一種改性滌綸材料的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種應(yīng)用于血液接觸的涂絕材料的制備方法，具體設(shè)及一種表面引入 具有親水性和負(fù)電荷多膚的涂絕材料的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 我國每年因屯、腦血管疾病死亡的人數(shù)有數(shù)百萬，約W30%的比例逐年增加，因此， 血管移植已成為關(guān)注的熱點(diǎn)。人造血管是目前臨床上最為緊缺的醫(yī)療器械，其中小口徑人 工血管的移植還是臨床空白，即便是中、大口徑人工血管，在我國產(chǎn)品也非常稀少，國產(chǎn)產(chǎn) 品每年的使用比例非常小，只有20%左右。保守估計(jì)，全球每年超過200萬（約60萬人小 口徑），我國每年約百萬患者需要進(jìn)行血管移植，所W研制具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的新型人工血 管材料尤其重要。
[0003] 目前，人工血管使用的原料主要為涂絕和聚四氣乙締運(yùn)兩種合成高分子材料，由 涂絕值acron)纖維織成的管狀人工血管己應(yīng)用于臨床，如治療主動(dòng)脈瘤、主動(dòng)脈狹窄等， 成功用于大血管置換。另一種國內(nèi)外臨床上應(yīng)用廣泛的大口徑人工血管由合成高分子聚四 氣乙締為原料經(jīng)注塑而成的，也被成功用于大血管置換。但運(yùn)兩種材料疏水性都很強(qiáng)，不利 于管內(nèi)壁內(nèi)皮化，組織相容性較差，有排異現(xiàn)象，易誘發(fā)血栓、表面沉積及炎癥，為了能夠較 長時(shí)間的防止血栓，患者還須終身服藥，5年后的通楊率約只有一半左右。由此可見，純的涂 絕和聚四氣乙締并不是最理想的人工血管材料，尤其不適用于臨床上空白的小口徑人工血 管的研制。
[0004] 如今，一些研究報(bào)導(dǎo)了用絲素蛋白溶液浸潰涂層多孔針織涂絕血管來減輕對(duì)異物 的反應(yīng)和促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞粘附，W及降低織物的滲水率（如中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)博±學(xué)位論 文：絲素蛋白涂層人工血管的研制）。為了提高聚四氣乙締材料人工血管的內(nèi)皮化，將骨髓 CD34+細(xì)胞種植于人工血管先行內(nèi)皮化后，再用于移植來改善通楊率（骨髓CD34+細(xì)胞人工 血管內(nèi)皮化實(shí)驗(yàn)研究，中華外殼雜志，2004)。也有將血管內(nèi)皮生長因子（VEG巧基因裝載于 聚四氣乙締材料中來促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的生長（聚四氣乙締人工血管材料作為VEGF基因載體 的可行性研究，浙江大學(xué)學(xué)報(bào)，2007)。另外在抗凝血性能方面，報(bào)導(dǎo)了肝素固化和共價(jià)水賠 素W提高抗凝和通楊性。
[0005] 絲素蛋白或者膠原蛋白涂層可W改善一定的細(xì)胞相容性，但對(duì)于血管移植物而 言，一定的親水性是組織得W修復(fù)非常重要的因素；另外，天然血管內(nèi)壁為一層負(fù)電荷內(nèi) 膜，有利于保護(hù)血液細(xì)胞和防止血栓形成，人工血管也應(yīng)該具有類似于天然血管的負(fù)電性 膜層。而絲素蛋白或者膠原蛋白涂層對(duì)運(yùn)些特性的改善是不穩(wěn)定的，因?yàn)榻z素蛋白或者膠 原蛋白溶液是一種分子量分布很廣的混合溶液，接枝上去的成分不是單一的多膚或蛋白分 子，有的不一定具有較好親水作用或電負(fù)性，加上接枝效率往往較低，不會(huì)得到凸顯優(yōu)異親 水性和負(fù)電性的表面。