGATACTGCTTGCTCCGGCGAAGGATACGGTTCAAGGAATAATGA180
AATCGGCGGACTGCTTCGCCGATGTCCATCCGTACCTGGATCTGGAGTACGCTTCGTCGG240
TGGAAGCCGGGATTTATCAGTCTGACAGCGTCGTGCCGGCGGGAGCGGGAGCTTCGTCAG300
GTCTCATCATGCTCGATTTCGGTAAATCCAAGCCGAAGACTCATAGCTACACCATCAGCC360
ACAGCATGTCGTCATCAGAGGTGGCAGTGGTACCGGACGGTGGCGGTAGCGCCTTGGCGG420
ACGTGTCTAATTGTGCCGGCGGCAGCGGCGGCATGGGGGAGAGATCGGCGATGATGGATC■
GGGAGGCGAGGGTGATGAGATACAGGGAAAAGAGAAAGAACAGGCGGTTTGAGAAAACAA540
TACGCTACGCTTCTAGAAAAGCCTATGCAGAGA57權(quán)利要求
1.一種蝴蝶蘭光周期相關(guān)的PhalCOL基因，其特征在于所述的PhalCOL基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1中的第15位至第1001位堿基所示。
2. —種由權(quán)利要求1所述的基因編碼的蛋白質(zhì)，其特征在于所述蛋白質(zhì)的氨基酸 序列如SEQ ID N0.2所示。
3. —種含有權(quán)利要求1所述的i^a/COL基因的重組植物表達(dá)載體。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組植物表達(dá)載體，其特征在于所述的重組植物表達(dá)載體中的載 體為載體pBI121。
5. —種含有權(quán)利要求3所述的重組植物表達(dá)載體的植物細(xì)胞系。
6. —種含有權(quán)利要求3所述的重組植物表達(dá)載體的植物轉(zhuǎn)化體。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的植物轉(zhuǎn)化體，其特征在于所述的植物轉(zhuǎn)化體中的受體植物為煙草。
8. 權(quán)利要求1所述的P/^/C(9丄基因在促進(jìn)植物營養(yǎng)生長和縮短開花時間中的應(yīng)用。
9. 一種利用原位雜交檢測尸/^/09丄基因在蝴蝶蘭植株組織中表達(dá)分布的方法，其特征在于 包括以下步驟-(1) 制備蝴蝶蘭的組織切片；(2) 將帶有標(biāo)記的特異性探針與蝴蝶蘭的組織切片雜交結(jié)合；(3) 根據(jù)標(biāo)記對原位雜交結(jié)果進(jìn)行檢驗(yàn)；所述的帶有標(biāo)記的特異性探針的序列為如SEQ IDN0.3所示序列的反義RNA鏈。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的利用原位雜交檢測P/^/CO丄基因在蝴蝶蘭植株組織中表達(dá)分布的 方法，其特征在于所述的標(biāo)記為地高辛、生物素、堿性磷酸酶、辣根過氧化酶或熒光素。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種蝴蝶蘭光周期相關(guān)基因PhalCOL的序列及其應(yīng)用，旨在提供一種PhalCOL基因、以及含有該基因的重組植物表達(dá)載體、含有重組植物表達(dá)載體的植物細(xì)胞系和植物轉(zhuǎn)化體，以及該基因在促進(jìn)植物營養(yǎng)生長和縮短開花時間中的應(yīng)用和應(yīng)用原位雜交檢測PhalCOL基因在蝴蝶蘭植株組織中表達(dá)分布的方法。本發(fā)明的PhalCOL基因是從蝴蝶蘭中克隆出來的，其全長共987bp，編碼328個氨基酸殘基的蛋白，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該基因能夠影響植株的發(fā)育，促進(jìn)植物營養(yǎng)生長和生殖生長，縮短開花時間。該基因?yàn)榛蚬こ谈牧贾参锏纳L進(jìn)程，對植物的花期進(jìn)行調(diào)控提供了有效的技術(shù)手段，具有廣泛的應(yīng)用前景和極大的經(jīng)濟(jì)價值。
文檔編號C12N15/29GK101638659SQ20091004230
公開日2010年2月3日 申請日期2009年8月31日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月31日
發(fā)明者吳坤林, 張建霞, 曾宋君, 俊 段 申請人:中國科學(xué)院華南植物園