專(zhuān)利名稱(chēng)：：木質(zhì)素過(guò)氧化物酶的生產(chǎn)方法及其在皮膚和毛發(fā)增亮中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及木質(zhì)素過(guò)氧化物酶的生產(chǎn)方法及其在皮膚和毛發(fā)增亮中的應(yīng)用。技術(shù)背景黑色素人類(lèi)皮膚和毛發(fā)的顏色受黑色素的數(shù)量、質(zhì)量及分布的控制，黑色素是一種色素，也存在于植物和微生物中。黑色素的合成是從前體L-酪氨酸開(kāi)始的，L-酪氨酸通過(guò)酪氨酸酶的作用轉(zhuǎn)化為第二前體多巴醌。在哺乳動(dòng)物黑色素的生物合成中，該中間產(chǎn)物可以通過(guò)兩種主要途徑聚合(圖1)。氨基的分子內(nèi)親核加成產(chǎn)生了吲咪衍生物無(wú)色多巴色素(leucodopachrome)，其在聚合后產(chǎn)生了深褐色至黑色的色素真黑素。在硫醇化合物的存在下，形成了多巴的碌u醚(thioesther)衍生物；與半胱氨酸的反應(yīng)產(chǎn)生了半胱氨酰多巴，其在進(jìn)一步氧化和聚合后，產(chǎn)生了黃色至紅棕色的色素棕黑素。所以，真黑素主要由5，6-二羥基吲哚(DHI)和5,6-二羥基吲哚-2-羧酸(DHICA)單元構(gòu)成，但棕黑素主要含有苯并噻溱單元(Alaluf等，2001)。這兩種色素的可得性及相互之間的比例影響了聚合色素的化學(xué)組成。黑色素的合成在微粒中進(jìn)行，該微粒被稱(chēng)為黑色素體(Cooksey等，1997)，存在于表皮基層的黑素細(xì)胞中；這些細(xì)胞中黑色素的合成是由紫外線(xiàn)(UV)誘導(dǎo)的。在合成之后，黑色素遷移到表皮細(xì)胞中并分散于其中，在此處黑色素隨著皮膚的代謝被脫色并在皮膚更新時(shí)以污垢的形式脫落。黑色素在臨床上有重要意義，因?yàn)樗Ｗo(hù)皮膚免受由紫外線(xiàn)引起的不良反應(yīng)。但是，高水平的黑色素可能引起不想要的皮膚和毛發(fā)變暗，而其不均勻分布可能會(huì)導(dǎo)致黃褐斑和雀斑，這在美學(xué)上可能是令人不快的。增亮產(chǎn)品皮膚增亮產(chǎn)品(lighteningproduct)在過(guò)去幾年中變得越來(lái)越流行。皮膚增亮產(chǎn)品的主要目的是使皮膚變亮或變白，或治療色素沉著疾病，例如黃褐斑、雀斑、妊娠斑及老年斑。目前有數(shù)種類(lèi)型的皮膚增亮產(chǎn)品。基于色素細(xì)胞退化和死亡的產(chǎn)品通常包括刺激性的化學(xué)品，例如氫鋃、4-異丙基兒茶酚和氫醌單苯甲基醚，其促進(jìn)皮膚變白及皮膚變亮，或弱化皮膚色素沉著。此類(lèi)產(chǎn)品通常無(wú)效，并且可能對(duì)皮膚有害，因?yàn)檫B續(xù)外部施用這些產(chǎn)品可能導(dǎo)致永久性白斑病和副作用，例如色素異常癥和皮疹。其他的增亮產(chǎn)品基于對(duì)酪氨酸酶的抑制，即將前體L-酪氨酸轉(zhuǎn)化為第二前體多巴醌的酶。這組產(chǎn)品包括熊果苷，它是一種葡萄糖氫醌化合物，能夠通過(guò)與銅離子螯合而抑制酪氨酸酶，從而抑制由多巴色素向DHICA的互變異構(gòu)化。Melanostat是另一種通過(guò)酪氨酸酶起作用的增亮產(chǎn)品。Melanostat是一種合成的肽，在使黑素細(xì)胞中的黑色素生成失活方面起作用。幾種能夠抑制黑色素生成的抗氧化化合物也用于增亮產(chǎn)品中。由于黑色素的合成涉及氧化反應(yīng)，所以在由酪氨酸/多巴向黑色素的氧化過(guò)程的不同點(diǎn)阻斷該過(guò)程最終抑制了黑色素的合成。用于阻斷黑色素合成的一種抗氧化劑是L-抗壞血酸(維生素C)，它作為黑色素中間體的還原劑發(fā)揮作用并阻斷氧化反應(yīng)；其它用于增亮產(chǎn)品的抗氧化劑包括生物類(lèi)黃酮，通常是從桑樹(shù)或甘草中提取的。毛發(fā)增亮產(chǎn)品作用于毛發(fā)皮層內(nèi)的黑色素。有幾種化學(xué)品能夠增亮毛發(fā)，包括鹽酸、次氯酸鈉和過(guò)氧化氫。用于增亮毛發(fā)的最常用的化學(xué)品是過(guò)氧化氫。為了保持理想的有效性，過(guò)氧化氫溶液必須用化合物例如乙酰苯胺、稀酸、膠態(tài)二氧化硅、對(duì)羥基苯甲酸酯、硫酸羥喹啉、非那西汀和錫化合物(錫酸鈉、氫氧化錫、辛酸亞錫)穩(wěn)定化。在毛發(fā)被增亮前，向過(guò)氧化氬溶液中加入氨水以促進(jìn)過(guò)氧化氫穿透表皮，毛發(fā)的外層，從而加速氧化反應(yīng)，在將本發(fā)明用于實(shí)踐時(shí)，本申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)木質(zhì)素過(guò)氧化物酶同功酶Hl能夠在體外氧化黑色素，還能在體內(nèi)增亮皮膚和毛發(fā)。因此，本發(fā)明提供了非常適用于皮膚和毛發(fā)增亮的化妝品組合物和方法。
發(fā)明內(nèi)容根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種增亮受試者的皮膚區(qū)域或毛發(fā)的方法，包括以適于氧化所述皮膚區(qū)域或毛發(fā)的細(xì)胞中所含有的色素的方式，向所述皮膚區(qū)域或毛發(fā)施用至少一種類(lèi)型的木質(zhì)素修飾酶。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了一種用于增亮受試者的皮膚區(qū)域或毛發(fā)的化妝品組合物，包含至少一種類(lèi)型的木質(zhì)素修飾酶和化妝品可接受的載體。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了一種用于增亮受試者的皮膚區(qū)域或毛發(fā)的試劑盒，包含第一個(gè)容器，其中包括木質(zhì)素修飾酶，以及第二個(gè)容器，其中包括電子受體。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了一種加工制品，包含包裝材料和用于增亮受試者的皮膚區(qū)域或毛發(fā)的化妝品組合物，所述化妝品組合物包含在所述包裝材料中，所迷化妝品組合物包括作為活性成分的木質(zhì)素修飾酶以及化妝品可接受的載體。根據(jù)下面描述的本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方式的其他特征，所述方法是通過(guò)局部施用包括至少一種類(lèi)型的木質(zhì)素修飾酶的制劑而實(shí)現(xiàn)的。根據(jù)所描述的優(yōu)選實(shí)施方式的其他特征，所述方法是通過(guò)包括至少一種類(lèi)型的木質(zhì)素修飾酶的制劑的皮內(nèi)或皮下給予進(jìn)行的。根據(jù)所描述的優(yōu)選實(shí)施方式的其他特征，所述的木質(zhì)素修飾酶包含在為用于皮膚或毛發(fā)而配制的組合物中。根據(jù)下面描述的本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方式的其他特征，所述的木質(zhì)素修飾酶是木質(zhì)素過(guò)氧化物酶。根據(jù)所描述的優(yōu)選實(shí)施方式的其他特征，所述的木質(zhì)素過(guò)氧化物酶是同功酶H1或同功酶H2的修飾形式。根據(jù)所描述的優(yōu)選實(shí)施方式的其他特征，所述的化妝品組合物還包含電子受體。根據(jù)所描迷的優(yōu)選實(shí)施方式的其他特征，所述的電子受體是過(guò)氧化氫。根據(jù)所描述的優(yōu)選實(shí)施方式的其他特征，所述的化妝品組合物還包含藜蘆基醇。根據(jù)所描述的優(yōu)選實(shí)施方式的其他特征，所述的組合物包含至少一種類(lèi)型的表皮滲透劑。根據(jù)所描述的優(yōu)選實(shí)施方式的其他特征，所述的組合物包含至少一種類(lèi)型的毛發(fā)滲透劑。根據(jù)所描述的優(yōu)選實(shí)施方式的其他特征，所述方法的持續(xù)時(shí)間是按照期望的增亮水平選擇的。根據(jù)所描述的優(yōu)選實(shí)施方式的其他特征，所述的化妝品可接受的載體包括二甘醇單乙醚(transcutol)和/或丁二醇。根據(jù)所描述的優(yōu)選實(shí)施方式的其他特征，所述的化妝品可接受的載體包括鏈烷醇胺。根據(jù)所描述的優(yōu)選實(shí)施方式的其他特征，所述化妝品組合物中的木質(zhì)素過(guò)氧化物酶以至少1U/gr的濃度提供。根據(jù)所描述的優(yōu)選實(shí)施方式的其他特征，所述化妝品組合物中的過(guò)氧化氫以至少0.005%的濃度提供。根據(jù)所描述的優(yōu)選實(shí)施方式的其他特征，所述化妝品組合物中的藜，基醇以至少0.05%的濃度提供。根據(jù)所描述的優(yōu)選實(shí)施方式的其他特征，所述用于增亮皮膚區(qū)域或毛發(fā)的試劑盒的第一個(gè)容器還包含藜產(chǎn)基醇。根據(jù)所描述的優(yōu)選實(shí)施方式的其他特征，所述用于增亮皮膚區(qū)域或毛發(fā)的試劑盒的笫一個(gè)和/或第二個(gè)容器還包括適用于表皮滲透的化妝品可接受的載體。根據(jù)所描述的優(yōu)選實(shí)施方式的其他特征，所述用于增亮皮膚區(qū)域或毛發(fā)的試劑盒的笫一個(gè)和/或第二個(gè)容器還包括適用于毛發(fā)滲透的化妝品可接受的載體。根據(jù)本發(fā)明的其它方面，提供了一種用于增亮受試者的皮膚區(qū)域的方法，該方法包括以適于氧化所述皮膚區(qū)域的細(xì)胞中所含有的色素的方式，在所述皮膚區(qū)域的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)木質(zhì)素修飾酶。根據(jù)所描述的優(yōu)選實(shí)施方式的其他特征，所述方法還包括向所述皮膚區(qū)域的細(xì)胞提供電子受體的步驟。根據(jù)所描述的優(yōu)選實(shí)施方式的其他特征，所述的電子受體是過(guò)氧化氫。根據(jù)所描述的優(yōu)選實(shí)施方式的其他特征，所述方法還包括向所述皮膚區(qū)域的細(xì)胞提供藜蘆基醇的步驟。根據(jù)所描述的優(yōu)選實(shí)施方式的其他特征，表達(dá)是通過(guò)向所述細(xì)胞中引入能夠表達(dá)所述木質(zhì)素修飾酶的表達(dá)載體而實(shí)現(xiàn)的。根據(jù)所描述的優(yōu)選實(shí)施方式的其他特征，所述的表達(dá)載體是病毒載體。根據(jù)所描述的優(yōu)選實(shí)施方式的其他特征，所述的表達(dá)載體包含與木質(zhì)素修飾酶的編碼序列功能連接的啟動(dòng)子。根據(jù)所描述的優(yōu)選實(shí)施方式的其他特征，所述的木質(zhì)素修飾酶是木質(zhì)素過(guò)氧化物酶。根據(jù)所描述的優(yōu)選實(shí)施方式的其他特征，所述的木質(zhì)素過(guò)氧化物酶由SEQIDNO:1所示的多核苷酸序列編碼。根據(jù)本發(fā)明的其它方面，提供了一種生產(chǎn)木質(zhì)素過(guò)氧化物酶的方法，包括(a)在含有甘油的攪拌和通氣的培養(yǎng)基中，在多孔基質(zhì)上培養(yǎng)黃胞原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium)真菌預(yù)定的時(shí)間段；(b)在所述的預(yù)定時(shí)間段之后，從所述的黃胞原毛平革菌真菌中提取可溶性級(jí)分，從而生產(chǎn)木質(zhì)素過(guò)氧化物酶。根據(jù)所描述的優(yōu)選實(shí)施方式的其他特征，所述的培養(yǎng)基不含錳離子。根據(jù)所描述的優(yōu)選實(shí)施方式的其他特征，所述的通氣的培養(yǎng)基是通過(guò)將所述培養(yǎng)基置于0.1-1升/升/分鐘的通氣速率范圍內(nèi)而獲得的。根據(jù)所描述的優(yōu)選實(shí)施方式的其他特征，所述的培養(yǎng)是在37。C的溫度下進(jìn)行的。根據(jù)所描述的優(yōu)選實(shí)施方式的其他特征，所述的攪拌的培養(yǎng)基是通過(guò)以50-300rpm范圍內(nèi)的速度攪拌所述培養(yǎng)基而獲得的。根據(jù)所描述的優(yōu)選實(shí)施方式的其他特征，所述的攪拌的培養(yǎng)基是通過(guò)以100rpm的速度攪拌所述培養(yǎng)基而獲得的。根據(jù)所描述的優(yōu)選實(shí)施方式的其他特征，所述的預(yù)定的時(shí)間段選自3-10天的范圍。根據(jù)所描述的優(yōu)選實(shí)施方式的其他特征，所述的預(yù)定的時(shí)間段是7天。根據(jù)所描述的優(yōu)選實(shí)施方式的其他特征，所述的甘油以3-20克/升的濃度提供。根據(jù)所描述的優(yōu)選實(shí)施方式的其他特征，所述的甘油以6克/升的濃度提供。根據(jù)所描述的優(yōu)選實(shí)施方式的其他特征，所述的培養(yǎng)基還包括藜蘆基醇。根據(jù)所描述的優(yōu)選實(shí)施方式的其他特征，所述的藜蘆基醇是以0.5-4mM的濃度范圍提供的。根據(jù)所描述的優(yōu)選實(shí)施方式的其他特征，所述的藜聲基醇是以2mM的濃度提供的。根據(jù)所描述的優(yōu)選實(shí)施方式的其他特征，所述的木質(zhì)素過(guò)氧化物酶是同功酶H1或同功酶H2的修飾形式。根據(jù)所描述的優(yōu)選實(shí)施方式的其他特征，所述的多孔基質(zhì)是聚氨酯泡沫。