專利名稱：熱穩(wěn)定的酶用作飼料添加劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及將酶用作動(dòng)物飼料添加劑，具體地講涉及將熱穩(wěn)定的酶用作動(dòng)物飼料添加劑，以便在相對高溫的飼料加工期間該酶的活性不發(fā)生明顯的下降。本發(fā)明還提供了飼料添加劑及包含所述熱穩(wěn)定的酶的谷物基料飼料。
人們一直在追尋能使動(dòng)物高效消化其飼料的改進(jìn)飼料。主要的關(guān)注點(diǎn)之一是在不增加單位重量成本的前提下提高飼料轉(zhuǎn)換比率(FCR)。飼料的FCR是消耗的飼料是與動(dòng)物的增重的比值。低的FCR表示給定量的飼料導(dǎo)致生長動(dòng)物增重較多。這意味著動(dòng)物能更有效地利用飼料?？山档虵CR的途徑之一是通過改善動(dòng)物對其的可消化性，從而增加可使動(dòng)物增重的營養(yǎng)。
對飼料的營養(yǎng)成分，如淀粉、脂肪、蛋白質(zhì)和氨基酸的可消化性有各種限制。這些限制包括(i)動(dòng)物腸內(nèi)的物質(zhì)的粘性。所述的粘性是由于，至少部分是由于可溶的非—淀粉多糖，如混交聯(lián)β-葡聚糖和阿拉伯糖基木聚糖引起。
(ii)飼料的細(xì)胞壁對營養(yǎng)物的捕獲(entrapment)，特別是谷物的糊粉層的細(xì)胞壁對營養(yǎng)物的捕獲。所述的捕獲是由谷物的細(xì)胞壁里的大量的非淀粉多糖引起的，所述的谷物細(xì)胞壁相對地耐受動(dòng)物消化系統(tǒng)的裂解。這就防止了動(dòng)物對被捕獲在細(xì)胞內(nèi)的營養(yǎng)物的營養(yǎng)獲得；及(iii)動(dòng)物和腸微生物，尤其是在年幼動(dòng)物的內(nèi)源酶活性的缺乏。
防礙可消化性的上述問題在谷物基料食料，如那些小麥含量高的食料中尤為顯著。
由于飼料里的營養(yǎng)物的可消化性差的問題，有必要使飼料含有提供大量的能量和蛋白質(zhì)的物質(zhì)以便滿足動(dòng)物的營養(yǎng)需要。
現(xiàn)在基本上有證據(jù)證明，即在谷物基料的動(dòng)物飼料里摻入某些(補(bǔ)加的)酶可有利于降低動(dòng)物腸內(nèi)的物質(zhì)的粘性。這種降低可通過酶，如水解可溶木聚糖的木聚糖酶來實(shí)現(xiàn)，因而降低了是消化過程主要限制的消化物的粘性。
作為添加劑加入的木聚糖酶的目標(biāo)動(dòng)物胃腸道內(nèi)的pH和溫度條件下必須是穩(wěn)定的和有活性的。如果當(dāng)把它們暴露于活體外這樣的條件時(shí)，它們是不穩(wěn)定和無活性的，它們則不能使消化物粘性降至任何顯著的程度。目前已知將來自真菌，如Longibrachiatum木霉(Trichoderma Longibrachiatum)，黑色曲霉(Aspergillus niger)和insolens腐質(zhì)霉(Humicola insolens)的木聚糖酶作為添加劑應(yīng)用在動(dòng)物飼料中。
Bedford和Classen(The Journal of Nutrition，122卷，560-569頁)披露在適合煎烤的雛雞活體內(nèi)測得的消化物粘性和體重增重及FCR值之間顯著相關(guān)。在用小麥和黑麥基料食料喂養(yǎng)家禽時(shí)，表明多至70-80％的體重增重和FCR間的差異僅基于腸內(nèi)粘性的差異。這就突出了含有大量可溶性阿拉伯糖基木聚糖的谷物基料飼料的消化物粘性的重要性。當(dāng)消化物粘性增高時(shí)，通過妨礙胰酶、底物及消化過程的終產(chǎn)物的擴(kuò)散而降低所有營養(yǎng)物的可消化性。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在動(dòng)物飼料里包含木聚糖酶有助于牲畜降低消化物粘性。結(jié)果是，動(dòng)物消化飼料的能力得到了提高，動(dòng)物消耗單位量的飼料的體重增重得到了提高，且飼料的FCR得以降低。
傳統(tǒng)地通過將酶浸透到生理上可接受的載體，如谷物上而將酶添加劑，如木聚糖酶包含到動(dòng)物飼料中。被浸透的載體與飼料的基它組分混合，然后將其壓成可直接飼喂動(dòng)物的方塊或丸片飼料。
最近在將各種飼料組分加工成有形體如方塊和顆粒飼料方面有了很大進(jìn)展。所述的加工已發(fā)展為使用相對高的濕度。這首先提高了生產(chǎn)過程的效率，其次使生產(chǎn)出的飼料不含有害的細(xì)菌，尤其是沙門氏菌。另外，高溫的使用提高了所得方塊和顆粒飼料的質(zhì)量和耐久性，擴(kuò)大了可被有效地處理的成份的范圍，并且也增加了液體成份，如可被摻入到飼料中的脂肪和糖蜜的量。
當(dāng)前所用的加工技術(shù)對飼料組分的混合物施用相對的高溫達(dá)相對長的時(shí)間。而且，混合物在加工過程受相對的高壓，也有助于提高所形成的方塊和丸片飼料的耐久性。
已用來改善飼料的營養(yǎng)性質(zhì)的加工方法之一是蒸汽壓丸。該方法包括用蒸汽處理化合的飼料從增中它的溫度和濕度會(huì)含量的步驟。該步驟稱為調(diào)理。依據(jù)飼料的類型和組成，調(diào)理步驟持續(xù)幾秒到數(shù)分鐘。調(diào)理器內(nèi)的溫度可升至100℃。然后，使飼料通過壓丸模；由于摩擦，該模使其溫度迅速增高。
最近，為飼料的預(yù)處理或調(diào)理引入了新的裝置，稱為膨化器(expander)。該裝置允許在壓力下進(jìn)行調(diào)理，然后壓丸。按照本技術(shù)，將先前受蒸汽調(diào)理的各種飼料組分裝入注入了更多蒸汽的螺旋壓縮機(jī)內(nèi)，增高物料塊所受的壓力并進(jìn)行剪切，然后使之通過可變(大小)的出口。將壓縮的產(chǎn)物，在顆粒尺寸縮小后，裝入標(biāo)準(zhǔn)的壓丸機(jī)。
