專利名稱：一種務(wù)川臭蛙抗氧化肽wuchuanin-G及其編碼序列的基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子遺傳學(xué)領(lǐng)域,尤其是一種務(wù)川臭娃抗氧化肽wuchuanin-G及及編碼序列的基因與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
任何包含一個(gè)未成對電子的原子或原子團(tuán)，均稱之為自由基。能夠有效清除來自于生存環(huán)境或者自身代謝產(chǎn)物的有毒活性物質(zhì)對所有的生物機(jī)體來說都非常重要。對有氧呼吸生物來說，自由基特別是活性氧自由基如超氧陰離子自由基、過氧化氫自由基等的形成是需氧呼吸代謝過程中不可避免的副產(chǎn)物，正常生理狀況下線粒體完成有氧呼吸的過程中，會有1-2%的氧氣轉(zhuǎn)化為超氧陰離子自由基，并由此產(chǎn)生一系列破壞性極強(qiáng)的氧化自由基如羥基自由基，通過脂質(zhì)過氧化、蛋白質(zhì)變性或者對遺傳物質(zhì)DNA的損傷對細(xì)胞或組織造成嚴(yán)重破壞。目前發(fā)現(xiàn)，活性氧自由基與多種人類疾病有關(guān),如癌癥、心腦血管疾病、缺血再灌注損傷、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、糖尿病、阿爾茨海默病、帕金森病和衰老等?？寡跷锬壳霸趪鴥?nèi)外應(yīng)用廣泛，需求量逐漸增多，現(xiàn)在被用于預(yù)防治療多種疾病，如心血管疾病、腫瘤、關(guān)節(jié)炎、腎功能損傷、糖尿病、自身免疫性疾病等。此外，抗氧化物近年在化妝品領(lǐng)域的應(yīng)用興起，尤其是天然抗氧化物。由于皮膚的光老化作用是由于紫外線誘導(dǎo)皮膚細(xì)胞產(chǎn)生大量的氧自由基堆積而造成的?，F(xiàn)在許多護(hù)膚品中加入抗氧化劑，有減少雀斑、防輻射、延緩衰老、調(diào)節(jié)免疫和提高皮膚自我保護(hù)的作用。

為了抵抗活性氧自由基對機(jī)體的損害，在漫長的進(jìn)化過程中生物體形成多種不同的自由基清除系統(tǒng)，包括非基因編碼的小分子物質(zhì)，如尿酸、維生素C、維生素E、胡蘿卜烯類、硫辛酸和輔酶Q等；基因編碼的大分子抗氧化酶類，如超氧化物歧化酶(S0D)、過氧化氫酶、過氧化物酶、硫氧還蛋白酶系統(tǒng)和谷胱甘肽酶系統(tǒng)等。各種不同類型的自由基清除劑在醫(yī)藥和化妝品領(lǐng)域具有極大的應(yīng)用潛力，如維生素C、超氧化物歧化酶(SOD)和小分子抗氧化多肽。務(wù)川臭娃fracAwafleflsis)屬于兩棲綱無尾目娃科臭娃屬，為中國特有種，僅分布于貴州省務(wù)川仡佬族苗族自治縣。目前關(guān)于務(wù)川臭蛙來源抗氧化多肽的研究還沒有報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)要求
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種務(wù)川臭娃抗氧化肽wuchuanin-G。本發(fā)明還要解決的技術(shù)問題是提供上述蛋白片段的編碼序列。本發(fā)明還要解決的技術(shù)問題是提供上述基因片段在制備抗氧化藥物或化妝品添加劑的應(yīng)用。
本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的:一種務(wù)川臭娃抗氧化肽wuchuanin-G,它是具有序列表中SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的蛋白，或者是將SEQ ID NO:2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)以上氨基酸殘基的取代、缺失或添加，且具有與SEQ ID NO:2的氨基酸殘基序列相同活性的由SEQ ID NO:2衍生的蛋白質(zhì)。所述的務(wù)川臭娃抗氧化肽wuchuanin-G具有序列表中SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；該務(wù)川臭蛙抗氧化肽是直鏈多肽，含有26個(gè)氨基酸殘基，分子量為3016.60 Da，等電點(diǎn)為10.30。務(wù)川臭娃抗氧化肽wuchuanin-G的編碼基因，它是下列核苷酸之一:
(1)序列表中SEQID NO:1所不的核昔酸序列；
(2)編碼序列表中SEQID NO:2所示的氨基酸序列的多核苷酸；
(3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQID NO:1限定的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。務(wù)川臭娃抗氧化肽wuchuanin-G的編碼基是序列表中SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。務(wù)川臭蛙抗氧化肽wuchuanin-G在制備抗氧化藥物或化妝品添加劑的應(yīng)用。有益效果
通過基因工程的方法將本發(fā)明提供的務(wù)川臭蛙抗氧化肽wuchuanin-G具有極強(qiáng)的抗氧化活性、分子量小、結(jié)構(gòu)簡單、溶血活性低、制備方法簡單的特點(diǎn)，將其應(yīng)用在抗氧化藥物或化妝品添加劑中，可以提高藥物或化妝品添加劑的抗氧化效果。由于該基因是務(wù)川臭蛙本身存在的內(nèi)源基因，因此，該基因的超量表達(dá)不會影響其安全性，可廣泛應(yīng)用于藥物或化妝品添加劑生產(chǎn)中。`
具體實(shí)施例方式根據(jù)下述實(shí)施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實(shí)施例所描述的僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會限制權(quán)利要求書中所詳細(xì)描述的本發(fā)明。本發(fā)明的實(shí)施例1:務(wù)川臭娃抗氧化肽wuchuanin-G基因克隆。I)務(wù)川臭蛙皮膚總RNA提取:
①取300 mg務(wù)川臭蛙皮膚組織，放入研缽中加入液氮研磨成粉末，轉(zhuǎn)移到EP管中，力口A I ml總RNA提取緩沖液(Trizol,美國Invitrogen公司產(chǎn)品)，充分混勻，而后于4°C,12000 rpm 離心 10 min。②離心取上清，加入0.2 ml氯仿溶液，劇烈混勻，室溫放置10分鐘，而后以4°C，12000 rpm離心10分鐘，棄除沉淀。③上清加入等體積的異丙醇，室溫放置10分鐘，以4°C，12000 rpm離心10分鐘，收集沉淀用75% (V/V)乙醇洗一次，晾干，管底沉淀物即為務(wù)川臭蛙皮膚總RNA。2)務(wù)川臭蛙皮膚cDNA文庫構(gòu)建:采用CL0NTECH公司In-Fusion SMARTer Directional cDNA Library Construction Kit。(l)cDNA第一鏈合成(mRNA反轉(zhuǎn)錄):
①經(jīng)DEPC處理(DEPC處理是在含0.1% (V/V)DEPC的水浸泡過夜，高壓滅菌，烘干)的離心管中加入I Ul務(wù)川臭蛙皮膚總RNA、1 u I 3’端一鏈合成引物(3’In-Fusion SMARTerCDS Primer)和2.5 u I DEPC處理的水(DEPC處理的水是含0.1% DEPC (V/V)的水，放置過夜，高壓滅菌)使總體積達(dá)到4.5 Ul，混勻后短暫離心(2000 rpm, 30 S)，離心后于72°C保溫3分鐘；保溫后再將離心管在42°C孵育2分鐘。②在上述離心管中加入以下試劑(均為CL0NTECH公司In-Fusion SMARTer Directional cDNA Library Construction Kit 建庫試劑盒中配備)，2.0 u I 5 X第一鏈緩沖液、0.25 u I 100 mM DTT、1.0 u I 10 mM dNTP Mix、1.0 u I SMARTer
VOligonucleotide、。.25 U I RNase Inhibitor 和 1.0 U I SMARTScribe ReverseTranscriptase反轉(zhuǎn)錄酶,混合離心管中試劑并短暫離心(2000 rpm, 30 s),在42°C保溫90 min，然后68°C保溫10 min。保溫處理后將離心管置于冰上中止第一鏈的合成。從離心管取2 ill所合成的cDNA第一鏈備用。(2)采用長末端聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LD- PCR)方法擴(kuò)增第二鏈(所用試劑均為CL0NTECH 公司 In-Fusion SMARTer Directional cDNA Library Construction Kit 建庫試劑盒中配備)