根據(jù)本發(fā)明的其它方面，提供了黃胞原毛平革菌真菌的水性提取物，其表現(xiàn)出500-2000單位/升范圍內(nèi)的木質(zhì)素過(guò)氧化物酶酶活》根據(jù)所描述的優(yōu)選實(shí)施方式的其他特征，所述的木質(zhì)素過(guò)氧化物酶酶活性是1500單位/升。根據(jù)所描述的優(yōu)選實(shí)施方式的其他特征，所述的木質(zhì)素過(guò)氧化物酶酶活是同功酶H1或同功酶H2的修飾形式。本發(fā)明提供了用于增亮受試者的皮膚區(qū)域或毛發(fā)的有效方法和組合物，從而成功地解決了目前已知配置(configuration)中的缺點(diǎn)。除非另外定義，此處所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)的含義與本發(fā)明所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員之一般理解相同。雖然與此處描述的方法和材料相似或等同的方法和材料可以用于實(shí)施或檢驗(yàn)本發(fā)明，合適的方法和材料如下所述。在有沖突的情況下，該專(zhuān)利說(shuō)明書(shū)包括定義將優(yōu)先考慮。此外，所述的材料、方法和實(shí)施例僅僅是處于說(shuō)明的目的，不是限制性的。僅以舉例的方式參考附圖描述了本發(fā)明。具體參考附圖的細(xì)節(jié)，應(yīng)該強(qiáng)調(diào)的是，所示的細(xì)節(jié)采用舉例的方式，僅僅為了本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方式的說(shuō)明性討論，提供這些細(xì)節(jié)的原因是提供據(jù)信最有用最易理解的本發(fā)明原理和概念方面的描述。在這一點(diǎn)上，沒(méi)有試圖示出比基本理解本發(fā)明所需要的細(xì)節(jié)更多的本發(fā)明的結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)；對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在結(jié)合說(shuō)明書(shū)和附圖之后，如何在實(shí)踐中實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的各種形式將變得更明顯。附圖中圖l是Alaluf等人，2001年所采納的哺乳動(dòng)物黑色素生物合成的現(xiàn)有技術(shù)圖示。圖2示出了通過(guò)固定在聚氨酯泡沫上的黃胞原毛平革菌生產(chǎn)木質(zhì)素過(guò)氧化物酶所需的攪拌罐反應(yīng)器(STR)。圖3示出了黃胞原毛平革菌發(fā)酵罐培養(yǎng)物中的LIP活性是培養(yǎng)時(shí)間的函數(shù)。如實(shí)施例部分的實(shí)施例1所述，黃胞原毛平革菌生長(zhǎng)在STR發(fā)酵罐中。如實(shí)施例中所述，在藜,基醇氧化成藜，醛后，測(cè)定細(xì)胞外液中LIP活性。誤差條(errorbar)代表3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)差。圖4示出了在pH3.5的50mM酒石酸緩沖液中的1.5mM藜，基醇的存在下，初始濃度70.5jig/ml的黑色素被LIP(0.48nM)氧化，該氧化過(guò)程為逐漸增加的過(guò)氧化氫濃度的函數(shù)。黑色素的氧化通過(guò)測(cè)定460nm處的"及收而確定，在酶反應(yīng)開(kāi)始時(shí)以及160秒后進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算氧化的黑色素的百分比。誤差條代表3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)差。圖5示出了逐漸增加的過(guò)氧化氫濃度對(duì)LIP氧化黑色素的影響.黑色素的氧化程度通過(guò)與未加入過(guò)氧化氫(0fiM)的酶反應(yīng)進(jìn)行比較，由顏色強(qiáng)度的下降觀察出來(lái)。圖下方的數(shù)字指出了以jiM表達(dá)的H202濃度，圖6示出了在藜聲基醇(1.5mM)和過(guò)氧化氫(600jiM)的存在下，在pH3.5的50mM酒石酸緩沖液中，LIP(0.48jiM)對(duì)不同濃度黑色素的氧化程度。誤差條代表3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)差。圖7示出了黑色素的氧化程度，其作為L(zhǎng)IP濃度的函數(shù)。黑色素的氧化(70jig/ml)是在藜^"基醇(1.5mM)和過(guò)氧化氫(700pM)的存在下，在pH3.5的50mM酒石酸緩沖液中進(jìn)行的，其中LIP濃度逐漸增加。誤差條代表3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)差。圖8a-b示出了當(dāng)LIP在乳膏中使用時(shí)，目測(cè)LIP對(duì)黑色素的氧化。在將活化劑乳膏加入到LIP乳膏(圖8b)中之后，觀察到黑色素脫色，但在LIP乳膏單獨(dú)存在下則觀察不到(圖8a)。圖9a-b示出了LIP乳膏對(duì)皮膚增白的效果。示出的是在施用乳骨中的LIP(每天兩次)之后一周所拍攝的女性的手。用LIP處理的區(qū)域(圖9a，用黑線(xiàn)圈起來(lái)的區(qū)域)比這只手其它部分的皮膚要亮得多(圖9b)。圖IO示出了LIP體內(nèi)對(duì)毛發(fā)漂白的效果。將女性的毛發(fā)在pH11.5的50mM碳酸鹽緩沖液中浸沒(méi)1小時(shí)。將毛發(fā)與25U的LIP預(yù)溫育IO秒鐘，并在含有藜蘆基醇(1.5mM)和過(guò)氧化氫(8.8mM)的pH3.5的酒石酸緩沖液中浸沒(méi)1小時(shí)。與在同樣的但不含LIP的溶液中處理的毛發(fā)(圖10，左側(cè)管)相比，用LIP處理過(guò)的毛發(fā)中觀察到了顯著的增亮效果(圖10，右側(cè)管)。圖lla-b是1號(hào)研究受試者右前臂的彩色照片，示出了LIP增白乳膏對(duì)皮膚色素沉著的效果。圖lla-O天時(shí)拍才聶的照片；圖11b-21天時(shí)拍攝的照片。圖12a-c示出了在1號(hào)研究受試者中LIP或氫醌乳骨對(duì)皮膚增白的效果。LIP或氫醌乳膏施用在右前臂和左前臂的上面部分，而下面部分一直不進(jìn)行處理。利用DermaSpectrometer間隔7天測(cè)定兩只前臂中皮膚色素沉著的程度，圖12a-施用LIP乳青；圖12b-施用氫醍乳膏；藍(lán)色柱子-用LIP乳膏處理的右前臂上面部分；淺藍(lán)色柱子=右前臂未處理的下面部分；粉色柱子-用氬載處理的左前臂上面部分；白色柱子-左前臂未處理的下面部分；圖12c是直線(xiàn)圖，比較了在用LIP乳膏(圖12c，藍(lán)線(xiàn))或氫醌乳膏(圖12c，粉線(xiàn))處理21天之后，上前臂皮膚色素沉著的減少。注意，在用LIP乳骨處理21天之后，皮膚色素沉著劇烈減少，而在用氫醍乳膏處理之后為中度減少。圖13a-b為IO號(hào)研究受試者右前臂的彩色照片，示出了LIP增白乳膏對(duì)皮膚色素沉著的效果。圖13a-0天時(shí)拍攝的照片；圖13b-21天時(shí)拍攝的照片。圖14a-c示出了在IO號(hào)研究受試者中LIP或氫醌乳膏對(duì)皮膚增白的效果。LIP或氫醌乳膏施用在右前臂和左前臂的上面部分，而下面部分一直不進(jìn)行處理。利用DermaSpectrometer間隔7天測(cè)定兩只前臂中皮膚色素沉著的程度。圖14a-施用LIP乳膏；圖14b-施用氫醌乳膏；藍(lán)色柱子-用LIP乳膏處理的右前臂上面部分；淺藍(lán)色柱子-右前臂未處理的下面部分；粉色柱子-用氫醌處理的左前臂上面部分;白色柱子-左前臂未處理的下面部分；圖14c是直線(xiàn)圖，比較了在用LIP乳膏(圖14c，藍(lán)線(xiàn))或氫醌乳膏(圖14c，粉線(xiàn))處理21天之后，上前臂皮膚色素沉著的減少。注意，在用LIP乳骨處理21天之后，皮膚色素沉著劇烈減少，而在用氫醒乳膏處理之后為中度減少。圖15a-b是直線(xiàn)圖，示出了在所有12個(gè)研究受試者中LIP和氫醌乳膏對(duì)皮膚增白的平均效果。圖15a-平均色素沉著分?jǐn)?shù)；圖15b-色素沉著減少平均值，其作為初始色素沉著得分的分?jǐn)?shù)(fraction).具體實(shí)施例方式本發(fā)明提供了可用于增亮受試者皮膚區(qū)域或毛發(fā)的方法和化妝品組合物。具體地說(shuō)，本發(fā)明的方法可用于治療不均勻的膚色，其源于色素過(guò)度沉著相關(guān)的醫(yī)學(xué)病況，例如黑斑病、黃褐斑、老年斑、雀斑、黃褐病和色斑。在參考附圖和所附的說(shuō)明書(shū)后，可以更好地理解本發(fā)明的原理和操作。在詳細(xì)闡述本發(fā)明的至少一個(gè)實(shí)施方式之前，應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明在其應(yīng)用方面不受后面的說(shuō)明書(shū)中闡述的細(xì)節(jié)或?qū)嵤├信e例說(shuō)明的細(xì)節(jié)的限制。本發(fā)明能夠采用其它實(shí)施方式或以不同方式實(shí)現(xiàn)或完成。也應(yīng)當(dāng)理解，此處所用的措辭和術(shù)語(yǔ)是處于說(shuō)明的目的，不應(yīng)該被認(rèn)為是限制性的。皮膚色素沉著的程度是在普通人群中較關(guān)心的內(nèi)容。有些人遇到了老年斑和妊娠斑，并希望此類(lèi)色素沉著斑點(diǎn)能夠更不明顯一些。其他人有雀斑、黃褐斑、黑斑病、黃褐病和色斑，通常是用皮膚增亮產(chǎn)品治療的，這些皮膚增亮產(chǎn)品使皮膚的色素沉著變亮和變平和。但是，目前的皮膚增亮產(chǎn)品或者是可能導(dǎo)致永久性白斑病和副作用例如色素異常癥和皮滲的刺激性化學(xué)品，例如氫醍，或者是不能足夠有效地增亮皮膚。其中包括基于對(duì)酪氨酸酶的抑制的產(chǎn)品，即將前體L-酪氨酸轉(zhuǎn)化為第二前體多巴醌從而抑制黑色素合成的酶。其他產(chǎn)品被設(shè)計(jì)出來(lái)以在由酪氨酸/多巴向黑色素的氧化反應(yīng)的不同點(diǎn)阻斷該過(guò)程并最終抑制黑色素的合成。后一組產(chǎn)品包括抗氧化劑，例如L-抗壞血酸(維生素C)和生物類(lèi)黃酮。毛發(fā)增亮產(chǎn)品組合使用高濃度過(guò)氧化氫和氨。這些產(chǎn)品可能會(huì)給被治療的受試者帶來(lái)不適。在下面的實(shí)施例部分清楚地闡述了以下內(nèi)容本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)木質(zhì)素過(guò)氧化物酶，特別是其H1同功酶，能夠有效地氧化黑色素，因而可被用于增亮受試者的皮膚或毛發(fā)。雖然美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，578，296鑒定了Basidiomycetes真菌中的黑色素分解能力，并暗示了該真菌在治療黃褐斑和雀斑中的用途，但到目前為止，該真菌中負(fù)責(zé)黑色素分解的具體的酶還沒(méi)有被發(fā)現(xiàn)。因此，按照本發(fā)明的一方面，提供了一種增亮受試者的皮膚或毛發(fā)的方法。按照本發(fā)明這一方面的方法是通過(guò)如下方式實(shí)施的以適于氧化受試者的皮膚區(qū)域或毛發(fā)的細(xì)胞中含有的色素(例如黑色素)的方式，向受試者的皮膚區(qū)域或毛發(fā)施用至少一種類(lèi)型的木質(zhì)素修飾酶。此處所使用的短語(yǔ)"增亮皮膚區(qū)域或毛發(fā)"是指通過(guò)減少其中含有的黑色素的色素質(zhì)量或濃度而減少皮膚或毛發(fā)的色調(diào)或顏色。此處所使用的短語(yǔ)"受試者"是指哺乳動(dòng)物，通常是人，優(yōu)選那些具有過(guò)量皮膚或毛發(fā)色素沉著或皮膚瑕瘋例如雀斑等的人。本發(fā)明所用的木質(zhì)素修飾酶優(yōu)選為木質(zhì)素過(guò)氧化物酶，其在木質(zhì)素降解中發(fā)揮主要作用。該木質(zhì)素修飾過(guò)氧化物酶的活性位點(diǎn)氨基酸序列及其氧化底物的機(jī)理與辣根過(guò)氧化物酶(HRP)和大豆過(guò)氧化物酶(SBP)相似。木質(zhì)素修飾過(guò)氧化物酶能夠以高氧化還原勢(shì)催化底物的氧化。這種獨(dú)特的能力與低電子密度的血紅素活性位點(diǎn)相一致，這一點(diǎn)由高氧化還原勢(shì)指明CaiandTien(1993)JBiotechnol30:79-90。雖然現(xiàn)有技術(shù)中已知的木質(zhì)素過(guò)氧化物酶的任何同功酶都可以用于本發(fā)明(Rothschild等，1997，Appl.Environ.Microbiol.63:857-861)，但本發(fā)明優(yōu)選采用HI同功酶，因?yàn)檫@種同功酶在體外和體內(nèi)都表現(xiàn)出黑色素氧化活性，這一點(diǎn)在下面的實(shí)施例部分進(jìn)行了闡述。有數(shù)種方法可用于制備本發(fā)明所采用的木質(zhì)素修飾酶。例如，木質(zhì)素過(guò)氧化物酶同功酶HI可由真菌黃胞原毛平革菌制備。