飼料組分在膨化器內(nèi)停留的時(shí)間為大約5-20秒，而溫度可高達(dá)145℃。壓縮壓力可達(dá)給3.5MPa，可很快建立所述的溫度和壓力且兩者在產(chǎn)物從出口被擠后可快速降低。
膨化器的使用是有利的，因它們能有效地去除有害細(xì)菌，尤其是沙門氏菌。而且，有可能在造料前在混合物中包含相對大量的脂肪和其它液體成份。另外，蒸煮和壓/切步驟導(dǎo)致較大量的淀粉凝膠的形成。
但是，這樣的高溫和高壓的加工條件，特別是當(dāng)用于在造粒過程中經(jīng)常遇到的潮濕條件下時(shí)，對某些飼料組分有潛在的破壞作用。這在酶，包括木聚糖酶存在時(shí)更甚。
已熟知，酶是蛋白質(zhì)，因此由氨基酸組成。氨基酸的特定順序，“一級結(jié)構(gòu)”決定了蛋白質(zhì)的性質(zhì)。然后氨基酸鏈可排列成許多“二級結(jié)構(gòu)”，如片層和螺旋。這些結(jié)構(gòu)也彼此相互組織起來得出“三級結(jié)構(gòu)”；例如，片層可彼此平行排列，很象報(bào)紙的紙頁。最后，在特定的酶里，幾個(gè)亞單位可結(jié)合在一起，這也導(dǎo)致了“四級結(jié)構(gòu)”。
如有功能，酶還須有活性位點(diǎn)，該位點(diǎn)能催化特定底物的反應(yīng)，該活性位點(diǎn)經(jīng)常具有特異的形狀，所述形狀由酶的一級、二級、三級、四級結(jié)構(gòu)決定。催化位點(diǎn)形狀的變化可能使酶失活。
有幾個(gè)因素，包括熱、壓力和pH，可改變酶的形狀而且也可改變其活性位點(diǎn)的形狀。在飼料的加工過程中，已存在于混合物中的任何酶將遭受使酶至少部分變性并因此而喪失一些或全部活性的溫度和壓力的影響。在加工過程中，酶所暴露的溫度越高，其活性下降的越多。典型地，嗜溫木聚糖酶在直至65℃時(shí)還是穩(wěn)定的，但如暴露于95℃至少在水溶液中全部活性喪失。
如在飼料加工過程中發(fā)生這樣的溫度介導(dǎo)的變性，當(dāng)然是極為不利的，因所加的酶將不會(huì)起到效果，或僅起到有限程度的效果?？朔@一問題的一個(gè)可能為在飼料里包含更相對大量的酶以便補(bǔ)償一定比例的失活。然而，從經(jīng)濟(jì)的觀點(diǎn)來說，添加這樣額外量的酶是不利的，因?yàn)閾脚c到動(dòng)物飼料中的酶相對來說是昂貴的。
有研究表明可通過將酶包被在特殊的載體上或用特殊的包被技術(shù)包被它們以穩(wěn)定酶。然而，這樣的方法還不能有效地應(yīng)付在高溫蒸汽壓丸、在膨化器中或在擠出機(jī)中遇到的相對劇烈的加工條件。
另一個(gè)解決辦法是將酶，如木聚糖酶加入到已經(jīng)熱處理過的預(yù)先形成的顆粒飼料中。然而，該方法不是理想的解決辦法，首先需要復(fù)雜而昂貴的機(jī)器以將酶精確包被到顆粒飼料上而得到所需的包入的相對量。其次，在所述的包被步驟中使用的酶的溶液具有有限的貯藏穩(wěn)定性，并且可被細(xì)菌污染。
因此，盡管可得到對飼料加工過程中的酶穩(wěn)定性問題部分解決的辦法，它們均不能以完全有效的形式解決該問題。
在下面的說明書及權(quán)利要求中，提到了木聚糖酶活力單位。本發(fā)明所用的所述活力由下面試驗(yàn)方法測量。
木聚糖酶活性的試驗(yàn)方法一個(gè)單位的木聚糖酶的活性為在下面所述的條件下在一分鐘內(nèi)使一微摩爾的還原糖(由木糖等同物表示)從底物中釋放出來的酶量。
試劑1.1％(W/V)的木聚糖底物向1.0g的木聚糖(Fluka 95590)中加入0.5M氫氧化鈉10ml。用磁力攪拌器混合30分鐘。加入大約40ml的0.05M，pH6.5的乙酸鈉緩沖液。用1M乙酸調(diào)節(jié)pH至6.5。用0.05M，pH6.5的乙酸鈉緩沖液加到100ml。當(dāng)使用時(shí)，應(yīng)一直混合底物。
2.1M乙酸用移液管將5.7ml冰乙酸加入有體積刻度的燒瓶中，并用蒸餾水補(bǔ)至100ml。
3.0.05M的乙酶鈉緩沖液，pH6.5A.將4.1g乙酸鈉用蒸餾水溶解，并用蒸餾水補(bǔ)至1000ml。
B.將3.0g冰乙酸用蒸餾水溶解，并用蒸餾水補(bǔ)至1000ml。
用溶液B調(diào)節(jié)溶液A的pH至pH6.5。
4.二硝基水楊酸(DNS)試劑將20.0g 3，5-二硝基水楊酸懸浮于大約800ml的蒸餾水中。邊連續(xù)攪拌邊逐漸加入300ml的氫氧化鈉溶液(32.0g的NaOH溶于300ml的蒸餾水)。邊攪拌邊在水浴(溫度不能超過+48℃)里溫?zé)嵩搼腋∫褐敝寥芤撼吻濉Ｖ饾u加入600g的酒石酸鉀鈉。如需要，溫?zé)嵩撊芤?溫度不能超過+48℃)直至溶液澄清。
用蒸餾水補(bǔ)至2000ml并用粗燒結(jié)下的玻璃過濾器過濾。
于室溫在黑色的瓶中貯存。該試劑最多穩(wěn)定6個(gè)月。
步驟1.酶樣品在50℃校準(zhǔn)1ml的酶稀釋液(在0.05M的乙酸鈉緩沖液里，pH6.5)。加入1ml的木聚糖底物攪拌并在50℃精確溫浴30分鐘。加入3ml的DNS試劑，攪拌并煮沸反應(yīng)混合物達(dá)5分鐘。將反應(yīng)混合物在冷水浴中冷卻至室溫，并以蒸餾水為對照在540nm測吸光度。
2.酶空白將1ml木聚糖底物在+50℃溫育30分鐘。加入3ml的DNS試劑并攪拌。加入1ml的酶稀釋液(在0，05M的乙酶鈉緩沖液里，pH6.5)并攪拌。煮沸混合物達(dá)恰好5分鐘。將反應(yīng)混合物在冷水浴中冷卻至室溫，并以蒸餾水為對照在540nm測吸光度。
酶樣品和酶空白之間的吸光度的差異應(yīng)為3.0-0.5。