①將 2 u I cDNA 第一鏈(mRNA 反轉(zhuǎn)錄)、80 U I 去離子水、10 U I IOXAdvantage 2PCR 緩沖液、2 u I 50 X dNTP 混合物、2 U I 5’PCR 引物、2 u I CDS m/3，PCR 引物以
及 2 U I 50 XAdvantage 2 Polymerase Mix 在 95°C預(yù)熱的 PCR 管中進(jìn)行混合。②在PCR儀中按以下程序擴(kuò)增:95°C，1 min ;18個(gè)循環(huán):95°C，15 sec，65°C，30sec,68°C,6 min。循環(huán)結(jié)束后，將離心管中合成的cDNA雙鏈一 80°C保存。(3)務(wù)川臭娃抗氧化肽wuchuanin-G基因克隆篩選:
根據(jù)蛙科抗菌肽信號肽區(qū)保守序列設(shè)計(jì)正向引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其序列為5’ -CCAAAGATGITCACCTTGAAG-3’，PCR 另一擴(kuò)增引物為 CL0NTECH 公司 In-FusionSMARTer Directional cDNA Library Construction Kit 中的 3，-PCR 引物，其序列為S’-CGGGGTACGATGAGACACCAT-S'PCR反應(yīng)在如下條件下進(jìn)行:94 °C 4 min,94 °C 30 sec,57°C 30 sec和72 V I min，30個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增完成后用膠回收試劑盒(天根生物)進(jìn)行目的片段回收。將回收的目的片段連接到PMD19-T載體(Takara，大連)，轉(zhuǎn)化進(jìn)CaCl2-MgCl2法制備好的DH5ci感受態(tài)細(xì)胞。涂板并進(jìn)行氨芐青霉素和藍(lán)白斑雙重篩選，挑取單菌落用M13引物PCR檢測插入片段大小。挑取陽性菌落,搖菌提取質(zhì)粒,使用Applied BiosystemsDNA sequencer, model ABI PRISM 377 進(jìn)行核苷酸測序。測定結(jié)果:
編碼務(wù)川臭娃抗氧化肽wuchuanin-G的基因自5’端至3’端序列如SEQ ID N0.1所
示務(wù)川臭蛙抗氧化肽wuchuanin-G基因核苷酸的序列表為:序列長度為325個(gè)堿基，序列類型:核酸，鏈數(shù):單鏈，拓?fù)鋵W(xué):直鏈狀，序列種類:cDNA，來源:務(wù)川臭蛙皮膚。本發(fā)明的實(shí)施例2:務(wù)川臭娃抗氧化肽wuchuanin-G的化學(xué)合成。1、務(wù)川臭蛙抗氧化肽wuchuanin-G的化學(xué)合成方法:根據(jù)基因推導(dǎo)的成熟肽氨基酸序列，用自動(dòng)多肽合成儀(433A, Applied Biosystems)合成其全序列,通過HPLC反相柱層析脫鹽。I1、分子量測定采用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALD1-T0F)。
II1、純化的務(wù)川臭娃抗氧化肽wuchuanin-G用高效液相色譜HPLC方法鑒定其純度，分子量測定采用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALD1-T0F)，等電聚焦電泳測定等電點(diǎn)，用自動(dòng)氨基酸測序儀測定氨基酸序列結(jié)構(gòu)。編碼務(wù)川臭蛙抗氧化肽的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。務(wù)川臭娃抗氧化肽wuchuanin-G是基因編碼的一種直連多肽,含有二十六個(gè)氨基酸殘基，分子量3016.60Da，等電點(diǎn)10.30。本發(fā)明的實(shí) 施例3:務(wù)川臭蛙抗氧化肽wuchuanin-G的在制備抗氧化藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的實(shí)施例4:務(wù)川臭蛙抗氧化肽wuchuanin-G的在制備化妝品添加劑中的應(yīng)用。本發(fā)明的實(shí)施例5:務(wù)川臭娃抗氧化肽wuchuanin-G的藥理實(shí)驗(yàn)。1、務(wù)川臭娃抗氧化肽wuchuanin-G抗氧化活性測定:
