專利名稱：一種微藻油脂提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，尤其是涉及一種微藻油脂提取方法。
背景技術(shù)：
進(jìn)入21世紀(jì)以來，能源危機(jī)從未像今天這樣迫在眉睫。石油作為一種不可再生的資源，供應(yīng)日趨緊張，尋找可替代的能源是人類迫切要解決的問題。與此同時，工業(yè)的高速發(fā)展帶來的二氧化碳巨量排放所導(dǎo)致的換將和氣候問題已經(jīng)嚴(yán)重威脅到人類的后續(xù)生存。人們被迫思考，在我們享受工業(yè)文明的時候，我們是否還能存在下去。由于石化能源的日益枯竭及其所帶來的環(huán)境污染問題，使得開發(fā)可再生能源成為當(dāng)今世界的研究熱點。微藻既是生產(chǎn)高附加值產(chǎn)品和生物活性物質(zhì)的潛力資源，又是進(jìn)行生物能源研究的重要原料。與其他能源植物相比，微藻生物質(zhì)中的油脂含量高，單位面積產(chǎn) 量最高，可達(dá)陸生油料作物的30倍以上，因此被認(rèn)為是未來生物能源供應(yīng)的重要原料。201010607927. 3號發(fā)明專利公開了一種將微藻粉在甲醇、乙酸或者它們的混合溶劑中浸取，然后將甲醇、乙酸或者它們的混合物蒸發(fā)，以得到微藻油脂的方法。但是這種方法，在不破碎細(xì)胞壁的前提下用萃取劑進(jìn)行提取，因為細(xì)胞壁不受破壞，細(xì)胞中的油脂內(nèi)含物不能流露出去，萃取難度大，效率也不高。201010593183. 4號發(fā)明專利公開了一種以產(chǎn)油微生物發(fā)酵醪液為原料，經(jīng)過酶解、有機(jī)溶劑浸提得到微生物油脂的方法。根據(jù)其摘要的說法，浸提率最高可達(dá)100%?？墒菑V泛的實施和驗證，證明其根本不符合事實，因為酶解法破除細(xì)胞壁，首先酶作用的原理是與反應(yīng)物進(jìn)行靶合，從而促使發(fā)生反應(yīng)，發(fā)酵液里面，酶的用量須相當(dāng)大才能達(dá)到使無數(shù)個IO9量級的細(xì)胞壁發(fā)生反應(yīng)。且酶的催化受反應(yīng)條件限制，反應(yīng)中PH值、產(chǎn)物濃度、溫度等等多種限制，根本不可能完全催化。更重要的，單一性的酶液，對于工業(yè)生產(chǎn)來講，成本相當(dāng)高。而常規(guī)的破碎及提取方法中，破碎率一般較低，造成細(xì)胞浪費，效果也難理想

發(fā)明內(nèi)容
為解決上述問題，本發(fā)明提供一種微藻油脂提取方法，所述方法包括下列步驟
(1)將微藻發(fā)酵繆液進(jìn)行離心，收集分離之后的藻體細(xì)胞；
(2)將步驟I中所得到的藻體細(xì)胞用緩沖液洗滌，再制成待用藻液；
(3)細(xì)胞破碎將上述步驟2制得的藻液進(jìn)行2-3次反復(fù)凍融，并且在融化的同時，力口超聲波場；
(4)將步驟3中所得到的原液，用索氏提取裝置采用萃取劑(丙三醇乙醇石油醚=0. 5:6. 5:3)進(jìn)行提取，提取條件為
A、萃取劑與原液體積比為41-8:1的比例混合裝入反應(yīng)爸中；
B、將提取溫度控制為80°C；
C、提取時間為3h；
(5)烘吹除去步驟4中得到的含有油脂的萃取混合液中的萃取劑。