3.標(biāo)準(zhǔn)曲線用0.05M乙酸鈉緩沖液，pH6.5制備無水木糖的標(biāo)準(zhǔn)溶液。標(biāo)準(zhǔn)溶液的木糖濃度應(yīng)為0.05-0.5mg/ml。用移液管移取1ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液、1ml的木聚糖底物和3ml的DNS試劑加到試管中。攪拌并煮沸達(dá)恰好5分鐘。在冷水浴中冷卻至室溫并以標(biāo)準(zhǔn)空白為對照在540nm測吸光度。在標(biāo)準(zhǔn)空白中，木糖溶液以1ml的0.05M的乙酸鈉緩沖液，pH6.5來替代。在其它方面，標(biāo)準(zhǔn)空白象木糖標(biāo)準(zhǔn)那樣進(jìn)行處理。
繪制木糖濃度對吸光度的函數(shù)曲線。對每一新的DNS-試劑制作新的標(biāo)準(zhǔn)曲線。計(jì)算按照下式計(jì)算樣品的木聚糖酶的活力 其中A(X)＝酶樣品的吸光度A(O)＝酶空白的吸光度k＝標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率Ce＝木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的截距1000＝因子，mmol-＞μmolDf＝稀釋因子(ml/g)MWxyl＝木糖的分子量(150.13mg/mmol)t＝反應(yīng)時(shí)間(30分鐘)基于上述考慮，本發(fā)明的目的之一在于提供木聚糖酶用作動(dòng)物的飼料的添加劑，當(dāng)其被暴露于相對高溫的加工技術(shù)能基本上保持它的全部活性。
因此，本發(fā)明提供將熱穩(wěn)定的木聚糖酶用作動(dòng)物飼料添加劑，所述木聚糖酶的特征為能耐受1分鐘的調(diào)至95℃的水浴加熱而基本上不喪失其活性；所述的活性由其在pH6.5和40℃的溫度下使1％的小麥阿拉伯糖基木聚糖溶液的粘度降至與未加熱對照相同的終粘度±0.0001帕斯卡秒的能力而確定的。
優(yōu)選地，木聚糖酶能在pH6.5和40℃的溫度下使1％的小麥阿拉伯糖基木聚糖溶液的粘性降至與未加熱對照相同的終粘度±0.005帕斯卡秒。
上面概述的木聚糖酶活性試驗(yàn)是用小麥阿拉伯糖基木聚作為粘性底物在模擬發(fā)現(xiàn)于動(dòng)物的胃腸道的那些條件下在活體外的粘性—降低試驗(yàn)。在關(guān)于木聚糖酶(或木聚糖酶的混合物)在用作動(dòng)物飼料的添加劑時(shí)是否具有所需的降低消化物粘性的作用時(shí)，在活體外的這樣的試驗(yàn)起到了指導(dǎo)作用。
用于測量木聚糖酶降低粘性的能力的粘性—降低試驗(yàn)的詳細(xì)情況如下。在所有情況下，試驗(yàn)均設(shè)重復(fù)。
用具有pH6.5的0.1M的磷酸鈉緩沖液稀釋需試驗(yàn)的木聚糖酶以便調(diào)整木聚糖酶的濃度，使所得的溶液具有每ml 1.0單位的木聚糖酶活。按照上述所詳細(xì)描述的木聚糖酶活力的試驗(yàn)方法測定木聚糖酶的活力。
將100μl的酶溶液加入玻璃試管內(nèi)的400μl溶于0.1M磷酸鈉，pH6.5的小麥阿拉伯糖基木聚糖溶液，使所得溶液的酶的終濃度為0.2U/ml，和小麥阿拉伯糖基木聚糖的終濃度為1.0％w/w。
然后將含有溶液的試管封住并置于調(diào)至95℃的水浴中一段時(shí)間，典型1分鐘或5分鐘。該熱處理后，試管在冰水浴里冷卻。20分鐘后，用每秒鐘測一次粘性的Brookfield DV-II，CP40粘度計(jì)在40℃的溫度下測所得溶液的粘度。
根據(jù)本發(fā)明用熱穩(wěn)定性的木聚糖酶作為動(dòng)物飼料的添加劑具有的好處是在它與其它組分結(jié)合后，木聚糖酶的活性基本上不減小且易于進(jìn)行傳統(tǒng)的飼料加工，如用膨化器或擠出機(jī)。
可從合適的來源獲取用于本發(fā)明的熱穩(wěn)定的木聚糖酶。一般從微生物，優(yōu)選從真菌細(xì)菌中獲取熱穩(wěn)定的木聚糖酶。產(chǎn)生用于本發(fā)明的熱穩(wěn)定的木聚糖酶的細(xì)菌生物包括古細(xì)菌(Archaebacteria spp.)；芽孢桿菌(Bacillus spp.)，尤其是嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus)；熱纖維菌(Caldocellum spp.)尤其是解糖熱纖維菌(Caldocellum saccharolyticum)；纖維單孢菌(Cellulomonas spp.)；梭狀芽孢桿菌(Clostridium spp.)，尤其是丙酮丁醇梭狀芽孢桿菌(Clostridium acetobutylicum)；Dictyoglomus spp.；真桿菌(Eubacterium spp.)，尤其是thermotoga真桿菌(Eubacteriumthermotoga)；灰色腐質(zhì)霉菌thermoidea變種(Humicola grisea Var.thermoidea)；Malbranchia spp.，尤其是Malbranchia cinnamonmea及Mallbranchia var.Sulfurea；毀絲霉菌(Myceliopthora spp.)，尤其是嗜熱毀絲霉菌(Myceliophtora thermophilum)；紅棲熱菌(Rhodothermus spp.)，尤其是海生紅棲熱菌(Rhodothermus marinus)；裂褶菌(Schizophyllum spp.)，Scotothermus spp.；糖單孢菌(Saccharomonospora spp.)；孢子絲菌(Sporotrichum spp.)；鏈霉菌(Streptomyces spp.)