ABTS (3-ethyIbezothiazoIine-6-sulfonic acid) (3_ 乙基苯并噻唑啉 _6_ 橫酸)用PBS緩沖液(pH7.4)配成2 mM的ABTS儲存液。將ABTS儲存液和70 mM過硫酸鉀(K2S2O8)水溶液按體積比250:1混合，于室溫避光放置15-16 h。試驗(yàn)開始前，將ABTS +釋至734nm波長處的吸光值為0.80±0.03。將4 不同濃度的上述wuchuanin-G抗氧化肽樣品和96 W上述校正過的ABTS +溶液混合，室溫放置10 min后，于734 nm波長處檢測反應(yīng)液的吸光值?？瞻讓φ战M為溶解樣品所用滅菌去離子水。實(shí)驗(yàn)做三個(gè)平行(表I)。ABTS +清除率 I(%)= (Ab — Aa)/ Ab XlOO (AB:空白對照組吸光值；AA:樣品組吸光值)。表1.務(wù)川臭娃抗氧化肽wuchuanin-G抗氧化活性
權(quán)利要求
1.一種務(wù)川臭娃抗氧化肽wuchuanin-G,其特征在于:它是具有序列表中SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的蛋白，或者是將SEQ ID NO:2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)以上氨基酸殘基的取代、缺失或添加，且具有與SEQ ID NO:2的氨基酸殘基序列相同活性的由SEQ IDNO:2衍生的蛋白質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的務(wù)川臭娃抗氧化肽wuchuanin-G,其特征在于:所述的務(wù)川臭蛙抗氧化肽具有序列表中SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；該務(wù)川臭蛙抗氧化肽是直鏈多肽，含有26個(gè)氨基酸殘基，分子量為3016.60 Da，等電點(diǎn)為10.30。
3.—種如權(quán)利要求1所述的務(wù)川臭娃抗氧化肽wuchuanin-G的編碼基因,其特征在于:它是下列核苷酸之一: (1)序列表中SEQID NO:1所不的核昔酸序列； (2)編碼序列表中SEQID NO:2所示的氨基酸序列的多核苷酸； (3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQID NO:1限定的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的務(wù)川臭娃抗氧化肽wuchuanin-G的編碼基因，其特征在于:務(wù)川臭蛙抗氧化肽的編碼基是序列表中SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。
5.—種如權(quán)利要求3所述的務(wù)川臭蛙抗氧化肽wuchuanin-G在制備抗氧化藥物或化妝品添加劑的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種務(wù)川臭蛙抗氧化肽wuchuanin-G，它是具有序列表中SEQIDNO1所示的氨基酸序列的蛋白，或者是將SEQIDNO2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)以上氨基酸殘基的取代、缺失或添加，且具有與SEQIDNO2的氨基酸殘基序列相同活性的由SEQIDNO2衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明提供的務(wù)川臭蛙抗氧化肽具有極強(qiáng)的抗氧化活性、分子量小、結(jié)構(gòu)簡單、溶血活性低、制備方法簡單的特點(diǎn)，將其應(yīng)用在抗氧化藥物或化妝品添加劑中，可以提高藥物或化妝品添加劑的抗氧化效果。由于該基因是務(wù)川臭蛙本身存在的內(nèi)源基因，因此，該基因的超量表達(dá)不會影響其安全性，可廣泛應(yīng)用于藥物或化妝品添加劑生產(chǎn)中。
文檔編號A61Q19/08GK103172720SQ20131013131
公開日2013年6月26日 申請日期2013年4月16日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月16日
發(fā)明者周江, 凌桂英, 高久香, 李莉, 王義鵬 申請人:貴州師范大學(xué)