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 針對(duì)目前涂絕大口徑人工血管的臨床問題和不能應(yīng)用于小口徑人工血管制備的 根本問題，本發(fā)明旨在提供一種通過生物表達(dá)的多膚及其修飾的改性涂絕材料的制備方 法，制備出的改性涂絕屬于血液相容性材料，具有優(yōu)異的表面親水性和負(fù)電荷性，可W制備 應(yīng)用于與血液直接接觸的植入物（如人工血管、屯、臟修補(bǔ)片、人工屯、臟瓣膜等），有利于組 織愈合和抗凝固。
[0007] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明通過W下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0008] 一種改性涂絕材料的制備方法，包括如下步驟：
[0009] 步驟1)設(shè)計(jì)并構(gòu)建攜帶有具有親水性和負(fù)電荷多膚的基因的原核系統(tǒng)表達(dá)載體 (JournalofDon曲uaUniversity巧nglishEdition), 2012, 29:26-29);所述具有親水性 和負(fù)電荷多膚來自于生物體表達(dá)，為第一多膚FI、第二多膚F4或第Ξ多膚F8中的一種，其 多膚序列均來自于家蠶絲素蛋白中的一段類似物及其重復(fù)；所述第一多膚F1的氨基酸序 列如SE化ID.NO. 1，所述第二多膚F4的氨基酸序列如SE化ID.NO. 2,所述第S多膚F8的氨 基酸序列如沈化ID.NO. 3 ;
[0010] 步驟2)將已經(jīng)構(gòu)建好的攜帶有第一多膚FI、第二多膚F4或第Ξ多膚F8基因的原 核系統(tǒng)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染大腸桿菌度L21)細(xì)胞，用Luria-Bertani培養(yǎng)基經(jīng)異丙基-β-D-硫 代半乳糖巧誘導(dǎo)培養(yǎng)數(shù)小時(shí)；
[0011] 步驟3)收集并破碎上述大腸桿菌細(xì)胞，再經(jīng)過純化，獲得具有親水性和帶強(qiáng)負(fù)電 性的第一多膚F1、第二多膚F4或第Ξ多膚F8,并配制成一定濃度的功能多膚水溶液；
[0012] 步驟4)將涂絕經(jīng)氨氧化鋼處理后用去離子水清洗，再浸入上述功能多膚水溶液 中，加入交聯(lián)劑4°C過夜反應(yīng)，即得改性涂絕材料。
[0013] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有W下有益效果：
[0014] 本發(fā)明提供了一種通過生物表達(dá)多膚修飾的改性涂絕材料的制備方法，該方法中 所設(shè)及的多膚鏈側(cè)基含有大量的親水性基團(tuán)，多膚來自于生物體表達(dá)，序列來自于天然蛋 白質(zhì)的類似物，無毒無刺激性，分子量單一，能與涂絕共價(jià)結(jié)合，持續(xù)穩(wěn)定地賦予涂絕親水 性能和負(fù)電性。本發(fā)明制備出的改性涂絕屬于血液相容性材料，具有優(yōu)異的表面親水性和 負(fù)電荷性，可W制備應(yīng)用于與血液直接接觸的植入物（如人工血管、屯、臟修補(bǔ)片、人工屯、臟 瓣膜等），能夠降低對(duì)細(xì)胞的傷害，利于內(nèi)皮化，阻止蛋白沉積和血細(xì)胞聚集而造成血栓堵 塞，有利于組織愈合和抗凝固。
[0015] 上述說明僅是本發(fā)明技術(shù)方案的概述，為了能夠更清楚了解本發(fā)明的技術(shù)手段， 并可依照說明書的內(nèi)容予W實(shí)施，W下W本發(fā)明的較佳實(shí)施例詳細(xì)說明如后。
【具體實(shí)施方式】