；棲熱菌(Thermus spp.)；熱厭氧細(xì)菌(Thermoanaerobacter spp.)，尤其是解糖熱厭氧細(xì)菌(Thermoanaerobactersaccharlyticus)；熱子囊菌(Thermoascus spp.)，尤其是橙色子囊菌(Thermoscusauranticus)；熱菌絲菌(Thermomyces spp.)，尤其是疏棉狀毛熱子囊菌(Thermoascuslanuginosus)；熱單孢菌(Thermomonospora spp.)；和馬杜拉放線菌(Actinomadura spp.)根據(jù)本發(fā)明真菌生物也是優(yōu)選的木聚糖酶的來源。具體地講，根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生熱穩(wěn)定的木聚糖酶的真菌包括盛泡曲霉；煙曲霉；和構(gòu)巢曲霉。更優(yōu)選產(chǎn)生木聚糖酶的褐色熱單孢菌(Thermomonospora fusca)和鋸齒小四孢菌(Microtetraspora flexuosa)。
Irwin等在Applied and Enviromental Microbiology，60卷，763-770頁(1994)提供了來自褐色熱單孢菌(Thermomonospora fusca)的木聚糖酶的特征及氨基酸序列?？砂凑毡绢I(lǐng)域已知的方法進(jìn)行褐色熱單孢菌(Thermomonospora fusca)的發(fā)酵以生產(chǎn)用于本發(fā)明的熱穩(wěn)定的木聚糖酶。例如，Rothlisberger等在AppliedMicrobiological.Biotechnology，37卷，416-419頁(1992)及在EP-A-0 473545中描述了適當(dāng)?shù)陌l(fā)酵步驟。當(dāng)提供了在文獻(xiàn)中描述的來自褐色熱單孢菌(Thermomonospora fusca)的木聚糖酶的生化特征時(shí)，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可按照本領(lǐng)域已知的任何方法對所產(chǎn)生的熱穩(wěn)定的木聚糖酶進(jìn)行純化。
來自鋸齒小四孢菌(Microtetraspora flexuosa)的熱穩(wěn)定的木聚糖酶的分離詳細(xì)描述于下。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)從鋸齒小四孢菌(Microtetraspora flexuosa)中可分離出5種不同的熱穩(wěn)定的木聚糖酶。這些木聚糖酶以下被分別稱為木聚糖酶1-5。這些木聚糖酶已被純化為由銀染等電聚焦電泳測得的勻質(zhì)。通過離子交換層析和疏水反應(yīng)層析的結(jié)合進(jìn)行木聚糖酶的純化。每種純化的木聚糖酶在寬的pH范圍內(nèi)其特征均為熱穩(wěn)定的。特別地，在pH 6-9的范圍內(nèi)每種木聚糖酶均保留了大于80％的活性。
木聚糖酶的特征進(jìn)一步分析如下。木聚糖酶1具有約33,100道爾頓的分子量，約8.5的pI，且在pH7.0-7.5的范圍內(nèi)，在70℃的溫度下具有最大的活性。木聚糖酶2具有大約13,300道爾頓的分子量，約7.5的pI，且在pH7.0-7.5的范圍內(nèi)在約65℃的溫度下具有最大的活性。木聚糖酶3具有約31,000道爾頓的分子量，約6.2的pI，且在pH約7.5和約65℃的溫度下具有最大的活性。木聚糖酶4具有約50,000道爾頓的分子量，約5.8的pI，且在pH約7.5和約65℃的溫度下具有最大的活性。木聚糖酶5具有約35,000道爾頓的分子量，約5.3的pI，且在pH約7.5和約70℃的溫度下具有最大的活性。
鋸齒小四孢菌(Microtetraspora flexuosa)的木聚糖酶可根據(jù)本發(fā)明以所有5種木聚糖酶的混合物，使用即以木聚糖酶上清液的全部獨(dú)自使用，也可以其任意結(jié)合而使用。對那些可用于本發(fā)明的可從其它真菌或細(xì)菌源獲得的其它的熱穩(wěn)定的木聚糖酶來說也是一樣的。制備用于本發(fā)明的木聚糖酶的另一途徑是通過重組DNA技術(shù)構(gòu)建能產(chǎn)生所需的熱穩(wěn)定的木聚糖酶的合適的宿主微生物。因此可以受遺傳操縱，如將編碼熱穩(wěn)定的木聚糖酶的基因包含到宿主細(xì)菌或真菌菌株中的宿主中獲得木聚糖酶。
來自鋸齒小四孢菌(Microtetraspora flexuosa)的木聚糖酶1-5可從保藏于ATCC，Bethesda，ND，USA(此處易于得到菌株)的ATCC35864號菌株中產(chǎn)生。新的木聚糖酶的分離包括依據(jù)所純化的木聚糖酶通過離子交換層析(IEC)和疏水反應(yīng)層析(HIC)的任意順序的結(jié)合進(jìn)行的細(xì)胞外木聚糖酶的純化。
對來自鋸齒小四孢菌(Microtetraspora flexuosa)的5種化學(xué)上明顯區(qū)別的木聚糖酶的分離和特征分析的兩種純化方法如下。在兩種方法中，均通過離心除去鋸齒小四孢菌(Microtetraspora flexuosa)細(xì)胞，用超過濾濃縮培養(yǎng)基肉湯。在第一方法中，木聚糖酶1(pI8.5)、木聚糖酶2(pI7.5)、和木聚糖酶4(pI5.8)被分離并純化。不含細(xì)胞的完全培養(yǎng)基肉湯制備物中加到陰離子交換柱中，用提高鹽(NaCl)梯度的溶液洗滌和洗脫。收集級分后，用remazol亮藍(lán)染的樺木木聚糖試驗(yàn)(RBB-木聚糖試驗(yàn))測量木聚糖酶的活性。柱中的木聚糖酶1和木聚糖酶2被突然洗脫。收集突然的洗脫物并從新上樣到疏水反應(yīng)柱(苯基瓊脂糖)。通過用提高乙二醇的濃度進(jìn)行洗脫將木聚糖酶1和木聚糖酶2分離開。木聚糖酶4與陰離子交換柱相結(jié)合，以與其它結(jié)合的木聚糖酶(木聚糖酶3和5)的鹽梯度洗脫。通過HIC將木聚糖酶4與其它木聚糖酶分離開。該分離更詳細(xì)地描述于下面的實(shí)施例1。通過等電聚焦和質(zhì)譜(MS)或十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)對純化的木聚糖酶1、2和4進(jìn)行進(jìn)一步的分析。