當(dāng)上述真菌生長(zhǎng)于攪拌的罐狀反應(yīng)器(stirredtankreactor,STR)發(fā)酵罐中，同時(shí)固定于聚氨酯泡沫上或處于懸液中時(shí)，高水平酶活的木質(zhì)素過(guò)氧化物酶可從上述真菌生產(chǎn)出來(lái)(Dosoretz等，1993，ApplEnvironMicrobiol.59:1919-26)。按照本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，發(fā)酵罐與冷卻系統(tǒng)相連以維持37。C的培養(yǎng)溫度，以50-300rpm的速度攪拌，更優(yōu)選100-200rpm，最優(yōu)選160rpm。為了提高木質(zhì)素過(guò)氧化物酶活性的產(chǎn)率，以每升培養(yǎng)基每分鐘0.1-1升空氣的通氣率對(duì)發(fā)酵罐進(jìn)行通氣。按照目前優(yōu)選的配置，以每升培養(yǎng)基每分鐘0.2升空氣的通氣率對(duì)發(fā)酵罐進(jìn)行通氣。如下面實(shí)施例部分的材料與試驗(yàn)方法中所述，黃胞原毛平革菌培養(yǎng)于無(wú)錳離子并且含有甘油作為碳源的條件下。本發(fā)明的甘油優(yōu)選以3-20克/升的濃度提供。根據(jù)目前優(yōu)選的配置，甘油以6克/升的濃度提供。在從上述真菌中提純木質(zhì)素過(guò)氧化物酶同功酶H1的過(guò)程中，純化出來(lái)的蛋白質(zhì)的酶活通過(guò)310nm處吸收的變化被進(jìn)一步檢測(cè)，該變化是由于藜，基醇氧化為藜,醛所致。由于木質(zhì)素過(guò)氧化物酶同功酶H1可由同功酶H2的翻譯后去磷酸化而得到(KuanandTien，1989)，因此，本發(fā)明所采用的木質(zhì)素過(guò)氧化物酶可以通過(guò)將木質(zhì)素過(guò)氧化物酶同功酶H2去磷酸化而制備。酶的細(xì)菌細(xì)胞中提取，如美國(guó)專(zhuān)利5，200，338中所述。例如，細(xì)菌細(xì)胞，例如E.coli,可以被包括LIP編碼序列(SEQIDNO:1)的表達(dá)載體所轉(zhuǎn)化，所述LIP編碼序列置于強(qiáng)的組成性啟動(dòng)子(例如SP6)的調(diào)控下。在表達(dá)之后，可裂解細(xì)菌細(xì)胞，可以通過(guò)色譜技術(shù)收集LIP(細(xì)節(jié)參見(jiàn)Billman-Jacobe，1996，Cuir.Opin.Biotechnol.7:500-4;HarrisandEmtage，1986，Microbiol.Sci.3:28-31)。本發(fā)明所采用的木質(zhì)素修飾酶也可以從哺乳動(dòng)物細(xì)胞系中提取，例如HeLa細(xì)胞。在這種情況下，LIP編碼序列位于合適的表達(dá)載體(例如pCDNA3.1,InvitrogenLifeTechnologies,Frederick,MD，USA)中的強(qiáng)的哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子(例如CMV)下。在用表達(dá)載體轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞之后，LIP表達(dá)產(chǎn)物可以通過(guò)常規(guī)純化和色譜技術(shù)從細(xì)胞或培養(yǎng)基(例如通過(guò)修飾LIP序列以包括分泌信號(hào))中提取(詳見(jiàn)CunhaandAires-Bairos，2002.Mol.Bioteelmol.20:29-40)。雖然木質(zhì)素修飾酶可以施用于皮膚或毛發(fā)而無(wú)需共同施用另外的化合物，但是當(dāng)木質(zhì)素修飾酶LIP在作為氧化激活劑的電子受體(也就是能氧化底物的分子)的存在下和/或酚類(lèi)化合物例如藜聲基醇(Harvey等，1992，BiochemSocTrans20:345-9)及作為氧化介導(dǎo)劑的藜聲醚(Ward等，EnzymeandMicrobialTechnology(2002)，30:490-498)存在下施用時(shí)，其增亮能力被提高。因此，按照本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，木質(zhì)素修飾酶在氧化激活劑例如過(guò)氧化氫和氧化介導(dǎo)劑例如藜,基醇施用之前、同時(shí)或之后施用，木質(zhì)素修飾酶本身可以用于皮膚或毛發(fā)，但是，為了提高增亮效率，木質(zhì)素修飾酶優(yōu)選包含在化妝品組合物中，該化妝品組合物用于特定用途，例如一般性皮膚增亮、雀斑增亮或毛發(fā)增亮。這些化妝品組合物可以包含表皮滲透劑例如丁二醇和二甘醇單乙醚，以及毛發(fā)滲透劑例如烷醇胺。此處所用的術(shù)語(yǔ)"化妝品組合物"是指包括本文所描述的活性成分(例如LIP)和另外的化學(xué)成分例如生理學(xué)上合適的載體和賦形劑、氧化激活劑和/或氧化介導(dǎo)劑的制品?；瘖y品組合物的目的是便于將活性成分給予生物體。此后，所使用的短語(yǔ)"合適的載體"是指不會(huì)對(duì)生物體產(chǎn)生顯著干擾并且不會(huì)抵消木質(zhì)素修飾酶的生物學(xué)活性和性質(zhì)的栽體或稀釋劑。此處術(shù)語(yǔ)"賦形劑，，是指加入到化妝品組合物中以進(jìn)一步方便活性成分給予的惰性物質(zhì)。賦形劑的非限制性實(shí)例包括碳酸鈣、磷酸鈣、各種糖和各種類(lèi)型的淀粉、纖維素衍生物、明膠、植物油和聚乙二醇?；瘖y品組合物可以以局部方式施用，例如直接將化妝品組合物施用到患者的組織區(qū)域內(nèi)。合適的施用途經(jīng)可以包括例如局部、皮下和皮內(nèi)注射。本發(fā)明的化妝品組合物可以通過(guò)本領(lǐng)域公知的方法制備，例如通過(guò)常規(guī)的混合、溶解、造粒、包糖衣、研粉、乳化、作成膠嚢、包埋或凍干法。因此，用于本發(fā)明的化妝品組合物可以利用一種或多種生理學(xué)上可以接受的包含賦形劑和輔劑的栽體以常規(guī)方式配制，所述賦形劑和輔劑有助于將活性成分加工為制劑。適當(dāng)?shù)呐浞揭蕾?lài)于所選擇的給藥方法。對(duì)于注射，化妝品組合物的活性成分可以在水溶液中配制，優(yōu)選生理學(xué)相容的緩沖液例如Hank，s溶液、Ringer's溶液或生理鹽水緩沖液?；蛘?，活性成分可以是干粉形式，在使用前與合適的賦形劑，例如基于無(wú)熱原水的溶液，進(jìn)行重構(gòu)。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠確定治療有效的量，特別是在閱讀了本發(fā)明提供的細(xì)節(jié)之后。對(duì)于本發(fā)明方法中所使用的任何制劑，治療有效的量或劑量可以最初通過(guò)體外試驗(yàn)進(jìn)行估計(jì)。如實(shí)施例部分所示，LIP和過(guò)氧化氫的濃度可以通過(guò)體外試驗(yàn)最優(yōu)化，并進(jìn)一步適應(yīng)于體內(nèi)使用。此外，可以在組織培養(yǎng)體系或動(dòng)物模型中準(zhǔn)備劑量，以獲得想要的濃度或滴度。此類(lèi)信息可用于更準(zhǔn)確地確定人類(lèi)中有用的劑量。取決于皮膚色素沉著疾病(例如黃褐斑、黑斑病、黃褐病和色斑)的嚴(yán)重程度以及皮膚的反應(yīng)性，劑量可以是單次或多次給藥，療程持續(xù)數(shù)天至數(shù)周，或直到治愈或獲得皮膚疾病的緩解。當(dāng)然，組合物的施用量將取決于所治療的受試者、疾病的嚴(yán)重程度、給藥方式、醫(yī)師的判斷等。包含在本發(fā)明的化妝品組合物中的木質(zhì)素修飾酶也可以以更高的濃度提供，可由醫(yī)師作為治療皮膚色素沉著疾病例如黃褐斑、黑斑病、黃褐病和色斑的藥物合物來(lái)開(kāi)具處方。下面描述了包含木質(zhì)素修飾酶的用于皮膚或毛發(fā)增亮的配方。皮膚增亮為了最優(yōu)化并控制皮膚增亮，木質(zhì)素修飾酶優(yōu)選包含在用于皮膚增亮目的的化妝品組合物中。由于本發(fā)明的皮膚增亮化妝品組合物用于體內(nèi)，因此該組合物優(yōu)選具有高純度并且基本不含可能有害的雜質(zhì)，例如至少食品(NationalFood，NF)級(jí)，一般至少分析級(jí)，優(yōu)選至少藥物級(jí)。如果給定的化合物必須在使用前合成，這樣的合成或后續(xù)的純化應(yīng)當(dāng)優(yōu)選獲得基本不含任何可能有毒的雜質(zhì)的產(chǎn)品，所述雜質(zhì)在所述合成或純化步驟中可能用到?；钚猿煞职诒景l(fā)明的化妝品組合物中的木質(zhì)素修飾酶，例如木質(zhì)素過(guò)氧化物酶，的濃度選自1-100U/gr的范圍。根據(jù)目前已知的配置，包含在本發(fā)明的化妝品組合物中的木質(zhì)素修飾酶以選自5-100U/gr范圍的濃度提供?？梢岳斫?，木質(zhì)素修飾酶的優(yōu)選濃度是根據(jù)該組合物的特定用途選擇的，因此，對(duì)于一般性皮膚增亮而言，所采用的優(yōu)選濃度是5-20U/gr，而對(duì)于雀斑增亮而言，采用的是更寬的濃度范圍5-100U/gr。皮膚增亮化妝品組合物中所使用的電子受體(氧化激活劑)優(yōu)選是以至少0.005%的濃度提供的過(guò)氧化氫。過(guò)氧化氫穩(wěn)定，但在中性或堿性條件下會(huì)分解形成水和活性氧。該活性氧的反應(yīng)性是^(艮強(qiáng)的。化妝品組合物優(yōu)選緩沖到pH為4或更低，因?yàn)槟举|(zhì)素過(guò)氧化物酶只有在低于4的pH下才有活性，優(yōu)選pH2.5-3.5，過(guò)氧化氫在這樣的pH下穩(wěn)定。任何能夠維持pH4或更低pH的緩沖液都可以使用。因此，采用乙酸、酒石酸、磷酸或檸檬酸的緩沖液可以用于皮膚增亮化妝品組合物。如下面的實(shí)施例部分所示，本發(fā)明的過(guò)氧化氫用磷酸穩(wěn)定在pH3.5。本發(fā)明中所使用的氧化介導(dǎo)劑(oxidizingmediators)是芳香族小分子，或更具體地是甲氧基化合物，其提高了氧化勢(shì)(oxidativepotential)和木素修飾酶的穩(wěn)定性。本發(fā)明中所使用的優(yōu)選氧化介導(dǎo)劑是藜f基醇和藜，醚。如實(shí)施例部分所示，包含在本發(fā)明的化妝品組合物中的藜聲基醇優(yōu)選在水中稀釋到至少0.05%的濃度。表皮滲透劑為了提高活性成分(例如LIP)的經(jīng)皮吸收，可以向化妝品組合物中加入一系列試劑中的一種或多種，包括但不限于二甲亞砜、二甲基乙酰胺、二甲基曱酰胺、表面活性劑、azone、醇、丙酮、丙二醇和聚乙二醇。如下面的實(shí)施例部分所示，木質(zhì)素修飾酶LIP和活化劑過(guò)氧化氫優(yōu)選以最適于提高LIP皮膚滲透的方式和濃度與表皮滲透劑例如丁二醇和二甘醇單乙醚分別混合。本發(fā)明所用的丁二醇以至少1%的濃度提供，二甘醇單乙醚以至少3%的濃度提供。栽體除了此處所公開(kāi)的試劑的藥學(xué)有效量以外，本發(fā)明這一方面的化妝品組合物也包含皮膚病學(xué)可接受的載體。術(shù)語(yǔ)"皮膚病學(xué)可接受的載體"是指適用于局部施用至皮膚即角質(zhì)組織上，具有良好的美學(xué)性質(zhì)，與本發(fā)明的活性劑和任何其它成分相容，用于哺乳動(dòng)物安全無(wú)毒的栽體。載體的有效量選自如下范圍按組合物重量計(jì)，約50%至約99.99%,優(yōu)選約80%至約99.9%，更優(yōu)選約90%至約98%，最優(yōu)選約90%至約95%。乳劑本發(fā)明組合物中所用的載體可以是多種形式。這些形式包括乳劑栽體，包括但不限于水包油、油包水、水包油包水(water-in-oil-in-water)及聚碰氧坑包水包油(oil-in-water-in-silicone)乳劑、乳膏、軟膏、水溶液、洗劑或氣溶膠。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，給定的組分將主要分布至水相或油/聚硅氧烷相中，這取決于組合物中該組分的水溶性/分散性。根據(jù)本發(fā)明的乳劑一般含有藥學(xué)有效量的此處公開(kāi)的試劑以及脂質(zhì)或油。脂質(zhì)和油可以來(lái)自動(dòng)物、植物或石油，可以是天然的或合成的(即人造的)。優(yōu)選的乳劑也含有濕潤(rùn)劑，例如丙三醇。乳劑優(yōu)選還含有按載體重量計(jì)約1%至約10%，更優(yōu)選約2%至約5%的乳化劑。乳化劑可以是非離子型、陰離子型或陽(yáng)離子型。合適的乳化劑描述于例如1973年8月28日授予Dickert等人的美國(guó)專(zhuān)利US3，755，560，1983年12月20日授予Dixon等人的美國(guó)專(zhuān)利US4，421，769，以及McCutcheon'sDetergentsandEmulsifiers，NorthAmericanEdition,pages317-324(1986)。乳劑還可以含有消泡劑，以4吏在應(yīng)用于角質(zhì)組織之后所起的泡沫最小化。消泡劑包括高分子量聚硅氧烷和用于此類(lèi)用途的本領(lǐng)域公知的其它材料。合適的乳劑可以具有較寬范圍的粘度，這取決于預(yù)期的產(chǎn)品形式。優(yōu)選的示例性低粘度乳劑具有約50厘沲或更小的粘度，更優(yōu)選約10厘沲或更小，最優(yōu)選約5厘沲或更小。乳劑也可以含有消泡劑，以使在應(yīng)用于角質(zhì)組織之后所起的泡沫最小化。消泡劑包括高分子量聚硅氧烷和用于此類(lèi)用途的本領(lǐng)域公知的其它材料。一種類(lèi)型的乳劑是聚硅氧烷包水乳劑。聚硅氧烷包水乳劑含有連續(xù)的聚硅氧烷相和分散的水相。