步驟I所述微藻發(fā)酵繆液在3500rpm的離心機(jī)內(nèi)離心20_30分鐘。步驟2所述緩沖液為PH6. 5-7. O的PBS緩沖液。步驟3中的凍融條件為_10°C進(jìn)行冷凍3h，常溫解凍O. 5h。步驟3中的超聲波為25KHz的超聲波，破碎時間4s，間隔時間5s。采用本發(fā)明的微藻油脂提取方法，油脂的浸提率可以達(dá)到90%以上，且相對于現(xiàn)有的方法，其溫度、能耗功率較低，提取條件最適，適合工業(yè)擴(kuò)展，成本低，產(chǎn)率高。
具體實施方式

為了使本發(fā)明的目的，使得技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。本發(fā)明提供一種微藻油脂提取方法，所述方法包括下列步驟
(I)將微藻發(fā)酵繆液進(jìn)行離心。將微藻發(fā)酵繆液在3500rpm的離心機(jī)內(nèi)離心20-30分鐘，收集分離之后的藻體細(xì)胞。(2)將步驟I中所得到的藻體細(xì)胞用PH6. 5-7. O的PBS緩沖液洗滌2_3次，再制成
待用藻液。(3)細(xì)胞破碎將上述步驟2制得的藻液進(jìn)行反復(fù)凍融，并且在融化的同時，加超聲波場。凍融條件為-10°C進(jìn)行冷凍，冷凍3h，常溫解凍O. 5h ;在融化的過程中，施加25KHZ的超聲波，破碎時間4s，間隔時間5s。凍融循環(huán)次數(shù)為2-3次。(4)提取將步驟3中所得到的原液，用索氏提取裝置采用本發(fā)明獨特配置的萃取劑(丙三醇:乙醇石油醚=0. 5:6. 5:3)進(jìn)行提取
A、萃取劑與原液體積比為41-8:1的比例混合裝入反應(yīng)爸中；
B、將提取溫度控制為80°C；
C、提取時間為3h。(5)將步驟4中得到的含有油脂的萃取混合液，烘吹除去萃取劑，便能得到單一性較好的油脂。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)的區(qū)別首先在于采用在相對較適中的溫度下，對藻體細(xì)胞進(jìn)行反復(fù)凍融，并在融化過程中加設(shè)超聲波場的方法，對細(xì)胞壁進(jìn)行破壞，使其內(nèi)含物全部釋放出來；采用特制的丙三醇乙醇石油醚=1:6:3的萃取劑進(jìn)行萃取，最終在精準(zhǔn)的條件下控制索氏提取，達(dá)到高效的出油率。對比常規(guī)的中反復(fù)凍融的方法，將待破碎的細(xì)胞冷至一 15°C到一 20°C，然后放于40°C迅速融化，如此反復(fù)凍融多次，由于細(xì)胞內(nèi)形成冰粒使剩余胞液的鹽濃度增高而引起細(xì)胞溶脹破碎。這個方法在工業(yè)中應(yīng)用時，因為低溫溫度在一 15°C到一 20°C冰凍12h至完全凍住，然后40°C迅速融化，工業(yè)上要達(dá)到較低的制冷溫度，首先用電能耗較大，其次還要反復(fù)保持12h的超低溫，時間長更加進(jìn)一步加大了成本，且破碎率也達(dá)不到較好的效果。單純的超聲波破碎比較細(xì)胞彈性較強(qiáng)，破碎率不高效果一樣不太理想。本發(fā)明將這兩種結(jié)合起來，是的控制的時間和效果遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于分別單獨實施的效果，同時由于溫度、超聲強(qiáng)度相對較溫和，成本大大降低，時間大大縮短，更主要的細(xì)胞破碎率在95%以上。本發(fā)明的萃取劑丙三醇乙醇石油醚=0.5:6. 