在第二方法中，作為第一步對上面在所述的不含細(xì)胞的完全培養(yǎng)基肉湯進(jìn)行HIC來純化木聚糖酶3(pI6.2)和木聚糖酶5(pI5.3)。兩種木聚糖酶在相同的硫酸銨濃度下共洗脫出來。為將木聚糖酶3和木聚糖酶5彼此分離開，對收集的洗脫的活性酶物質(zhì)進(jìn)行了IEC。木聚糖酶3比木聚糖酶5以較低的鹽濃度從陰離子交換柱中被洗脫出來。首先用等電聚焦和MS或SDS-PAGE對兩種純化的木聚糖酶進(jìn)行特征分析。
每種木聚糖酶通過其獨(dú)特的生化特征，如分子量、pI、最適溫度和pH、疏水性和溫度穩(wěn)定性而與其它酶相區(qū)別。所有的5種木聚糖酶可耐受直至90℃的高溫和在pH7.0-10.0范圍內(nèi)的堿性條件。這5種純化的木聚糖酶在80℃的半衰期為30分鐘到110分鐘內(nèi)變化。在下面的參考例2中進(jìn)一步描述了5種純化為勻質(zhì)的木聚糖酶特征。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面提供了包含生理上可接受的載體和熱穩(wěn)定的木聚糖酶的飼料添加劑，所說的木聚糖酶的特征為能耐受1分鐘的調(diào)至95℃的水浴加熱而基本上不喪失其活性；所述的活性由其在pH6.5和40℃的溫度下使1％的小麥阿拉伯糖基木聚糖溶液的粘度降至與未加熱的對照相同的終粘度±0.001帕斯卡秒的能力而確定的。
按照該方面，熱穩(wěn)定的木聚糖酶可以是前面所述的木聚糖酶任何一種或木聚糖酶的任意混合物。因此，優(yōu)選從鋸齒小四孢菌(Microtetraspora flexuosa)或褐色熱單孢菌(Thermomonospora fusca)獲得的木聚糖酶。
本發(fā)明該方面的生理學(xué)上可接受的載體優(yōu)選谷物或谷物的衍生物。所述的谷物包括粉碎的小麥、玉米、大豆、糖、淀粉或任何這些物質(zhì)的副產(chǎn)物。所述的這些載體在本技術(shù)領(lǐng)域中是慣用的，因此不再詳細(xì)描述。
根據(jù)本發(fā)明的該方面的飼料添加劑與其它飼料組分結(jié)合來產(chǎn)生谷物基料飼料。所述的其它飼料組分包括一種或多種具有其它的(優(yōu)選熱穩(wěn)定的)酶添加劑、維生素飼料添加劑、礦物質(zhì)飼料添加劑和氨基酸飼料添加劑。所得的(結(jié)合的)可能包含幾種不同類型化合物的飼料添加劑可以適當(dāng)?shù)牧颗c其它飼料組分如谷物和蛋白質(zhì)添加劑相混合來形成動(dòng)物飼料。用目前使用的加工設(shè)備如雙造粒機(jī)、蒸汽造粒機(jī)、膨化機(jī)或擠出機(jī)將這些化合物加工成動(dòng)物飼料。
在所得的從谷物基料里存在熱穩(wěn)定的木聚糖酶具有降低其FCR的效果。木聚糖酶可選擇地或額外地增加谷物基料飼料的可消化性。而且，包含的木聚糖酶可額外地或選擇地增加動(dòng)物消耗單位量的飼料的體重增重比率。
本發(fā)明在另一方面提供了含有至少20％重量的谷物、及每kg飼料含0.00001g-10g熱穩(wěn)定的木聚糖酶蛋白質(zhì)的谷物基料飼料，所述的木聚糖酶的特征為能耐受1分鐘的調(diào)至95℃的水浴的加熱而基本上不喪失其活性；所說的活性由其在pH6.5和40℃的溫度下使1％的小麥阿拉伯糖基木聚糖溶液的粘度降至與未加熱的對照相同的終粘度±0.001帕斯卡秒的能力而確定的。
在本發(fā)明的該方面，熱穩(wěn)定的木聚糖酶可以是前面所述的熱穩(wěn)定的木聚糖酶的任何一種或其任意混合物。具體地講，木聚糖酶可以從鋸齒小四孢菌(Microtetraspora flexuosa)或褐色熱單孢菌(Thermomonospora fusca)中獲得。在所述的谷物基料飼料中，谷物優(yōu)選至少是小麥、大麥、玉米、高梁、黑麥、燕麥、黑小麥和稻子之一。更優(yōu)選谷物為小麥。
谷物基料飼料按照本發(fā)明可供給動(dòng)物如火雞、鵝、鴨、綿羊和奶牛。然而優(yōu)選飼料供給豬或家禽，特別是煎烤用的雛雞。
谷物基料飼料優(yōu)選每千克飼料包含0.00001-1g的木聚糖酶蛋白質(zhì)，而最優(yōu)選0.001-0.1g/kg。
谷物基料飼料含有至少20％重量的谷物。更優(yōu)選地，它應(yīng)包含至少30％重量的谷物，而最優(yōu)選至少50％重量的谷物。谷物可以是前面所提到的那些中任何種類，而小麥?zhǔn)翘貏e優(yōu)選的。
雖然谷物基料飼料的谷物組分構(gòu)成了蛋白質(zhì)的來源，通常在飼料里須包含補(bǔ)加的蛋白質(zhì)的來源，如從魚膳食、肉膳食或蔬菜里產(chǎn)生的那些。蔬菜蛋白質(zhì)的來源包括至少全脂大豆、油菜籽、canola、大豆膳食、油菜子膳食和canola膳食之一。與傳統(tǒng)的飼料相比，通過采用本發(fā)明的教導(dǎo)，可以減少補(bǔ)加的蛋白質(zhì)如魚膳食、肉膳食或蔬菜蛋白質(zhì)的相對量，這也就導(dǎo)致了成本的顯著節(jié)省。這是因?yàn)楣任锏南鄬Τ杀久黠@低于傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)添加劑的成本。鑒于此，按照本發(fā)明的教導(dǎo)可制備與傳統(tǒng)飼料相比在可得到的能量、氨基酸和蛋白質(zhì)方面具有相同營養(yǎng)價(jià)值但可包含較大量的谷物和較少比例的蛋白質(zhì)添加劑的飼料。還發(fā)現(xiàn)在動(dòng)物飼料中包含熱穩(wěn)定的木聚糖酶具有減少為使飼料具有一定的功能水平而需在飼料中包含的能量添加劑如脂肪和油的量的效果。