優(yōu)選的本發(fā)明聚硅氧烷包水乳劑包含按重量計(jì)約1%至約60%，優(yōu)選約5%至約40%，更優(yōu)選約10%至約20%的連續(xù)的聚硅氧烷相。連續(xù)的聚硅氧烷相作為外部相存在，其含有或包圍著不連續(xù)的水相，下面將對(duì)此進(jìn)行描述。連續(xù)的聚硅氧烷相可以含有聚有機(jī)硅氧烷油。優(yōu)選的聚硅氧烷包水乳劑系統(tǒng)被制備出來(lái)以提供氧化穩(wěn)定的載體，用于運(yùn)載此處公開(kāi)的藥學(xué)有效量的試劑。這些優(yōu)選乳劑的連續(xù)的聚硅氧烷相包含按重量計(jì)約50%至約99.9%的有機(jī)聚硅氧烷油和按重量計(jì)小于約50%的非聚硅氧烷油。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，連續(xù)聚硅氧烷相包含按連續(xù)聚硅氧烷相的重量計(jì)至少約50%,優(yōu)選約60%至約99.9%，更優(yōu)選約70%至約99.9%，更優(yōu)選約80%至約99.9%的聚有機(jī)硅氧烷油，以及按連續(xù)聚硅氧烷相的重量計(jì)最多約50%的非聚硅氧烷油，優(yōu)選小于約40%,更優(yōu)選小于約30。/Q，更優(yōu)選小于約10%，最優(yōu)選小于約2%,與相當(dāng)?shù)暮械蜐舛染塾袡C(jī)硅氧烷油的油包水乳劑相比，這些有用的乳劑系統(tǒng)可以提供持續(xù)時(shí)間更長(zhǎng)的更強(qiáng)的氧化穩(wěn)定性。在連續(xù)聚硅氧烷相中非聚硅氧烷油的濃度被最小化或被完全避免，以便可能進(jìn)一步增強(qiáng)組合物中本發(fā)明的活性化合物的氧化穩(wěn)定性。這種類(lèi)型的聚硅氧烷包水乳劑在1997年11月25日授予Mason等人的美國(guó)專(zhuān)利US5，691，380中進(jìn)行了描述。用于組合物中的有機(jī)聚硅氧烷油可以是揮發(fā)性的，非揮發(fā)性的，或揮發(fā)性和非揮發(fā)性聚硅氧烷的混合物。在該語(yǔ)境中使用的術(shù)語(yǔ)"非揮發(fā)性的，，是指那些在室溫條件下為液態(tài)并且閃點(diǎn)(在一個(gè)大氣壓下)大于約IOO攝氏度的聚硅氧烷。在該語(yǔ)境中使用的術(shù)語(yǔ)"揮發(fā)性的"是指所有其它的聚硅氧烷油。合適的有機(jī)聚硅氧烷可以選自大量的聚硅氧烷，覆蓋較寬范圍的揮發(fā)性和粘度。合適的有機(jī)聚硅氧烷油的實(shí)例包括聚烷基硅氧垸、環(huán)狀聚烷基硅氧烷和聚烷基芳基硅氧烷，這對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是已知的，并且商購(gòu)可得。連續(xù)聚硅氧烷相可以含有一種或多種非聚硅氧烷油。在連續(xù)聚硅氧烷相中非聚硅氧烷油的濃度優(yōu)選被最小化或被完全避免，以便進(jìn)一步增強(qiáng)組合物中藥學(xué)活性劑的氧化穩(wěn)定性。合適的非聚硅氧烷油的熔點(diǎn)在約一個(gè)大氣壓下為約25。C或更低。適用于連續(xù)聚硅氧烷相的非聚硅氧烷油的實(shí)例是局部人用產(chǎn)品化工領(lǐng)域公知的那些油包水乳劑形式的非聚硅氧烷油，例如礦物油、植物油、合成油、半合成油等。本發(fā)明的有用的局部組合物包含約30%至約90%,更優(yōu)選約50%至約85%，最優(yōu)選約70%至約80%的分散水相。術(shù)語(yǔ)"分散相"對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是公知的，它暗示該相以懸浮于連續(xù)相或被連續(xù)相包圍的小顆粒或液滴的形式存在。分散相也已知為內(nèi)部或不連續(xù)相。分散水相是分散的小的水性微粒或液滴，其懸浮于前述的連續(xù)聚硅氧烷相中或被連續(xù)聚硅氧烷相包圍。水相可以是水，或水與一種或多種水溶性或水分散性成分的組合。此類(lèi)任選成分的非限制性實(shí)例包括增稠劑、酸、堿、鹽、螯合劑、樹(shù)膠、水溶性或水分散性醇和多元醇、緩沖劑、防腐劑、防曬劑、著色劑等。本發(fā)明的局部組合物的分散水相中通常含有按組合物重量計(jì)約25%至約90%,優(yōu)選約40。/。至約80%，更優(yōu)選約60%至約80%的水。本發(fā)明的聚硅氧烷包水乳劑優(yōu)選包含乳化劑。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，組合物含有按組合物重量計(jì)約0.1%至約10%的乳化劑，更優(yōu)選約0.5%至約7.5%，最優(yōu)選約1%至約5%的乳化劑。乳化劑有助于水相在連續(xù)聚硅氧烷相中的分散和懸浮。很多乳化劑可以用于此處以形成優(yōu)選的聚硅氧烷包水乳劑。已知的或常規(guī)的乳化劑可以用于組合物中，前提是選定的乳化劑與組合物的必需組分在化學(xué)上和物理上相容，并且提供了預(yù)期的分散特征。合適的乳化劑包括聚硅氧烷乳化劑，例如有機(jī)修飾的有機(jī)聚硅氧烷，對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員也已知為聚硅氧烷表面活性劑，含有非聚硅氧烷的乳化劑及其化合物，本領(lǐng)域技術(shù)人員已知其可用于局部人用產(chǎn)品。有用的乳化劑包括很多聚硅氧烷乳化劑。這些聚硅氧烷乳化劑通常是有機(jī)修飾的有機(jī)聚硅氧烷，對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員也已知為聚硅氧烷表面活性劑。合適的乳^f匕劑描述于例如McCutcheon's，DetergentsandEmulsifiers，NorthAmericanEdition(1986)，AlluredPublishingCorporation出版；1991年4月30日授予Ciotti等人的美國(guó)專(zhuān)利US5,011,681;1983年12月20日授予Dixon等人的美國(guó)專(zhuān)利US4,421,769;1973年8月28日授予Dickert等人的美國(guó)專(zhuān)利US3，755，560之中。其它優(yōu)選的局部載體包括水包油乳劑，具有連續(xù)的水相和分散于其中的疏水的、水不溶相("油相")。包含水包油乳劑的合適載體的實(shí)例描述于1991年12月17日授予Turner,D.J.等人的美國(guó)專(zhuān)利5，073，371和1991年12月17日授予Turner,D.J.等人的美國(guó)專(zhuān)利5，073，372。下面詳細(xì)描述了特別優(yōu)選的水包油乳劑，其中含有結(jié)構(gòu)劑(structuringagent)、親水表面活'性劑和水。優(yōu)選的水包油乳劑包含結(jié)構(gòu)劑以助于形成液體結(jié)晶凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。不受理論限制，據(jù)信該結(jié)構(gòu)劑有助于為組合物提供流變學(xué)特征，這對(duì)組合物的穩(wěn)定性有好處。結(jié)構(gòu)劑也可以作為乳化劑或表面活性劑起作用。優(yōu)選的本發(fā)明組合物含有按組合物重量計(jì)約0.5%至約20%，更優(yōu)選約1%至約10%，最優(yōu)選約1%至約5%的結(jié)構(gòu)劑。優(yōu)選的本發(fā)明結(jié)構(gòu)劑選自硬脂酸、棕櫚酸、十八烷醇、十六烷醇、山崳醇、硬脂酸、棕櫚酸、具有平均約1至約21個(gè)氧化乙烯單元的十八烷醇的聚乙二醇醚、具有平均約1至約5個(gè)氧化乙烯單元的十六烷醇的聚乙二醇醚及其混合物。大量的陰離子表面活性劑在此處也是有用的。參見(jiàn)例如1975年12月30日授予Laughlin等人的美國(guó)專(zhuān)利US3,929,678。此外，兩性和兩性離子表面活性劑在此處也是有用的。優(yōu)選的水包油乳劑包含約0.05%至約10%，優(yōu)選約1%至約6%，更優(yōu)選約1%至約3%的至少一種親水表面活性劑，其可以將親水材料分散于水相中(百分比按局部載體的重量計(jì))。表面活性劑最少必須足夠親水以在水中分散。合適的表面活性劑包括已知的大量陽(yáng)離子型、陰離子型、兩性離子和兩性表面活性劑中的任何一種。參見(jiàn)McCutcheon's，DetergentsandEmulsifiers，NorthAmericanEdition(1986)，AlluredPublishingCorporation出版；1991年4月30日授予Ciotti等人的美國(guó)專(zhuān)利US5,011,681;1983年12月20日授予Dixon等人的美國(guó)專(zhuān)利US4,421,769;以及美國(guó)專(zhuān)利US3，755，560。所選的具體表面活性劑取決于組合物的pH和存在的其它組分。優(yōu)選的是陽(yáng)離子表面活性劑，特別是二烷基季銨化合物，其實(shí)例描述于1992年9月29曰授予McCall等人的美國(guó)專(zhuān)利US5,151,209;1992年9月29日授予Steuri等人的美國(guó)專(zhuān)利US5，151，210;美國(guó)專(zhuān)利US5，120，532;美國(guó)專(zhuān)利US4,387,090;美國(guó)專(zhuān)利US3，155，591;美國(guó)專(zhuān)利US3，929，678;美國(guó)專(zhuān)利US3,959,461;McCutcheon's,Detergents&Emulsifiers(NorthAmericanedition1979)M.C.PublishingCo.;以及Schwartz,等，SurfaceActiveAgents,TheirchemistryandTechnology,NewYork:IntersciencePublishers,1949?；蛘?，其它有用的陽(yáng)離子乳化劑包括氨基-酰胺。這些陽(yáng)離子乳化劑的非限制性實(shí)例包括氯化硬脂酰氨基丙基PG-二甲基銨磷酸鹽(stearamidopropylpG匿dimoniumchloridephosphate),氯^ffc山崳醜氨基丙基PG-二甲基銨(behenamidopropylPGdimoniumchloride),乙代硫酸硬脂酰氨基丙基乙基二甲基銨(stearamidopropylethyldimoniumethosulfate)，硬脂酰氨基丙基二甲基(乙酸肉豆蔻酯)氯化銨，硬脂酰氨基丙基二甲基十六-十八烷基(cetearyl)甲苯磺酸銨，硬脂酰氨基丙基二甲基氯化銨，硬脂酰氨基丙基二甲基乳酸銨及其混合物。優(yōu)選的水包油乳劑含有按局部載體重量計(jì)約25%至約98%,優(yōu)選約65%至約95%，更優(yōu)選約70%至約90%的水。局部組合物化妝品組合物可以以化妝品工業(yè)所采用的用于皮膚的多種形式中的任何一種進(jìn)行配制，包括溶液、洗劑、噴霧劑、乳膏、軟膏、油乳膏(salve)、凝膠等，如下文所述。優(yōu)選地，該化妝品組合物被配制為足夠粘以保持在所處理的皮膚區(qū)域上，不會(huì)很快蒸發(fā)，和/或不易被水洗掉，但輔以肥皂、清潔劑和/或香波時(shí)則易于除去。制備具有此類(lèi)屬性的組合物的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，詳細(xì)描述于Remington'sPharmaceuticalSciences,1990(supra);和PharmaceuticalDosageFormsandDrugDeliverySystems,6thed.，Williams&Wilkins(1995)。載體本發(fā)明的局部組合物包括但不限于洗劑和乳膏，可以包含皮膚病學(xué)可接受的潤(rùn)膚劑。此類(lèi)組合物優(yōu)選含有約2%至約50。/。的潤(rùn)膚劑，此處所使用的"潤(rùn)膚劑"是指用于防止或緩解干燥以及用于保護(hù)皮膚的材料。多種合適的潤(rùn)膚劑是已知的，并且可以用于此處。參見(jiàn)例如Sagarin,Cosmetics,ScienceandTechnology,2ndEdition,Vol.1,pp.3243(1972)，其中含有適合用作潤(rùn)膚劑的材料的多個(gè)實(shí)例。優(yōu)選的潤(rùn)膚劑是甘油。甘油的優(yōu)選用量是約0.001至約20%,更優(yōu)選約0.01至約10%，最優(yōu)選約O.l至約5%，例如3%。根據(jù)本發(fā)明的洗劑和乳骨一般包含溶液栽體系統(tǒng)以及一種或多種潤(rùn)膚劑。洗劑通常包含約1%至約20%,優(yōu)選約5%至約10%的潤(rùn)膚劑；約50%至約90%，優(yōu)選約60%至約80%的水；以及藥學(xué)有效量的此處所描迷的試劑。乳膏通常包含約5%至約50%，優(yōu)選約10%至約20%的潤(rùn)膚劑；約45%至約85%，優(yōu)選約50%至約75%的水；以及藥學(xué)有效量的此處所描述的試劑。本發(fā)明局部施用的化妝品組合物也可以包括另外的成分，添加這些成分例如用于豐富化妝品組合物的香氣和皮膚營(yíng)養(yǎng)因子。選擇此類(lèi)適用于人類(lèi)角質(zhì)組織而不會(huì)引起毒性、不相容、不穩(wěn)定、過(guò)敏反應(yīng)以及合理醫(yī)學(xué)判斷范圍內(nèi)的其它反應(yīng)的組分。此外，此類(lèi)任選組分是有用的，前提是它們不會(huì)無(wú)法令人接受地改變本發(fā)明活性化合物的益處。CTFACosmeticIngredientHandbook,SecondEdition(1992)描述了大量護(hù)膚品工業(yè)中常用的非限制性化妝品成分，其適合用于本發(fā)明的組合物中。