[0016] 下面將結(jié)合實(shí)施例，來詳細(xì)說明本發(fā)明。
[0017] 一種改性涂絕材料的制備方法，可W通過如下實(shí)施例實(shí)施。在制備所述改性涂絕 材料之前，應(yīng)先設(shè)計(jì)并構(gòu)建攜帶有具有親水性和負(fù)電荷多膚的基因的原核系統(tǒng)表達(dá)載體 (JournalofDon曲uaUniversity巧nglishEdition), 2012, 29:26-29);所述具有親水性 和負(fù)電荷多膚來自于生物體表達(dá)，可W為第一多膚FI(其氨基酸序列如SEQ.ID.NO. 1)、第 二多膚F4 (其氨基酸序列如SE化ID.NO. 2)或第Ξ多膚F8(其氨基酸序列如SE化ID.NO. 3) 中的一種，其多膚序列均來自于家蠶絲素蛋白中的一段類似物及其重復(fù)。 陽ο化]實(shí)施例一：
[0019] 1、將攜帶有第一多膚F1基因的原核系統(tǒng)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染大腸桿菌度L21)細(xì)胞，涂 覆于含氨節(jié)青霉素的Luria-Bertani固體培養(yǎng)基，倒置放入37°C的生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)14~ 16小時(shí)；挑取單一菌落放入新鮮含氨節(jié)青霉素的4mL的Luria-Bertani液體培養(yǎng)基中，插 入振蕩速度20化/min的空氣搖床37°C振蕩培養(yǎng)8~10小時(shí)；將培養(yǎng)的菌液按1:100的比 例于1L含氨節(jié)青霉素的新鮮Luria-Bertani液體培養(yǎng)基中擴(kuò)增培養(yǎng)；當(dāng)菌液密度達(dá)ODe。。 =0. 3~1. 8時(shí)加入0~1. 2mM的異丙基-β-D-硫代半乳糖巧誘導(dǎo)培養(yǎng)1~8小時(shí)，4°C 離屯、收集菌細(xì)胞。
[0020] 2、將收集的菌細(xì)胞用谷脫甘膚轉(zhuǎn)移酶（GST)親和層析的結(jié)合緩沖液重懸混勻， 置于冰上超聲波破碎細(xì)胞、釋放蛋白質(zhì)；破碎完成后120(K)r/min、4°C離屯、lOmin收集含有 第一多膚F1的上清液；表達(dá)的含有第一多膚F1序列的蛋白是含有GST標(biāo)簽的融合蛋白 GST-Flo
[0021] 3、將含有GST-F1的上清液灌注GST親和層析柱，洗脫非特異性蛋白，用谷脫甘膚 洗脫并收集單一蛋白GST-F1，然后灌入G50的Se地adex分子篩層析柱去除谷脫甘膚；采用 凝血酶酶切融合蛋白GST-F1，切除標(biāo)簽GST釋放第一多膚F1，酶切后的混合溶液進(jìn)一步灌 注GST親和層析柱，收集流出液即獲得第一多膚F1溶液。
[0022] 4、將第一多膚F1溶液加入脫鹽柱脫凈溶液中的所有鹽成分，收集的第一多膚F1 水溶液立即用液氮凍結(jié)，然后置于冷凍干燥機(jī)干燥成第一多膚F1粉末；使用時(shí)根據(jù)需要配 置成一定濃度的水溶液。
[0023] 5、將涂絕洗凈室溫風(fēng)干，放入2g/L氨氧化鋼溶液中，95°C處理90分鐘；用去離子 水清洗后加入過量的碳二亞胺和N-徑基班巧酷亞胺，調(diào)節(jié)抑=5. 5,靜置1小時(shí)；將涂絕 再用去離子水清洗并制成直徑1. 5cm的圓片，加入0. 002μΜ的F1多膚水溶液500μLpH =7. 5,4°C過夜反應(yīng)；取出去離子沖洗，風(fēng)干。
[0024] 6、配置第一多膚F1的水溶液，采用Zeta電位儀測定得第一多膚F1的等電點(diǎn)為 3. 3,即第一多膚F1帶有大量的負(fù)電荷；第5步接枝第一多膚F1的涂絕水接觸角為49°， 比原始涂絕的水接觸角77.4°減小了