根據(jù)本發(fā)明在動(dòng)物飼料中包含熱穩(wěn)定的木聚糖酶能提高飼料的粗蛋白值和/或可消化性和/或氨基酸含量和/或消化系數(shù)，這使得以前必須在動(dòng)物飼料中包含的可選擇的蛋白質(zhì)源和/或氨基酸添加劑的補(bǔ)交量得以減少。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的消化系數(shù)和/或小麥的可利用的粗蛋白的含量通過熱穩(wěn)定的木聚糖酶的加入得以提高時(shí)，發(fā)現(xiàn)可大大減少傳統(tǒng)上需加入的蛋白質(zhì)和/或能量添加劑的量。或者，通過熱穩(wěn)定的木聚糖酶的加入，僅當(dāng)氨基酸含量或消化系數(shù)值得以提高時(shí)，發(fā)現(xiàn)可大大減少傳統(tǒng)上需加入到飼料中的氨基酸添加劑的量。
本發(fā)明的提供的飼料也可包含其它的酶添加劑，如β-葡聚糖酶、葡糖淀粉酶、甘露聚糖酶、α-半乳糖苷酶、肌醇六磷酸酶、脂酶、α-阿拉伯呋喃糖苷酶、蛋白酶、α-淀粉酶和果膠酶。特別優(yōu)選包含蛋白酶作為另外的酶添加劑，如從桿菌中產(chǎn)生的枯草桿菌蛋白酶。這樣的枯草桿菌蛋白酶作為實(shí)施例在US-A-4,760,025中有詳細(xì)描述。
通過制備含生理上可接受的載體和熱穩(wěn)定的木聚糖酶的飼料添加劑，及然后將該添加劑從每千克0.01-50g，更優(yōu)選0.1-10g/kg和最優(yōu)選的1g/kg的量與其它組分混合組成動(dòng)物飼料(包括谷物和其它的蛋白質(zhì)添加劑來源)來得到根據(jù)本發(fā)明的適當(dāng)?shù)娘暳稀?br> 以下提供了對說明書包含的3幅附圖逐一進(jìn)行的簡要說明。


圖1描述來自鋸齒小四孢菌(Microtetraspora flexuosa)的5種純化的木聚糖酶的活性pH曲線圖。
圖2描述來自鋸齒小四孢菌(Microtetraspora flexuosa)的5種純化的木聚糖酶的活性溫度曲線圖。
圖3表示來自鋸齒小四孢菌(Microtetraspora flexuosa)的5種純化的木聚糖酶的溫度穩(wěn)定性曲線圖。
通過下面的參考例和實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的闡釋。
參考例1由鋸齒小四孢菌(Microtetraspora flexuosa)產(chǎn)生的5種木聚糖酶的純化木聚糖酶試驗(yàn)用remazol亮藍(lán)染的樺木木聚糖(RBB-木聚糖)底物(Megazyme，Australia是底物供貨商)來測定木聚糖酶的存在。200ml的樣品與250ml的底物溶液(溶于50mMpH6.5的檸檬酸鈉，2％(W/V)RBB-木聚糖)相混合并于37℃溫浴10分鐘。通過加入1ml95％的乙醇將未被消化的木聚糖沉淀出來并離心除去。用分光光度法(OD590)定量釋放出的留于溶液中的染料，以乙醇為空白，染料量與木聚糖酶的活性成比例?？捎脴?biāo)準(zhǔn)曲線定量活性并以XAU/ml(每毫升的木聚糖酶活性單位)來表示。
用RBB-木聚糖底物還建立了用以檢測多種木聚糖酶存在和檢測其等電點(diǎn)(pI)的凝膠覆蓋的方法。以融化的瓊脂糖/底物懸浮液(溶于50mM檸檬酸鈉pH6.5的4％(W/V)瓊脂糖，7mg/ml RBB-木聚糖，0.5％(V/V)甘油)覆蓋等電聚焦(IEF)凝膠(pH梯度3-9)并于37℃溫浴。約1小時(shí)后在清亮的區(qū)域木聚糖酶活性顯現(xiàn)。使凝膠完全干燥并可貯存。與同樣條件下跑的含銀染的pI標(biāo)準(zhǔn)IEF凝膠相比來確定木聚糖酶pI。樣品用超過濾(Amicon攪拌—池，350ml，PM-10膜)將不含細(xì)胞的鋸齒小四孢菌(Microtetraspora flexuosa)ATCC 35864發(fā)酵肉湯上清液濃縮5倍。將所有的樣品無菌過濾。通過BCA方法(Pierce)測蛋白質(zhì)濃度為12.5mg/ml。凝膠覆蓋分析測了5種木聚糖酶，pI8.5，7.5，6.2，5.8，及5.3有存在。該5種木聚糖酶在本文說明書中被分別稱為木聚糖酶1-5。
純化方法離子交換層析(IEC)和疏水反應(yīng)層析(分別為IEC和HIC)相結(jié)合用來分析所有的5種木聚糖酶如下木聚糖酶1和2的純化做為第一步，用IEC來純化木聚糖酶1和2。將濃縮的樣品對10mM tris-HCL，pH 9.0(緩沖液A)進(jìn)行徹底透析。將50ml加到用Pharmacia FPLC系統(tǒng)從72ml Q-瓊脂糖HP(Pharmacia)包被的從1ml/2分鐘的緩沖液A校準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn)層析柱(PharmaciaC 16/40)中。用50ml的緩沖液A洗滌該柱，然后用400ml線性增加鹽度梯度，緩沖液A到溶于緩沖液A的0.25M NaCl進(jìn)行洗脫。用溶于緩沖液A的2MNaCl洗滌柱子中繼續(xù)結(jié)合的蛋白質(zhì)。收集10ml的級分并如前所述進(jìn)行試驗(yàn)。
木聚糖酶1和2隨最初的液流從柱子中一起被洗脫出來而大部分的蛋白質(zhì)繼續(xù)與柱子結(jié)合。(木聚糖酶1和2代表未與柱子結(jié)合的級分)。