這些成分類(lèi)別的實(shí)例包括研磨劑、吸收劑、美學(xué)成分例如香料、色素、調(diào)色劑/著色劑、精油、皮膚sensates、收斂劑等(例如丁香油、薄荷醇、樟腦、桉樹(shù)油、丁香酚、曱基乳酸、榛子餾出物)、抗痤瘡劑、抗結(jié)塊劑、消泡劑、抗微生物劑(例如碘丙基丁基氨基甲酸酯)、抗氧化劑、粘合劑、生物添加劑、緩沖劑、膨脹劑、螯合劑、化學(xué)添加劑、著色劑、化妝品收斂劑、化妝品殺蟲(chóng)劑、變性劑、藥物收斂劑、外部止痛劑、薄膜形成劑或材料，例如聚合物，用于輔助組合物的成膜性質(zhì)和直接性(substantivity)(例如二十碳烯和乙烯吡咯烷酮的共聚物)，不透明劑、pH調(diào)節(jié)劑、推進(jìn)劑、還原劑、多價(jià)螯合劑、皮膚調(diào)理劑(例如濕潤(rùn)劑，包括多樣化的和閉合的)、皮膚光滑(soothing)劑和/或愈合劑(例如泛醇和衍生物(例如乙基泛醇)、真聲薈(aloevera)、泛酸及其衍生物、尿嚢素、紅沒(méi)藥醇和甘草酸二鉀(dipotassiumglycyffhizinate))、皮膚治療劑、增稠劑和維生素及其衍生物?；瘖y品組合物可直接施用到皮膚上?；蛘?，可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的各種透皮給藥系統(tǒng)通過(guò)正常皮膚施用而給予，例如以時(shí)間釋放方式(timereleasedmanner)將組合物釋放到皮膚中的透皮貼劑。本領(lǐng)域已知的其它給藥系統(tǒng)包括壓力氣溶膠瓶、離子電滲療法或sonophoresis。離子電滲療法用于提高皮膚滲透性和協(xié)助透皮運(yùn)輸。美國(guó)專(zhuān)利US5,667,487和5,658,247公開(kāi)了適用于超聲波-離子電滲療法介導(dǎo)的治療劑穿過(guò)皮膚的轉(zhuǎn)運(yùn)的ionosonic裝置?；蛘呋虼送猓部梢允褂弥|(zhì)體或膠束作為運(yùn)送栽體。包含在本發(fā)明化妝品組合物中的活性成分適用于通過(guò)黑色素的氧化而增亮皮膚。但是，需要時(shí)可以通過(guò)加入還原劑而控制和停止該氧化反應(yīng)。這些試劑可以在單獨(dú)的化妝品組合物中配制，在需要時(shí)施用到皮膚上。毛發(fā)增亮劑活性成分按照本發(fā)明教導(dǎo)配制的毛發(fā)增亮組合物包括上述的氧化劑和介導(dǎo)劑。如下面的實(shí)施例部分所示，毛發(fā)增亮可以在1.5mM藜蘆基醇和pH3.5的酒石酸緩沖液中的8.8mM過(guò)氧化氫存在下實(shí)現(xiàn)。潤(rùn)膚劑潤(rùn)膚劑包括但不限于烴油和蠟，例如礦物油，石油等，植物和動(dòng)物油和脂肪，例如橄欖油，棕櫚油，蓖麻油，玉米油，大豆油等，羊毛脂及其衍生物，例如羊毛脂，羊毛脂油，羊毛脂蠟，羊毛脂醇等。其它潤(rùn)膚劑包括具有10到20個(gè)碳原子的脂肪酸的酯，例如包括肉豆蔻酸酯、硬脂酸酯、異硬脂酸酯、棕櫚酸酯等，例如肉豆蔻酸甲酯，肉豆蔻酸丙酯，肉豆蔻酸丁酯，硬脂酸酯丙，異硬脂酸丙酯，棕櫚酸丙酯等。其它潤(rùn)膚劑包括具有10到20個(gè)碳原子的脂肪酸，包括硬脂酸，肉豆蔻酸，月桂酸，異硬脂酸，棕櫚酸等。潤(rùn)膚劑也包括具有10到20個(gè)碳原子的脂肪醇，例如十六烷基醇，十四烷基醇，月桂基醇，異十八烷醇，十八烷醇等，雖然有些是水溶性的，但多羥基醇和聚醚衍生物也包括在潤(rùn)膚劑中，包括乙二醇，甘油，山梨醇，聚亞烷基二醇等，例如丙二醇，二丙二醇，聚乙二醇200-500等。水溶性實(shí)例是優(yōu)選的。表面活性劑乳化劑/表面活性劑優(yōu)選也用于本發(fā)明的毛發(fā)增亮組合物中。表面活性劑的實(shí)例包括但不限于疏水烷基、烯基或烷基芳基官能團(tuán)的聚氧代亞烷基氧化物(spolyoxyalkyleneoxide)縮合產(chǎn)物，所述官能團(tuán)具有可與親水烯化氧、聚環(huán)氧乙烷、環(huán)氧丙烷、環(huán)氧丁烷、聚氧化乙烯或聚乙二醇縮合的游離活潑氫。特別有效的是辛基苯酚與約7到約13摩爾環(huán)氧乙烷的縮合產(chǎn)物(Rohm&HaasCompany出售，商標(biāo)TRITON100系列產(chǎn)品)。其它成分例如香料、穩(wěn)定劑、染料、抗微生物劑、抗菌劑、抗凝劑、紫外線(xiàn)吸收劑等也包括在本發(fā)明的毛發(fā)增亮組合物中。調(diào)理劑對(duì)酸水解穩(wěn)定的調(diào)理劑，例如具有至少一個(gè)季銨部分和乙氧基化monoquat的聚硅氧烷化合物，優(yōu)選也被使用以穩(wěn)定及任選地增稠本發(fā)明的毛發(fā)增亮組合物。任選的增稠劑也可以包括進(jìn)來(lái)以提高組合物的美學(xué)效果并輔助將組合物施用到毛發(fā)上。優(yōu)選的非離子增稠劑的量是按重量計(jì)0%至約3%。示例性的增稠劑是甲基纖維素、羥基丁基甲基纖維素、羥基丙基纖維素、羥基丙基甲基纖維素、羥基乙基乙基纖維素和羥基乙基纖維素、二(氫化動(dòng)物油)苯二曱酰胺、交聯(lián)馬來(lái)酸酐-曱基乙烯基醚共聚物、瓜爾膠、黃原膠和阿拉伯膠。調(diào)理組合物的載體主要是水，但也可以包括有機(jī)溶劑以助于組合物的制備或提供美學(xué)性質(zhì)，例如粘度控制。合適的溶劑包括低級(jí)醇例如乙醇和異丙醇；二醇醚，例如2-丁氧基乙醇、乙二醇單乙醚、丙二醇和二乙二醇單乙醚或單甲醚及其混合物。非水性溶劑在本發(fā)明調(diào)理組合物中的存在量可以是按組合物中的載體總重量計(jì)約1%至約50%,具體約5%至約25%?？梢杂迷诓煌该髡{(diào)理物中的非限制性調(diào)理劑包括硬脂基(stearyl)三甲基氯化銨；山箭基三甲基氯化銨(behenetrimethylammoniumchloride);十六烷基三曱基溴化銨；豆油基三甲基氯化銨(soytrimoniumchloride);牛脂基三曱基氯化銨(tallowtrimoniumchloride);二氬化牛月旨基(dihyrogenatedtallow)二曱基氯化銨；山?；谆?behentrimethyl)銨硫酸二甲酯(methosulfate);Peg-2Oleammoniumchloride;二氫化牛月旨基二甲基溴化銨；二氫化牛脂基二甲基銨硫酸二甲酯；棕櫚基三甲基氯化銨；氫化牛脂基三甲基氯化銨；氫化牛脂基三甲基溴化銨；二鯨蠟基二甲基氯化銨；二硬脂基二甲基氯化銨；二棕櫚基二甲基氯化銨；氫化牛脂基三甲基銨硫酸二甲酯；十六烷基三甲基甲苯磺酸銨二十烷基三甲基氯化銨；以及二牛脂基二曱基氯化銨?？梢杂迷诓煌该鹘M合物中的材料包括脂肪酸酯，不透明聚合物，例如苯乙烯聚合物，例如來(lái)自Morton，International，Inc.的OPACIFIER653;以及脂肪醇。下面是脂肪醇的非限制性示列十六烷基醇；十八烷醇；十六烷基-十八烷基醇(cetearylalcohol);山崳醇和花生醇(arachidylalcohol)。不透明的本發(fā)明調(diào)理組合物也可以包才舌LexamineS-13，雙十六烷基氯4乜銨和ceteareth20。如果需要的話(huà)，本發(fā)明的組合物可以置于分散裝置或試劑盒中，配有適當(dāng)?shù)氖褂谜f(shuō)明和標(biāo)簽，指明FDA已批準(zhǔn)用于皮膚或毛發(fā)增亮。用于增亮皮膚區(qū)域或毛發(fā)的試劑盒可以包括例如容器，其中包括與適當(dāng)?shù)木彌_液、載體、滲透劑等一起提供的木質(zhì)素修飾酶，以及包括上述氧化劑和介導(dǎo)劑的另外的容器。也可以通過(guò)使用本領(lǐng)域已知的分子生物學(xué)手段將木質(zhì)素修飾酶引入到皮膚區(qū)域的細(xì)胞中。因此，根據(jù)本發(fā)明另一方面，提供了一種增亮受試者皮膚區(qū)域的方法。根據(jù)本發(fā)明這一方面的方法是通過(guò)在皮膚區(qū)域的細(xì)胞內(nèi)以適于I'、',、、"、所述的表達(dá)可以通過(guò)用表達(dá)載體轉(zhuǎn)化皮膚細(xì)胞而實(shí)現(xiàn)，所述表達(dá)載體包括與啟動(dòng)子序列功能連接的木質(zhì)素修飾酶編碼序列。為了產(chǎn)生這樣的表達(dá)載體，編碼木質(zhì)素修飾酶的多核苷酸片段(例如LIPHI同功酶，SEQIDNO:1)可以被連接到市售的表達(dá)載體系統(tǒng)，所述表達(dá)載體系統(tǒng)適于轉(zhuǎn)化哺乳動(dòng)物細(xì)胞和指導(dǎo)木質(zhì)素修飾酶在被轉(zhuǎn)化細(xì)胞中的表達(dá)?？梢岳斫猓@樣的市售載體系統(tǒng)可以通過(guò)常用的重組技術(shù)容易地進(jìn)行修飾，以替換、復(fù)制或突變現(xiàn)有的啟動(dòng)子或增強(qiáng)子序列，和/或引入任何另外的多核苷酸序列，例如編碼另外的選擇標(biāo)記的序列或編碼報(bào)告多肽的序列。用于本發(fā)明的合適的哺乳動(dòng)物表達(dá)栽體包括但不限于可從Invitrogen獲得的pcDNA3、pcDNA3.1(+/國(guó))、pZeoSV2(+/誦)、pSecTag2、pDisplay、pEF/myc/cyto、pCMV/myc/cyto、pCR3.1，可從Promega獲得的pCI，可從Stratagene獲得的pBK-RSV和pBK-CMV，可從Clontech獲得的pTRES,以及它們的衍生物。用于本發(fā)明這一方面的合適的表達(dá)栽體是基于腺病毒的載體。腺病毒載體廣泛用于藥物應(yīng)用，包括皮膚基因療法(GhazizadehS，TaichmanLB.(2000)H畫(huà)GeneTher11:2247-51;CarterPJ，SamulskiRJ.(2000).IntJMolMed6:17-27)。上述表達(dá)載體可以采用多種轉(zhuǎn)運(yùn)手段轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞中，包括但不限于脂質(zhì)體、表皮貼劑、離子電滲療法或受體介導(dǎo)的胞飲作用。在后一種方法中，已知將經(jīng)歷胞鋇作用(endocytosis)的細(xì)胞表面受體的抗體或配體與編碼木質(zhì)素修飾酶的DNA序列通過(guò)共價(jià)連接的聚陽(yáng)離子附加物(例如聚賴(lài)氨酸、魚(yú)精蛋白)絡(luò)合在一起。所述絡(luò)合物保持了其對(duì)細(xì)胞表面的結(jié)合特異性，并且當(dāng)其通過(guò)正常的胞飲作用進(jìn)入核內(nèi)體分隔(endosomalcompartment)時(shí)被吸收到細(xì)胞中。此外，必須采取步驟以避免DNA在核內(nèi)體-溶酶體中被降解。可以在轉(zhuǎn)染過(guò)程中用縮溶酶體劑(lysosomatropicagent)氯會(huì)處理細(xì)胞?；蛘?，可以使用通過(guò)胞飲作用進(jìn)行細(xì)胞并具有核內(nèi)體"逃脫"(breakout)能力的病毒成分。與配體-DNA復(fù)合物偶聯(lián)的復(fù)制缺陷型腺病毒提供了組織培養(yǎng)細(xì)胞的幾乎100%的體外轉(zhuǎn)染效率。初步研究已經(jīng)證明了該方法在體內(nèi)特異性地將DNA靶向至選定的細(xì)胞類(lèi)型方面的潛力(GuyJ,DrabekD,AntoniouM.(1995).MolBiotechnol19953:237-48)。在耙細(xì)胞中表達(dá)后，所述的電子受體和介導(dǎo)劑優(yōu)選被施用到所處理的區(qū)域以助于增亮。在乾細(xì)胞中表達(dá)木質(zhì)素修飾酶是特別有利的，因?yàn)樗朔嗣副旧淼募?xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)的需要，因此可能提高增亮效率。本發(fā)明另外的目的、優(yōu)點(diǎn)和新特征在本領(lǐng)域技術(shù)人員閱讀下面的非限制性實(shí)施例后將變得更明顯。此外，前面描述的以及下面的權(quán)利要求中要求保護(hù)的本發(fā)明的各種實(shí)施方式和方面中的每一個(gè)都能在下面的實(shí)施例中找到實(shí)驗(yàn)支持。實(shí)施例現(xiàn)在將參考下面的實(shí)施例，其與上面的描述一起，以非限制性的方式解釋了本發(fā)明。一般而言，此處使用的術(shù)語(yǔ)和本發(fā)明中使用的實(shí)驗(yàn)程序包括分子、生化、微生物和重組DNA技術(shù)。這些技術(shù)在文獻(xiàn)中有詳盡的解釋。參見(jiàn)例如，"MolecularCloning:AlaboratoryManual"Sambrook等，(1989);"CurrentProtocolsinMolecularBiology"VolumesI-I1IAusubel，R.M.，ed.(1994);Ausubel等,"CurrentProtocolsinMolecularBiology",JohnWileyandSons,Baltimore,Maryland(1989);Perbal，"APracticalGuidetoMolecularCloning",JohnWiley&Sons,NewYork(1988);Watson等，"RecombinantDNA"，ScientificAmericanBooks,NewYork;Birren等(eds)"GenomeAnalysis:ALaboratoryManualSeries",Vols.1-4，ColdSpringHarborLaboratoryPress，NewYork(1998);美國(guó)專(zhuān)利US4，666，828;4，683，202;4,801,531;5，192，659和5，272，057中所述的方法；"CellBiology:ALaboratoryHandbook",Volumes1-111Cellis，J.E.,ed.