5:3，相對于常用的氯仿+甲醇的萃取劑、乙酸乙酯的萃取劑、無水乙醇萃取劑來說，生化原理上，乙醇作為主要的萃取溶劑提取油脂，同時添加少許的與乙醇任意混溶的甘油，同時再添加石油醚作為輔助兼和溶劑。因為脂質(zhì)是甘油與脂肪酸酯化反應(yīng)形成的含有甘油結(jié)構(gòu)的酯類有機(jī)物，根據(jù)相似相合原理，脂質(zhì)容易與甘油相合，所有添加一些甘油有助于萃取。但是甘油是油狀，揮發(fā)性較差，在萃取之后較難與脂質(zhì)分離，所以對量要有限定。本發(fā)明經(jīng)過多次嘗試以后，采取比較好的丙三醇乙醇石油醚=0.5:6. 5:3的比例，萃取的效率較目前的常用的萃取率高出10-20%，適合于脂質(zhì)提取。本發(fā)明中采用的索氏提取的條件，為反復(fù)試驗之后得出的最佳提取條件
將PBS緩沖液處理后的經(jīng)過發(fā)酵培養(yǎng)的小球藻(中國科學(xué)院水生生物研究所淡水藻種庫，編號FACHB-7)細(xì)胞制成標(biāo)準(zhǔn)I. OX IO9個/ml的密度，分別進(jìn)行各個提取條件分析，下表I、表2、表3分別為萃取劑與原液比、溫度、時間各個條件下出油率的數(shù)據(jù)變化情況。表I ^_
權(quán)利要求
1.一種微藻油脂提取方法，其特征在于，所述方法包括下列步驟 (1)將微藻發(fā)酵繆液進(jìn)行離心，收集分離之后的藻體細(xì)胞； (2)將步驟I中所得到的藻體細(xì)胞用緩沖液洗滌，再制成待用藻液； (3)細(xì)胞破碎將上述步驟2制得的藻液進(jìn)行2-3次反復(fù)凍融，并且在融化的同時，力口超聲波場； (4)將步驟3中所得到的原液，用索氏提取裝置采用萃取劑丙三醇乙醇石油醚=0. 5:6. 5:3進(jìn)行提取，提取條件為 A、萃取劑與原液體積比為41-8:1的比例混合裝入反應(yīng)爸中； B、將提取溫度控制為80°C； C、提取時間為3h； (5)烘吹除去步驟4中得到的含有油脂的萃取混合液中的萃取劑。
2.如權(quán)利要求I所述的一種微藻油脂提取方法，其特征在于步驟I所述微藻發(fā)酵繆液在3500rpm的離心機(jī)內(nèi)離心20-30分鐘。
3.如權(quán)利要求2所述的一種微藻油脂提取方法，其特征在于步驟2所述緩沖液為PH6. 5-7. O 的 PBS 緩沖液。
4.如權(quán)利要求3所述的一種微藻油脂提取方法，其特征在于步驟3中的凍融條件為-10°C進(jìn)行冷凍3h，常溫解凍O. 5h。
5.如權(quán)利要求4所述的一種微藻油脂提取方法，其特征在于步驟3中的超聲波為25KHz的超聲波，破碎時間4s，間隔時間5s。
全文摘要
本發(fā)明一種微藻油脂提取方法，在超聲波場條件下用反復(fù)凍融的方法破碎細(xì)胞壁，然后采用特制的丙三醇乙醇石油醚=0.5:6.5:3萃取劑在最佳的索氏提取條件下進(jìn)行提取。采用本發(fā)明的微藻油脂提取方法，油脂的浸提率可以達(dá)到90%以上，且相對于現(xiàn)有的方法，其溫度、能耗功率較低，提取條件最適，適合工業(yè)擴(kuò)展，成本低，產(chǎn)率高。
文檔編號C11B1/02GK102942991SQ20121051174
公開日2013年2月27日 申請日期2012年12月4日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月4日
發(fā)明者殷學(xué)軍 申請人:深圳國能環(huán)保節(jié)能科技有限公司