作為第二步用疏水反應(yīng)層析(HIC)來純化和分離木聚糖酶1和2。集合活性級分且通過加入2M的硫酸銨而使硫酸銨的終濃度達(dá)0.2M。加入50mM的檸檬酸鈉pH6.5使終濃度為10mM，并將材料(約100ml)加到標(biāo)準(zhǔn)層析柱(Pharmacia C 16/20)中，所述的標(biāo)準(zhǔn)層析柱是用36ml的苯基瓊脂糖CL-4BC Pharmacia)包被的，用0.2M硫酸銨-10mM檸檬酸鈉，pH6.5(緩沖液B)以0.5ml/分鐘校準(zhǔn)的。用60ml緩沖液B洗滌柱子，然后如下洗脫從逐步降低鹽濃度至10mM的檸檬酸鈉，pH6.5(緩沖液C)70ml，在緩沖液C中逐步降低至10％(V/V)的聚乙二醇(EG)50ml，用200ml的線性梯度10-32％的EG，以32％的EG80ml洗滌，用150ml梯度32-38％的EG和最終逐步升高到50％的EG 70ml徹底洗滌柱子。收集10ml的級分并進(jìn)行上述試驗(yàn)。在這些條件下，勻質(zhì)的木聚糖酶2被32％的EG洗脫而勻質(zhì)的木聚糖酶1被32-38％的EG梯度的尾端洗脫。木聚糖酶4的純化用前面所述的純化木聚糖酶1和2的第一步(IEC)，木聚糖酶4和5在0.16M溶于緩沖液A中的NaCl而被同時(shí)洗脫出來。集合活性級分并如上所述使其為0.4M硫酸銨-10mM檸檬酸鈉，pH6.5(緩沖液D)。將材料，約100ml，以1kml/分鐘加上前面描述的已用緩沖液D校準(zhǔn)的HIC柱中。柱子以50ml緩沖液D洗滌，并以線性梯度由緩沖液D至C130ml，緊接著以線性梯度由緩沖液C至50％的EG200ml洗脫。收集10ml的級分并進(jìn)行上述試驗(yàn)。木聚糖酶4被約20％的EG洗脫。木聚糖酶3和5純化在木聚糖酶3和5的情形下，HIC用作第一步。通過加入2M的硫酸銨而使?jié)饪s樣品具有溶于緩沖液C的0.5M的硫酸銨及50mM的檸檬酸鈉，pH6.5(如前所述)。將材料過濾以除去任何痕量的沉淀，并將50ml以1ml/分鐘加到前面所述的用溶于緩沖液C中的0.5M的硫酸銨(緩沖液E)校準(zhǔn)的HIC柱中。接下來以87.5ml的緩沖液E洗滌柱子，然后用線性梯度由緩沖液E至緩沖液C的147ml洗脫。收集10ml的級分并進(jìn)行上述試驗(yàn)。在約0.05的硫酸銨處木聚糖酶3和5被共洗脫出來。
用IEC來分離純化木聚糖酶3和5。集合活性的HIC級分(70ml)，以10mMTris-HCL pH8.0(緩沖液F)進(jìn)行完全透析并用前面所述的方法濃縮至約20ml。將材料以1ml/分鐘加到前面所述的已用緩沖液F校準(zhǔn)的IEC柱中。柱子以150ml的緩沖液F洗滌并以線性梯度由緩沖液F至溶于緩沖液F的0.25M NaCl 150ml洗脫。收集10ml的級分并進(jìn)行如上所述的試驗(yàn)。木聚糖酶3在約0.05M NaCl處被洗脫而木聚糖酶5在約0.15M NaCl處被洗脫。
參考例2由鋸齒小四孢菌(Microtetraspora flexuosa)產(chǎn)生的5種木聚糖酶的特征分析純化后，按照下述步驟對每種木聚糖酶進(jìn)行等電聚焦和分子量測定。木聚糖酶的生化特征分析結(jié)果列于表1。
用PhastSystem(Pharmacia Biotech)按照廠家的說明進(jìn)行等電聚焦。用于pI測定的標(biāo)志為寬譜pI試劑盒pH3.5-9.3(Pharmacia Biotech)。由PhastSystem建立的銀染，按照說明，使蛋白質(zhì)顯現(xiàn)。
用兩種方法完全分子量的測定二十烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和質(zhì)譜分析(MS)。用前面所述的Phast系統(tǒng)進(jìn)行SDS-PAGE和后來的通過銀染的蛋白質(zhì)顯現(xiàn)。所用的分子量標(biāo)準(zhǔn)購自Sigma Chemical Co.(St.Louis，MO)。質(zhì)譜分析由Charles Evans及Associates(301 Chesapeake Drive，Redwood City，CA94063)來完成。
表1鋸齒小四孢菌(Microtetraspora flexuosa)木聚糖酶
除了依據(jù)所測的pH的范圍，即pH4.5-12.0而改變緩沖液外，用前面所述的RBB試驗(yàn)測定最適pH(參見圖1)。為試驗(yàn)選定的pH制備適當(dāng)?shù)木彌_液應(yīng)在本領(lǐng)域的技術(shù)人員的能力之內(nèi)。
溫度穩(wěn)定性代表在給定的溫度下還剩一半活性的時(shí)間。在約18-37℃測量活性。將樣品在給定的溫度下溫浴并用RBB試驗(yàn)測活性。半衰期是半數(shù)活性喪失的分鐘數(shù)。(參見圖3)。
最適溫度是發(fā)現(xiàn)活性最高時(shí)的溫度。圖2表示用RBB試驗(yàn)測量的木聚糖酶1-5的溫度曲線。在圖1和2中，％最大的活性與最高活性測量值相應(yīng)，并將其值定為100％，而其它所有的數(shù)值均是相對于該標(biāo)準(zhǔn)而測得的。實(shí)施例1按照上面詳細(xì)描述的粘性降低試驗(yàn)測試來自鋸齒小四孢菌(Microtetrasporaflexuosa)的木聚糖酶1-5，來自褐色熱單孢菌(Thermomonospora fusca)的木聚糖酶TfxA和從綠色木霉(Trichoderma viride)及黑曲霉中得到的木聚糖酶以確定其降低小麥阿拉伯糖基木聚糖底物的粘性的相對能力。對每一個(gè)酶組合物，均測定其末經(jīng)熱處理(對照)和分別經(jīng)1分鐘和5分鐘的95℃水浴的熱處理后的粘度。這些試驗(yàn)的結(jié)果總結(jié)于表2。
表2