(1994);"CurrentProtocolsinImmunology"VolumesI-IIIColiganJ.E.，ed.(1994);Stitesetal.(eds)，"BasicandClinicalImmunology"(8thEdition)，Appleton&Lange，Norwalk，CT(1994);MishellandShiigi(eds)，"SelectedMethodsinCellularImmunology",W.H.FreemanandCo.,NewYork(1980);可用的免疫測(cè)試在專(zhuān)利和科學(xué)文獻(xiàn)中有大量描述，參見(jiàn)例如，美國(guó)專(zhuān)利US3，791，932;3,839,153;3，850，752;3，850，578;3，853，987;3,867,517;3，879，262;3,901,654;3,935,074;3,984,533;3，996，345;4,034,074;4，098，876;4，879，219;5，011，771以及5，281，521;"OligonucleotideSynthesis"Gait，M.J.，ed.(1984);"NucleicAcidHybridization"Hames,B.D.，andHigginsS.J.，eds.(1985);"TranscriptionandTranslation"Haines,B.D.,andHigginsS.J.，eds.(1984);"AnimalCellCulture"Freshney，R.L,ed.(1986);"ImmobilizedCellsandEnzymes"IRLPress,(1986);"APracticalGuidetoMolecularCloning"Perbal,B.，(1984)and"MethodsinEnzymology"Vol.1-317，AcademicPress;"PCRProtocols:AGuideToMethodsAndApplications",AcademicPress，SanDiego,CA(1990);Marshaketal.，"StrategiesforProteinPurificationandCharacterization陽(yáng)ALaboratoryCourseManual"CSHLPress(1996);所有這些文獻(xiàn)都以引用的方式包括在本文中，好像它們被充分闡迷一樣。在該文件中提供了其它的一般性參考文獻(xiàn)。其中的步驟據(jù)信在本領(lǐng)域是公知的并為了便于讀者閱讀而提供。其中所含有的全部信息都以引用的方式包括在本文中。背景黃胞原毛平革菌真菌中的木質(zhì)素過(guò)氧化物酶在黃胞原毛平革菌BKM-F-1767培養(yǎng)物的細(xì)胞外液中，有超過(guò)12種血紅素蛋白顯示木質(zhì)素裂解活性。這些蛋白可以分為兩種類(lèi)型的糖基化血紅素過(guò)氧化物酶，木質(zhì)素過(guò)氧化物酶(LIP)和錳過(guò)氧化物酶(MNP)。同功酶H1，H2，H6，H7,H8和H10已被報(bào)道是LIP，H3、H4、H5和H9已被鑒定為MNP(Farrell黃胞原毛平革菌，1989)。黃胞原毛平革菌的LIP同功酶是由結(jié)構(gòu)相關(guān)的基因家族編碼的，在其物理性質(zhì)、底物特異性和穩(wěn)定性上不相同(Farrell等，1989;Stewart等，1992)。作為導(dǎo)致它們分泌的過(guò)程的一部分，LIP同功酶被蛋白質(zhì)裂解并糖基化(Ghose，1987;Ritch等，1991;TienandKirk，1984)。此外，已報(bào)道LIP同功酶H2、H6、H8和HIO在甘露糖6-磷酸部分上被磷酸化，包含在精氨酸連接的寡糖上。成熟細(xì)胞外液分析產(chǎn)生了如下啟示，即同功酶HI可能是由H2的翻譯后去磷酸化得到的(KuanandTien，1989)。黃胞原毛平革菌中木質(zhì)素裂解酶的表達(dá)是由氮和碳受限而觸發(fā)的自發(fā)(idiophasic)事件，高度依賴(lài)于培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基成分(Dosoretz和Grethlein,1991;FaisonandKirk,1985;Stewart等，1992;vanderWoude等，1993)。LIP的形成特別依賴(lài)于培養(yǎng)物暴露于高氧壓力下(Dosoretz等，1990;Faison和Kirk,1985),有人認(rèn)為，氧向靜態(tài)培養(yǎng)物的轉(zhuǎn)移是受限制的，因此就需要培養(yǎng)物頂層有較高的氧分壓以使下面的菌絲體獲得足夠的氧(Leisola等，1983;Michel等，1992)。在通過(guò)將真菌固定在非浸沒(méi)液體培養(yǎng)基中的多孔支持物上而暴露于空氣的培養(yǎng)物中觀察到了LIP的形成，上述措施提高了氧氣對(duì)真菌的可得性(Dosoretz等，1990;Popp等，1990)。培養(yǎng)基中Mn2+的濃度對(duì)LIP和MNP的形成產(chǎn)生了不良影響。雖然MNP的形成依賴(lài)于Mn，其提高了MNP的轉(zhuǎn)錄，但LIP的形式被Mn所抑制。Rothschild等，(1999)表明，在黃胞原毛平革菌的氮受限和氮過(guò)量培養(yǎng)物中，LIP形成所需的較高的氧水平可被Mn缺乏所代替。材料和實(shí)驗(yàn)方法用于生產(chǎn)木質(zhì)素過(guò)氧化物酶的黃胞原毛平革菌的生長(zhǎng)真菌黃胞原毛平革菌BKMF-1767(ATCC24725)被維持在4。C的2%麥芽提取物瓊脂培養(yǎng)板上(Difco，Detroit,MI，USA),制備孢子懸浮液通過(guò)在含有高壓滅菌的濃度為39g/升的馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PotatoDextroseAgar,PDA)的Petri皿中培養(yǎng)來(lái)自培養(yǎng)板的塞子來(lái)獲得真菌孢子。然后在37。C培養(yǎng)PDA板最多2周。為了制備孢子懸浮液，用0.9%NaCl涂覆PDA板，通過(guò)無(wú)菌玻璃織物過(guò)濾分生孢子懸液，收集孢子懸浮液。然后在-80。C冰凍保存孢子懸浮液。接種體制備將孢子接種到無(wú)菌接種培養(yǎng)基中(參見(jiàn)下面的配方)，至終濃度為7.5x105孢子/ml。將90ml混合物加入到每一批次的發(fā)酵液中(TienandKirk,1988.Meth.Enzymol.161:238-490;Dosoretz等，1990，Appl，Microbiol.Biotechnol.34:131-7)，然后用棉花塞子密封這些批次。培養(yǎng)物在37。C靜態(tài)生長(zhǎng)48h作為粗培養(yǎng)物(shallowculture)。為接種培養(yǎng)物，將發(fā)酵批次中的物質(zhì)用攪拌器(Waring,England)混合2miii。攪拌的罐狀反應(yīng)器(STR)發(fā)酵罐中真菌的生長(zhǎng)在真菌生長(zhǎng)之前，聚氨酯泡沫被固定在發(fā)酵罐的冷卻管附近，整個(gè)STR發(fā)酵罐被滅菌。然后向STR發(fā)酵罐中倒入10升發(fā)酵培養(yǎng)基(參見(jiàn)下面的配方)并加入900ml混合接種體(10個(gè)發(fā)酵批次的內(nèi)容物)。發(fā)酵耀與冷卻系統(tǒng)相連以維持37。C的溫度，以100rpm攪拌。以2ml/min的速度將滅菌空氣引入到發(fā)酵罐中。在生長(zhǎng)兩天后，將流速改為4ml/min。繼續(xù)生長(zhǎng)3-5天。通過(guò)將下述溶液混合并用0.45fim濾膜(MSI，Westborough，MA，USA)過(guò)濾除菌而制備接種培養(yǎng)基。對(duì)于制備1升液體培養(yǎng)基來(lái)說(shuō)，將下列成分組合起來(lái)lOOml黃胞原毛平革菌生長(zhǎng)的基本培養(yǎng)基x10(見(jiàn)下面的配方)10mlCaCl2j^液(13.2g/1)(Sigma-AldrichCorp.,StLouis,MO，USA).終濃度0.132g/L12ml甘油貯液(50g/100-ml)(Frutarom，Israel).終濃度6g/L.加入雙蒸水至1升。按下述方法制備發(fā)酵培養(yǎng)基并用0.45pm濾膜(MSI,Westborough,MA,USA)過(guò)濾除菌。對(duì)于制備10升液體培養(yǎng)基來(lái)說(shuō)，將下列成分組合起來(lái)100mlCaCl2j^液(13.2g/1)(Sigma,USA).終濃度0.0132g/1120ml甘油ti液(50g/100陽(yáng)ml)(Frutarom，Israel)終濃度6g/1.50mlof吐溫-80ji液(10.8ml/100ml)(Sigma,USA).終濃度0.54ml/11000ml黃胞原毛平革菌生長(zhǎng)的基本培養(yǎng)基xlO(見(jiàn)下面的配方)3.36gof藜蘆基醇(Sigma,USA).終濃度2mM7.740升雙蒸水(DDW)，最終體積10升。黃胞原毛平革菌生長(zhǎng)的基本培養(yǎng)基xlO按下述方法制備黃胞原毛平革菌生長(zhǎng)的基本培養(yǎng)基x10:將7.07gr次氮基三乙酸(三鈉鹽)溶于4升DDW。然后加入下列試劑100gr無(wú)水KH2P04，72.7grMgS04■7H20(或67.39grMgS046H20),3.5grNaCl,0.35grFeS047H20,0.63grCoCl26H20，0.35grZnS047H20,0.055grCuS045H20，0.035grA1K(S04)212H20,0.035grH3B03,0.035grNa2Mo042H20,500ml2M乙酸緩沖液pH4.5，10gr酒石酸銨和50mg硫胺。所有試劑都由Sigma-AldrichCorp.,StLouis,MO，USA提供。培養(yǎng)基的pH用NaOH調(diào)節(jié)到4.4-4.45，加入DDW至最終體積5升。于4。C儲(chǔ)存培養(yǎng)基。從黃胞原毛平革菌的細(xì)胞外培養(yǎng)基中分離和純化LIP通過(guò)玻璃纖維真空過(guò)濾細(xì)胞外培養(yǎng)基。然后將濾液通過(guò)0.45jim濾膜(MSI，Westborough,MA，USA)除菌，通過(guò)中空纖維膜采用蠕動(dòng)泵(MASTERFLEX，VernonHills,IL，USA)濃縮液體。濃縮后的細(xì)胞外液體隨后通過(guò)10-kDa-截留值的PM-10型膜(Amicon，Danvers，MA)進(jìn)行超濾，再濃縮25倍，并用MonoQ柱(HR5/5,Pharmacia,Piscataway，NJ)通過(guò)HPLC-陰離子交換層析利用兩梯度0.01-1.00M乙酸鈉進(jìn)行純化。第一個(gè)梯度為pH6.0，第二個(gè)梯度為pH4.7，這與同功酶H1的等電點(diǎn)(pi)值相當(dāng)。收集蛋白峰，利用前一批次的純化LIP同功酶HI作為標(biāo)準(zhǔn)，檢測(cè)蛋白峰的活性。LIPHI級(jí)分的吸收在280nm和409nm處測(cè)定(HewlettPackard,Waldbroim,德國(guó))。純度(RZ)大于4.0，純度是以純化LIP同功酶Hl在409nm的吸收(A柳)和280nm(A28())的吸收的比例計(jì)算的。LIP濃度在409nm通過(guò)169M"cm"的消光系數(shù)確定。LIP活性檢測(cè)通過(guò)Tien和Kirk(1988)描迷的方法，在藜，基醇氧化為藜，醛的過(guò)程中，通過(guò)檢測(cè)310處吸收的變化來(lái)測(cè)定LIP的活性。該檢測(cè)試劑由pH2.5的100mM酒石酸緩沖液中的4mM藜蘆基醇和0.88mMH202組成。用于檢測(cè)的0.5ml黃胞原毛平革菌細(xì)胞外培養(yǎng)基與0.5ml試劑混合，記錄310nm處吸收的增加40sec。一單位的L,IP被定義為每分鐘lfimole藜,基醇被氧化為藜,醛。確定LIP對(duì)黑色素的氧化在pH8.00的50mMTris緩沖液中制備不同濃度的合成黑色素(Sigma,Cat#M8631，StLouisMO，USA)。在含有藜蘆基醇的pH3.5的酒石酸緩沖液中進(jìn)行LIP對(duì)黑色素的氧化，通過(guò)加入過(guò)氧化氫啟動(dòng)酶反應(yīng)。黑色素的氧化程度通過(guò)測(cè)定460nm處吸收的下降而確定。乳膏的制備優(yōu)選實(shí)施方式中的LIP乳膏由兩種乳膏組成酶乳膏和活化劑乳膏。每種乳膏由兩相制備出來(lái)，即水相和油相。酶乳膏酶乳膏的水相0.35%(w/w)DMDM乙內(nèi)酰脲(SharonLab,以色列)；2%(w/w)丙三醇(Cognis，德國(guó))；0.1%(w/w)藜聲基醇(3-二甲氧基節(jié)基醇，Sigma,美國(guó))；81.65%(w/w)DDW(ROWater,以色列)；0.2%(w/w)RhodicareD(黃原膠，Rhodia，法國(guó))；4%(w/w)二甘醇單乙醚(PEG-400，乙氧基二甘醇，Gattefosse,法國(guó));酶乳膏的油相5%輕礦物油；2.5%(w/w)dragorin100SEP(GMS&PEG-100stearate，Dragoco，德國(guó))；3%(w/w)十六烷醇(Cognis,德國(guó))；0.2%(w/w)山梨酸鉀(ChissoCorp.,日本)；1%(w/w)brij721(Uniqema，意大利)。