從上面的結(jié)果可以看出將所有的木聚糖酶或木聚糖酶的混合物暴露于95℃的溫度中5分鐘明顯降低于木聚糖酶的活性，所述的活性由粘性降低試驗(yàn)測量。然而，還注意到在第1和第2木聚糖酶暴露于95℃1分鐘后所測得的粘性與對照差異不顯著，但均在±0.001帕斯卡·秒的范圍內(nèi)。另一方面，很顯然來自綠色曲霉(T.viride)和黑曲霉(A.niger)的木聚糖酶與用于本發(fā)明的熱穩(wěn)定的木聚糖酶相比對熱更敏感。實(shí)施例2按照實(shí)施例1所用的粘性降低試驗(yàn)測試得自鋸齒小四孢菌(Microtetrasporaflexuosa)的木聚糖酶1和2的熱穩(wěn)定性。與實(shí)施例1相同，對每種木聚糖酶均設(shè)對照，所述的對照不經(jīng)任何熱處理。按照在95℃的水浴中對酶加熱1分鐘和5分鐘的方式進(jìn)行兩種熱處理。該試驗(yàn)的結(jié)果總結(jié)于表3。表3
從表3所列的結(jié)果可以看出由暴露于95℃1分鐘后的木聚糖酶1和木聚糖酶2所測的粘性均在對照粘性的0.00006帕斯卡·秒以內(nèi)。因此，很明顯這兩種木聚糖酶均不因95℃熱處理1分鐘其活性而基本減小。
權(quán)利要求
1.熱穩(wěn)定的木聚糖酶作為動(dòng)物飼料添加劑的應(yīng)用，所述的木聚糖酶的特征為能耐受1分鐘的調(diào)至95℃的水浴加熱而基本上不喪失其活性，所述的活性由其在pH6.5和40℃的溫度下使1％的小麥阿拉伯糖基木聚糖溶液的粘度降至與未加熱對照相同的終粘度±0.001帕斯卡秒確定。
2.按照權(quán)利要求1的應(yīng)用，其中的木聚糖酶可從鋸齒小四孢菌(Microtetrasporaflexuosa)或褐色熱單孢菌(Thermomonospora fusca)中獲得。
3.按照權(quán)利要求1或2的應(yīng)用，其中的木聚糖酶可從鋸齒小四孢菌(Microtetraspora flexuosa)中獲得，并具有一個(gè)或多個(gè)的下列特征(i)-(v)(i)分子量為約33,100道爾頓，pI約8.5，并在pH7.0-7.5的范圍內(nèi)和約70℃的溫度下具有最大活性；(ii)分子量為約13,300道爾頓，pI約7.5，并在pH7.0-7.5的范圍內(nèi)和約65℃的溫度下具有最大活性；(iii)分子量為約31,000道爾頓，pI約6.2，并在pH約7.5和約65℃的溫度下具有最大活性；(iv)分子量為約50,000道爾頓，pI約5.8，并在pH約7.5和約65℃的溫度下個(gè)有最大活性；(v)分子量為約35,000道爾頓，pI約5.3，并在pH約7.5和約70℃的下具有最大活性。
4.含有生理上可接受的載體和熱穩(wěn)定的木聚糖酶的飼料添加劑，所述的木聚糖酶的特征為能耐受1分鐘的調(diào)至95℃的水浴加熱而基本上不喪失活性，所述的活性由其在pH6.5和40℃的溫度下使1％的小麥阿拉伯糖基木聚糖溶液的粘度降至與未加熱對照相同的終粘度±0.001帕斯卡秒確定。
5.按照權(quán)利要求4的飼料添加劑，其中的木聚糖酶可從鋸齒小四孢菌(Microtetraspora flexuosa)或褐色熱單孢菌(Thermomonospora fusca)中獲得。
6.按照權(quán)利要求4或5的飼料添加劑，其中的載體是谷物或由谷物產(chǎn)生的。
7.按照權(quán)利要求6的飼料添加劑，其中的載體是粉碎的小麥、玉米、大豆或其任意副產(chǎn)物。
8.任意權(quán)利要求4-7的飼料添加劑的應(yīng)用，加入谷物基料飼料以提高其飼料轉(zhuǎn)化比率和/或以增加其可消化性和/或以增加動(dòng)物每消耗單位量的飼料的體重增重比率。
9.谷物基料飼料，含有至少20％重量的谷物，及每kg飼料0.00001-10g的熱穩(wěn)定的木聚糖酶蛋白質(zhì)，所述的木聚糖酶的特征為能耐受1分鐘的調(diào)至95℃的水浴加熱而基本上不喪失活性，所述的活性由其在pH6.5和40℃的溫度下使1％的小麥阿拉伯糖基木聚糖溶液的粘度降至與未加熱對照相同的終粘度土0.001帕斯卡秒確定。
10.按照權(quán)利要求9的谷物基料飼料，其中的木聚糖酶可從鋸齒小四孢菌(Microtetraspora flexuosa)或褐色熱單孢菌(Thermomonospora fusca)中獲得。
11.按照權(quán)利要求9或權(quán)利要求10的谷物基料飼料，其中的谷物至少是小麥、大麥、玉米、高梁、黑麥、燕麥、黑小麥和稻子之一。
12.任意權(quán)利要求9-11的谷物基料飼料作為家禽飼料或豬飼料的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了熱穩(wěn)定的木聚糖酶用作動(dòng)物飼料添加劑。所述的木聚糖酶是一種能耐受1分鐘95℃水浴的加熱而其活性基本上不喪失的酶?？蓮匿忼X小四孢菌(Microtetraspora flexuosa)或褐色熱單孢屬(Thermomonosporafusca)中獲得所述的木聚糖酶。還提供了包括所述的熱穩(wěn)定的木聚糖酶及生理上可接受的載體的飼料添加劑，所述的載體可以是谷物或谷物基料。還提供了包含至少20％重量的谷物和每千克飼料含0.0001～10g熱穩(wěn)定的木聚糖蛋白質(zhì)的谷物基料飼料。所說的谷物可以是小麥、大麥、玉米、高梁、黑麥、燕麥、黑小麥和稻子的任何一種。所述的谷物基料飼料可提供給任何牲畜，特別是提供給家禽和豬。
文檔編號D21C5/00GK1147271SQ95192807
公開日1997年4月9日 申請日期1995年4月28日 優(yōu)先權(quán)日1994年4月28日
發(fā)明者安德魯·約翰·摩根, 凱思琳·A·克拉克森, 伊麗莎白·A·博迪, 威廉·A·丘弗斯 申請人:費(fèi)恩飼料國際有限公司