酶乳膏的制備將酶乳膏的水相和油相加熱至80°C，然后混合。將混合物勻化10min并冷卻至55。C。然后用乳酸將pH調(diào)節(jié)到3.5。當(dāng)混合物冷卻到40。C時(shí)，加入木質(zhì)素過(guò)氧化物酶(20-50單位/gr)。將酶混合物勻化lmin?；罨瘎┤楦嗷罨瘎┤楦嗟乃?2.888(w/w)DDW(ROWater,以色列)；0.1%(w/w)EDTA二鈉(Merck,德國(guó))；4%(w/w)二甘醇單乙醚(PEG-400，乙氧基二甘醇，Gattefosse,法國(guó));0.1%(w/w)山梨酸鉀(ChissoCorp.,日本)活化劑乳膏的油相3.5%(w/w)brij72(Steareth-2，Uniqema,意大利)；2.5%(w/w)brij721(Steareth-20，Uniqema，意大利)；5%(w/w)礦物油；1.3%(w/w)十六烷醇(Cognis,德國(guó))；0.5%(w/w)silicon350(Dimethicon，DowComing,美國(guó))；0.1%(w/w)山梨酸鉀(ChissoCorp.,日本)?；罨瘎┤楦嗟闹苽鋵⒒罨瘎┤楣堑乃嗪陀拖嗉訜嶂?0°C并混合。將混合物勻化lOmin并冷卻至45。C，然后用磷酸將pH調(diào)節(jié)到3.5。當(dāng)混合物冷卻到40。C時(shí)，加入過(guò)氧化氬(Riedel-deHaen，德國(guó))(0.012%(w/w))，緩慢攪拌，確認(rèn)pH合適，并將活化劑混合物勻化1min。確定體內(nèi)的皮膚增亮效果為了定量LIP的皮膚增亮效果，利用Minolta色度計(jì)(CR-200Japan)的三個(gè)波長(zhǎng)檢測(cè)被治療的手的皮膚顏色MinoltaL檢測(cè)暗度和亮度，MinoltaA檢測(cè)紅色調(diào)，MinoltaB檢測(cè)黃色調(diào)。MinoltaL值的增加反應(yīng)了皮膚的亮度，也就是說(shuō)，越大的值對(duì)應(yīng)越亮的皮膚。實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)施例1從黃胞原毛平革菌中純化LIP從黃胞原毛平革菌中制備高純度的LIP-為了從黃胞原毛平革菌中純化LIP同功酶H1，將真菌生長(zhǎng)于STR發(fā)酵罐(圖2)中，這在前面的方法部分有詳細(xì)描述。在生長(zhǎng)48小時(shí)后檢測(cè)初始LIP活性，當(dāng)生長(zhǎng)維持到至多120小時(shí)時(shí)，檢測(cè)到顯著的活性增長(zhǎng)(圖3)。為了純化LIP同功酶H1，收集峰值LIP活'j生(120hr)的真菌細(xì)胞外液體。然后純化LIP同功酶HI蛋白質(zhì)，按方法部分所述確定其濃度。這樣，利用上述裝置和條件，可以可靠地生產(chǎn)LIP，其HI同功酶可以通過(guò)HPLC純化。實(shí)施例2利用純化LIP在水相中的黑色素氧化的優(yōu)化為了優(yōu)化LIP氧化黑色素所需的條件，氧化反應(yīng)中每個(gè)重要組分的最佳濃度都獨(dú)立地被確定。水相中LIP對(duì)黑色素的氧化是過(guò)氧化氫濃度的函數(shù)-首先就水相中LIP對(duì)黑色素的氧化與過(guò)氧化氫濃度的關(guān)系進(jìn)行檢測(cè)。在1.5mM藜產(chǎn)基醇和濃度逐漸增加的過(guò)氧化氫的存在下，用O.48jiM純化的LIPHI氧化恒定濃度的黑色素(70.5pg/ml)。通過(guò)檢測(cè)黑色素在加入過(guò)氧化氫之前以及加入后160秒的460nm的吸收來(lái)確定氧化程度，按百分比計(jì)算。一般而言，黑色素的氧化隨著過(guò)氧化氫濃度的增加而增加，直到在700-900pM過(guò)氧化氬處達(dá)到平臺(tái)(圖4)。過(guò)氧化氫濃度對(duì)黑色素氧化的影響通過(guò)與圖5的反應(yīng)混合物進(jìn)行比較而得到進(jìn)一步證實(shí)，其中，反應(yīng)混合物隨著過(guò)氧化氫濃度的增加而顯著增亮。因此，這些結(jié)果證明，水相中LIP對(duì)黑色素的氧化明顯依賴(lài)于過(guò)氧化氫濃度，氧化黑色素的最佳過(guò)氧化氫濃度是600jiM到700nM之間。水相中LIP對(duì)黑色素的氧化是黑色素初始濃度的函數(shù)-為了確定水相中LIP對(duì)黑色素的氧化所需的最佳黑色素濃度，在黑色素濃度逐漸升高的情況下進(jìn)行進(jìn)一步檢測(cè)。在1.5mM藜蘆基醇和600jiM過(guò)氧化氫的存在下，用0.48jiM純化的LIPH1氧化黑色素。黑色素初始濃度在15到45jig/ml時(shí)，LIP對(duì)黑色素的氧化依賴(lài)于黑色素的初始濃度。黑色素初始濃度在45到85fig/ml時(shí)，達(dá)到黑色素的最大氧化(60%)(圖6)。因此，在黑色素的初始濃度超過(guò)45jig/ml時(shí)，LIP對(duì)黑色素的氧化明顯不依賴(lài)于黑色素的初始濃度。水相中LIP對(duì)黑色素的氧化部分依賴(lài)于LIP濃度-為了進(jìn)一步優(yōu)化黑色素氧化的條件，利用最佳的黑色素濃度(70jig/ml)，過(guò)氧化氫(700jiM)和藜,基醇(1.5mM)就LIP濃度對(duì)黑色素氧化的影響進(jìn)行檢測(cè)。當(dāng)LIP濃度由0.25pM增加到0.40jiM時(shí)，黑色素氧化由10%迅速增加到60%。但是，當(dāng)LIP濃度超過(guò)O,5nM時(shí)，沒(méi)有觀察到黑色素氧化的變化(圖7)。因此，體外黑色素氧化的最佳LIP濃度范圍為0.40-0.50pM。實(shí)施例3利用乳膏中的LIP氧化黑色素為了進(jìn)一步證實(shí)LIP同功酶HI氧化黑色素的能力，作為體內(nèi)皮膚增亮的中間步驟，在乳膏配方中檢測(cè)LIP對(duì)溶于水相的黑色素的活性。水相中的黑色素被乳膏中的LIP氧化-制備了兩種類(lèi)型的乳膏酶乳膏包含LIP同功酶H1級(jí)分(25單位/gr乳膏)和藜蘆基醇(6mmole/Kg乳膏)，活化劑乳膏包含過(guò)氧化氫(3.52mmoIe/Kg乳膏)。為了確定乳膏配方中LIP的活性，首先將酶乳骨(0.3gr)與黑色素(140Hg/ml)混合，觀察到了淺灰黑色(圖8a)。當(dāng)活化劑乳膏(0.3gr)加入到已含有黑色素的酶乳膏中時(shí)，顏色迅速變成淺棕色(圖8b)。這些結(jié)果表明乳膏中的LIP在黑色素脫色中非常有效，可進(jìn)一步用于人類(lèi)皮膚測(cè)試。實(shí)施例4乳青中的純化LIPHI的體內(nèi)皮膚和毛發(fā)增亮為了檢測(cè)LIP體內(nèi)增亮皮膚和毛發(fā)的能力，將乳膏和水劑中的酶分別加到皮膚和毛發(fā)上。乳膏中的LIP體內(nèi)增亮了皮膚-為了檢測(cè)乳膏中的LIP體內(nèi)增亮皮膚的能力，將酶乳膏施加到皮膚上并被皮膚吸收，然后以5min的間隔將活化劑乳膏施加四次。當(dāng)每天重復(fù)兩次持續(xù)一周時(shí)，觀察到被處理的皮膚區(qū)域被顯著增亮(圖9)。當(dāng)被處理的手的兩個(gè)區(qū)域的膚色利用Minolta色度儀定量時(shí)，觀察到施加兩周LIP乳骨的清晰的皮膚增亮效果(表1，％變化)。因此，這些結(jié)果證明，以易于施用的乳膏形式制備的LIP可以簡(jiǎn)單有效地體內(nèi)增亮皮膚，并且此處詳述的所制備的LIP可以進(jìn)一步適用于其它體內(nèi)增亮應(yīng)用。表l體內(nèi)皮膚增亮的定量MinoltaL(亮)MinoltaA(紅)Minoltab(黃)區(qū)域i基線(xiàn)44.810.516.34區(qū)域i2周48.810.617.93區(qū)域i%變化8.9----9.7區(qū)域ii基線(xiàn)49.9110.3819.28區(qū)域n2周53.89.3920.63區(qū)域ii%變化7.79----7.0表1給出了從Minolta色度儀得到的關(guān)于被處理的手的兩個(gè)區(qū)域的三組絕對(duì)值讀數(shù)。區(qū)域I對(duì)應(yīng)于圖9中畫(huà)圈的區(qū)域，區(qū)域II對(duì)應(yīng)的數(shù)據(jù)未示出。含水配方中的LIP體內(nèi)增亮毛發(fā)-除了皮膚之外，也經(jīng)常需要對(duì)黑色素富集的組織中的色素沉著進(jìn)行增亮。為了進(jìn)一步檢測(cè)其體內(nèi)增亮效果，將LIP施加到人的毛發(fā)上。在施加LIP之前，首先將毛發(fā)浸在pH11.5的50mM碳酸鹽緩沖液中1小時(shí)，然后轉(zhuǎn)移到另一個(gè)含有LIP(25U/20jil水溶液)的管子中。將毛發(fā)與LIP溫育10秒鐘，然后轉(zhuǎn)移到pH3.5的酒石酸緩沖液中，其中存在藜蘆基醇(1.5mM)和過(guò)氧化氫(8.8mM)。與在同樣的但不含LIP的溶液中處理的毛發(fā)(圖10，左側(cè)管)相比，在LIP存在下，1小時(shí)之內(nèi)觀察到了顯著的增亮效果(圖10,右側(cè)管)。因此，這些結(jié)果證明，在很低濃度的過(guò)氧化氫存在下，含水配方中的LIP可以有效地體內(nèi)增亮毛發(fā)。實(shí)施例5LIP制備工藝的放大為了生產(chǎn)適用于商業(yè)目的的大量木質(zhì)素過(guò)氧化物酶(LIP)，利用放大的方案從黃胞原毛平革菌真菌中純化LIP。通過(guò)放大的發(fā)酵方案獲得的高活性L(fǎng)IP-按照前面的方法部分所述，利用90L發(fā)酵培養(yǎng)基在IOOL發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵。發(fā)酵條件包括160rpm攪拌和0.2vvm空氣流。采用與前面的方法部分所述的10L發(fā)酵罐相同的方式進(jìn)行接種。生長(zhǎng)7天后，測(cè)定的LIP活性為1600單位/升。這些結(jié)果證明，可以利用大發(fā)酵罐和本發(fā)明的放大方案從黃胞原毛平革菌真菌中生產(chǎn)大量高催化活性的LIP。實(shí)施例6LIP乳膏的皮膚病學(xué)測(cè)試低變應(yīng)原的，敏感皮膚，和正常皮膚上的敏化和攻擊(challenging)測(cè)試為了表征LIP乳膏的皮膚病學(xué)性質(zhì)，并作為用作化妝品產(chǎn)品的前提條件，對(duì)LIP乳膏進(jìn)行幾項(xiàng)皮膚病學(xué)測(cè)試低變應(yīng)原測(cè)試，正常皮膚的敏化和攻擊測(cè)試，以及敏感皮膚的敏化和攻擊測(cè)試。方法正常皮膚的皮膚病學(xué)測(cè)試的研究受試者該研究包括50個(gè)志愿者，9個(gè)男性，41個(gè)女性，年齡范圍為18到64歲。這些志愿者的一般健康狀況良好，在有待貼片的區(qū)域沒(méi)有可見(jiàn)的皮膚疾病或畸形。要求每個(gè)研究受試者閱讀、理解并簽署知情同意聲明。排除條件如下孕婦或女性護(hù)士，在治療區(qū)域患有嚴(yán)重疾病或進(jìn)行性疾病和/或病患(pathology)的受試者，采用治療(例如類(lèi)維生素(retinoid)A，類(lèi)固醇)和/或皮膚水合調(diào)節(jié)劑的受試者，體重不穩(wěn)定或過(guò)度使用酒精或煙草的受試者。研究受試者的特征總結(jié)于下面的表2中。表2研究受試者的特征<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>敏感皮膚的皮膚病學(xué)測(cè)試的研究受試者-總共50個(gè)受試者，6個(gè)男性和44個(gè)女性完成了測(cè)試22個(gè)受試者的年齡范圍為18到35歲，11個(gè)受試者的年齡范圍為36到45歲，17個(gè)受試者的年齡范圍為46到65歲。研究中的相關(guān)處理-在應(yīng)用貼片期間，測(cè)試位點(diǎn)上不施用水；不允許改變皮膚的系統(tǒng)性或局部治療；在進(jìn)行評(píng)價(jià)的區(qū)域內(nèi)不允許使用皮膚用藥物或化妝品，包括清潔用品。貼片制備-將2mg的本發(fā)明LIP乳膏置于CuratesFadhesivestrip(Lohmann&RauscherInternationalGmbH&Co.KG，Rengsdort)中，用于低變應(yīng)原測(cè)試。用于皮膚病學(xué)測(cè)試和敏感皮膚測(cè)試的每個(gè)貼片包括CuratesFadhesivestrip中的0.07-0.1克LIP乳膏?；景凑?AppraisaloftheSafetyofChemicalsinFoods,DrugsandCosmetics"byJ.H.Draize(theAssociationofFoodandDrugOfficialsoftheUnitedStates出版)所述進(jìn)4亍DraizeRepeatedInsultpatch測(cè)試。誘導(dǎo)期-將貼片施用到指定的接觸位點(diǎn)，并保持在位置上24小時(shí)。在該階段的末尾，除去貼片，檢查位點(diǎn)上的皮膚反應(yīng)。研究受試者被測(cè)試24小時(shí)，然后再次檢查皮膚位點(diǎn)。然后在前面所采用的相同位點(diǎn)上再次施用貼片。第二次施用與第一次相同，并保持在位置上24小時(shí)。該步驟重復(fù)9次。研究受試者檢查位點(diǎn)上的任何皮膚反應(yīng)，并在下一次施用前報(bào)告他們的觀察結(jié)果。在研究過(guò)程中使用同樣的位點(diǎn)。每次施用由InstituteofSkinResearch(TelAviv，Israel)的人員貼上和除去。質(zhì)量控制人員監(jiān)控對(duì)研究方案的遵守情況。攻擊期-在第9次施用后，有兩周的休息期；此后，在誘導(dǎo)期所采用的同樣位點(diǎn)以同樣的方式施加攻擊應(yīng)用(challengeapplication)。攻擊應(yīng)用在24小時(shí)后除去，檢查位點(diǎn)并就刺激或致敏特征進(jìn)行評(píng)級(jí)。在攻擊應(yīng)用后48小時(shí)(除去貼片后24小時(shí))，以及除去后48小時(shí)和72小時(shí)，進(jìn)行后繼檢查。評(píng)級(jí)尺度-按照下面的尺度對(duì)誘導(dǎo)測(cè)試和攻擊測(cè)試的結(jié)果進(jìn)行評(píng)級(jí)"0"=沒(méi)有可見(jiàn)反應(yīng)；"？"=可疑反應(yīng)，即輕微的、很小的紅斑，沒(méi)有滲透物；"1"=弱的陽(yáng)性反應(yīng)，即紅斑，滲透物，沒(méi)有離散的丘滲；"2"=強(qiáng)的陽(yáng)性反應(yīng)，即紅斑，滲透物，丘瘆，離散的小泡；"3"=額外的陽(yáng)性反應(yīng)，即嚴(yán)重的紅斑，滲透物，聚集的小泡/大泡反應(yīng)；"IR"=刺激反應(yīng)，即離散的紅斑，沒(méi)有滲透物/片狀嚢泡狀紅斑/出血的嚢泡狀膿皰；"NT"=未測(cè)試，皮膚病學(xué)測(cè)試結(jié)果低變應(yīng)原測(cè)試-在該測(cè)試中，在除去貼片之后20分鐘、24小時(shí)和48小時(shí)，記錄對(duì)含有LIP乳膏的貼片應(yīng)用的反應(yīng)。如下面的表3所示，所有50個(gè)研究受試者中均沒(méi)有對(duì)LIP乳骨的可見(jiàn)皮膚反應(yīng)，表3<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>表3:在除去應(yīng)用之后20分鐘、24小時(shí)或48小時(shí)評(píng)級(jí)的低變應(yīng)原測(cè)試結(jié)果用LIP乳膏敏化和攻擊正常皮膚沒(méi)有產(chǎn)生任何皮膚反應(yīng)-將LIP乳膏導(dǎo)入貼片中，針對(duì)50個(gè)健康的志愿者進(jìn)行DraizeRepeatedInsultpatchtest,在每次應(yīng)用貼片后，利用前面的方法部分所描述的評(píng)級(jí)尺度記錄皮膚反應(yīng)。如下面的表4所示，在所有50個(gè)志愿者中，在誘導(dǎo)期的全部9次乳膏應(yīng)用以及在攻擊期的最后一次應(yīng)用之后，均沒(méi)有可見(jiàn)的皮膚反應(yīng)。表4LIP乳膏的誘導(dǎo)測(cè)試和攻擊測(cè)試的結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>表4:誘導(dǎo)期(打分結(jié)果編號(hào)1-9)和攻擊期(打分結(jié)果編號(hào)10)中每次施用貼片之后的評(píng)級(jí)分?jǐn)?shù)。M=男；F-女。敏感皮膚的皮膚病學(xué)測(cè)試-為了進(jìn)一步表征LIP乳膏的致敏性質(zhì)，針對(duì)具有敏感皮膚的50個(gè)健康志愿者進(jìn)行刺激貼片測(cè)試(irritationpatchtest)。在預(yù)測(cè)試中，發(fā)現(xiàn)11個(gè)受試者具有不同程度的刺痛2個(gè)具有嚴(yán)重的敏感皮膚，8個(gè)具有中度敏感皮膚，l個(gè)具有輕度敏感皮膚。將包括LIP乳膏的刺激貼片置于受試者的背上48小時(shí)。在1小時(shí)、24小時(shí)和48小時(shí)之后檢查測(cè)試區(qū)域，發(fā)現(xiàn)在50個(gè)志愿者中均沒(méi)有皮膚反應(yīng)。這些結(jié)果排除了在正常和敏感皮膚中對(duì)LIP乳膏的低變應(yīng)原和刺激反應(yīng)。而且，RepeatedInsultpatch測(cè)試的結(jié)果進(jìn)一步暗示了LIP乳膏作為安全化妝品組合物的用途。實(shí)施例7LIP乳膏在增白皮膚色素沉著方面非常有效。利用雙盲測(cè)試就LIP乳膏在增白皮膚方面的效果與現(xiàn)有技術(shù)中的乳膏進(jìn)行了比較。研究設(shè)計(jì)研究受試者-該研究包括12個(gè)健康的男性和女性，年齡18-65歲，亞裔，沒(méi)有疾病，沒(méi)有皮膚病史或過(guò)敏癥(哮喘、枯草熱、過(guò)敏性鼻炎)病史，對(duì)任何待測(cè)物質(zhì)以及化妝品制品中的任何成分均沒(méi)有已知的敏感性。該研究排除下列候選者正在接受抗炎藥物、抗組胺藥或皮質(zhì)類(lèi)固醇系統(tǒng)或局部治療的候選者，除非該候選者在參加該研究之前，中斷治療2周(對(duì)于系統(tǒng)治療而言)和3天(對(duì)于局部治療而言)。該研究也排除下列候選者處于任何診斷或治療階段的患有癌癥、腎病或肝病的候選者，以及孕婦和哺乳婦女。研究方案-該研究包括兩種類(lèi)型的乳膏，每種乳膏以雙盲的方式施用到一只前臂上包括LIP作為活性成分的本發(fā)明增白乳膏，以及市售產(chǎn)品，2%氳醌(EsomedMedibrands,以色列)。每天兩次施用乳膏(即早上和晚上)。不處理前臂的下面部分。在研究開(kāi)始時(shí)(0周)，以及施用乳膏一周、兩周和三周后，由InstituteofSkinResearch(TelAviv,Israel)的人員檢查研究受試者。在每次檢查中，記錄皮膚色素沉著和副作用。皮膚色素沉著的評(píng)價(jià)-采用DermaSpectrometer(CortexTechnology,Denmark)評(píng)價(jià)皮膚色素沉著，顏色照相采用相同的距離和啄光量，視覺(jué)檢查由Brenner教授(HeadoftheDermatologicalDepartment,SouraskiMedicalCenter,TelAviv，Israel)和她的小組進(jìn)行。研究結(jié)果施用3周后LIP乳膏減少皮膚色素沉著-為了評(píng)價(jià)LIP乳骨在皮膚增白方面的作用，每天兩次將LIP乳膏施用到12名健康志愿者右臂的上面部分。如圖lla-b和圖13a-b所示，這兩幅圖中包括兩位受試者的代表性照片，在乳膏施用三周后，右前臂的上面部分比乳膏施用前白了許多。LIP乳膏比氫醍乳膏在皮膚增白方面更有效-LIP乳膏在減少皮膚色素沉著方面的效果與2%的氫醌進(jìn)行了比較。在乳膏施用21天后，1號(hào)研究受試者LIP處理區(qū)域的色素沉著減少了3,33單位(圖12a藍(lán)色柱和圖12c藍(lán)色曲線(xiàn))。另一方面，同一只前臂未處理區(qū)域的色素沉著減少了1.33單位(圖12a,淺藍(lán)色柱)。另一方面，在用氫醌乳骨處理21天后，處理區(qū)域的色素沉著只減少了l單位(圖12b粉色柱和圖12c粉色曲線(xiàn))。如圖14a-c所示，在其它研究受試者中，觀察到了相似的作用。在總結(jié)來(lái)自全部12個(gè)研究受試者的結(jié)果時(shí)，發(fā)現(xiàn)LIP處理的前臂和氫釅處理的前臂的皮膚色素沉著的平均減少量分別為1.57單位(圖15a，藍(lán)色曲線(xiàn))和1.49(圖15a，粉色曲線(xiàn))單位。而且，在將皮膚色素沉著的減少量標(biāo)準(zhǔn)化到初始皮膚色素沉著時(shí)，LIP處理的前臂和氫醍處理的前臂的皮膚色素沉著的平均減少量分別為4.3%(圖15b，藍(lán)色曲線(xiàn))和3.8%(圖15b,粉色曲線(xiàn))單位。這些結(jié)果結(jié)合在一起證明LIP在減少皮膚色素沉著方面是非常有效的。而且，這些結(jié)果表明，UP乳膏的相對(duì)增白效果高于在使用2%氬釅乳膏時(shí)觀察到的相對(duì)增白效果?？梢岳斫猓瑸榱饲宄鹨?jiàn)，本發(fā)明的某些特征是在分開(kāi)的實(shí)施方式的上下文中進(jìn)行描述的，這些特征也可以在一個(gè)單獨(dú)的實(shí)施方式中組合提供。相反，為了簡(jiǎn)潔起見(jiàn)，本發(fā)明的某些特征是在一個(gè)單獨(dú)的實(shí)施方式中描述的，這些特征也可以分開(kāi)提供或以任何合適的亞組合方式提供。雖然結(jié)合具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了描述，但是很顯然，很多替換、修改和變體對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)將是明顯的。因此，落入后附權(quán)利要求的精神和較寬范圍的所有此類(lèi)替換、修改和變體都被認(rèn)為包括在本發(fā)明中。本說(shuō)明書(shū)中給出的所有出版物、專(zhuān)利、專(zhuān)利申請(qǐng)及通過(guò)識(shí)別號(hào)給出的序列，均以引用的方式將其全部?jī)?nèi)容包括在本說(shuō)明書(shū)中，如同每個(gè)具體的出版物、專(zhuān)利、專(zhuān)利申請(qǐng)及通過(guò)識(shí)別號(hào)給出的序列被專(zhuān)門(mén)地逐個(gè)指明以引用的方式包括在本文中一樣。此外，本申術(shù)。參考文獻(xiàn)1.AlalufS,HeathA，CarterN，AtkinsD,MahalingamH，BarretK,KolbR,SmitN.(2001》VariationinmelanincontentandcompositioninTypeVandVIphotoexposedandphotoprotectedhumanskin:thedominantroleofDHLPigmentCellRes.14:337-347.2.CookseyCJ,GarrattPJ，LandEJ，PavelS，RamsdenCA，RileyPA,SmitNPM(1997).Evidenceoftheindirectformationofthecatecholicintermediatesubstrateresponsiblefortheautoactivationkineticsoftyrosinase.J.Biol.Chem.272:26226-35.3.Farrell,R.L"Murtagh,K.E.,Tien，M.,Mozuch，M.D.,Kirk,T.K.(1989).Physicalan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gè)容器還包含適用于表皮滲透的化妝品可接受的載體。24.根據(jù)權(quán)利要求16的試劑盒，其中所述第一個(gè)和/或第二個(gè)容器還包含適用于毛發(fā)滲透的化妝品可接受的載體。25.根據(jù)權(quán)利要求23的試劑盒，其中所述化妝品可接受的載體包括二甘醇單乙醚和/或丁二醇。26.根據(jù)權(quán)利要求24的試劑盒，其中所述化妝品可接受的載體包括鏈烷醇胺。27.—種加工制品，其包括包裝材料和用于增亮受試者的皮膚區(qū)域或毛發(fā)的化妝品組合物，所述化妝品組合物包含在所迷包裝材料中，所述化妝品組合物包含作為活性成分的重組木質(zhì)素過(guò)氧化物酶以及化妝品可接受的栽體。28.根據(jù)權(quán)利要求27的加工制品，其中所述木質(zhì)素過(guò)氧化物酶是同功酶H1或同功酶H2的#~飾形式。29，根據(jù)權(quán)利要求27的加工制品，其中所述化妝品組合物還包含氧化介導(dǎo)劑。30.根據(jù)權(quán)利要求27的加工制品，其中所述化妝品可接受的栽體包含適用于表皮或毛發(fā)滲透的組合物。31.根據(jù)權(quán)利要求29的加工制品，其中所述氧化介導(dǎo)劑是藜產(chǎn)基醇.32.根據(jù)權(quán)利要求2的用途、權(quán)利要求10的化妝品組合物、權(quán)利要求18的試劑盒，或權(quán)利要求28的加工制品，其中所述同功酶H2的修飾形式是同功酶H2的去磷酸化形式。33.根據(jù)權(quán)利要求1的用途、權(quán)利要求9的化妝品組合物、權(quán)利要求16的試劑盒，或權(quán)利要求27的加工制品，其中所述重組木質(zhì)素過(guò)氧化物酶是在細(xì)菌細(xì)胞中產(chǎn)生的。34.根據(jù)權(quán)利要求1的用途、權(quán)利要求9的化妝品組合物、權(quán)利要求16的試劑盒，或權(quán)利要求27的加工制品，其中所述重組木質(zhì)素過(guò)氧化物酶是在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中產(chǎn)生的。全文摘要本發(fā)明涉及木質(zhì)素過(guò)氧化物酶的生產(chǎn)方法及其在皮膚和毛發(fā)增亮中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了生產(chǎn)木質(zhì)素過(guò)氧化物酶的方法。本發(fā)明還提供了適用于皮膚和毛發(fā)增亮的方法和化妝品組合物以及試劑盒和加工制品，其中包括用于皮膚和毛發(fā)增亮的活性成分。文檔編號(hào)A61Q5/08GK101297789SQ200810108139公開(kāi)日2008年11月5日申請(qǐng)日期2003年12月11日優(yōu)先權(quán)日2002年12月12日發(fā)明者C·多索雷茨,H·拉斯塞,P·貝林基申請(qǐng)人:R.B.T.(洛東生物科技)有限公司