專(zhuān)利名稱(chēng)：作為用于活性成分的載體的亞微粒子的膠體懸浮液及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的領(lǐng)域是載體粒子(PV)的領(lǐng)域，載體粒子用于活性成分(PA)的給藥。后者優(yōu)選是通過(guò)如下方式向動(dòng)物或人體有機(jī)體給藥的藥物或營(yíng)養(yǎng)物口服、鼻、陰道、眼睛、皮下、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮內(nèi)、腹膜內(nèi)、大腦內(nèi)或胃腸外途徑等。然而，這也可以涉及化妝品產(chǎn)品或植物生產(chǎn)產(chǎn)品，如除草劑、滅害劑、殺昆蟲(chóng)劑或殺真菌劑等。在化學(xué)本性方面，本發(fā)明涉及的PA最特別但不限于是例如蛋白質(zhì)、糖蛋白、肽、多糖、脂多糖、低聚核苷酸、多核苷酸和有機(jī)分子。
更精確地，本發(fā)明涉及基于聚氨基酸(PAA)載體粒子、有利地是亞微型載體粒子的膠體懸浮液。本發(fā)明既涉及如此未涂敷的粒子，也涉及由負(fù)載PA的粒子組成的PA載體系統(tǒng)。本發(fā)明也涉及包括這些PV的粉狀固體。本發(fā)明也涉及含有或不含PA的所述粒子膠體懸浮液的制備方法。
現(xiàn)有技術(shù)將PA封囊到PV中的目的特別在于改進(jìn)它們的作用的持續(xù)時(shí)間和/或?qū)⑺鼈冝D(zhuǎn)運(yùn)到治療部位和/或增加該P(yáng)A的生物利用度。已經(jīng)提出過(guò)許多封囊技術(shù)。這種技術(shù)的目的，一方面在于允許將PA轉(zhuǎn)運(yùn)到它的治療作用部位，同時(shí)保護(hù)它免受軀體的侵襲(水解，酶消化等)，并且另一方面在于在它的作用部位控制PA的釋放，以保持可用于身體的量處在所需的水平。在這些變化物的轉(zhuǎn)運(yùn)和存在中涉及的PA是例如蛋白質(zhì)，但也可以是完全不同的合成或天然來(lái)源的有機(jī)分子。
M.J.HUMPHREY的綜述(用于肽藥物的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，由S.DAVIS和L.ILLUM，Plenum Press，N.Y.1986出版)報(bào)導(dǎo)了涉及PA的生物利用度的增強(qiáng)和載體和控制釋放系統(tǒng)益處的問(wèn)題。
在所有可用于形成PV的材料中，由于聚合物的固有性能越來(lái)越多地被使用。就希望獲得的用于PV的詳細(xì)說(shuō)明而言，它們特別需要并特別包括如下要求1用于PV所需的第一個(gè)要求是構(gòu)成PV的聚合物是生物相容的，能夠被消除(通過(guò)排泄)和/或生物可降解的和，更好地，是它代謝成對(duì)身體無(wú)毒的產(chǎn)物。此外，對(duì)于身體內(nèi)的生物降解來(lái)說(shuō)合適的是具有足夠短的持續(xù)時(shí)間。
2對(duì)于PV有利的是能夠形成穩(wěn)定的含水懸浮液，而不借助于有機(jī)溶劑和/或表面活性劑。
3對(duì)于PV也需要具有足夠小的尺寸以能夠在處于液體的懸浮液中承受通過(guò)過(guò)濾器的除菌過(guò)濾，該過(guò)濾器的孔直徑小于或等于0.2μm。
4需要PV和PV-PA系統(tǒng)是通過(guò)對(duì)于PA是非變性的方法獲得的。
5 PV有利地應(yīng)當(dāng)可以控制PA的釋放速率。
6另一個(gè)重要要求是PV-PA系統(tǒng)可構(gòu)成優(yōu)異的可注射藥物。對(duì)于通過(guò)注射給藥-如靜脈內(nèi)或肌內(nèi)注射的這種增強(qiáng)能力-“可注射性”的特征為(i)降低的注射體積(對(duì)于給定的治療劑量)(ii)低粘度。
當(dāng)PA的治療劑量與PA的最小數(shù)量相聯(lián)系時(shí)，可以滿足這兩種性能。換言之，PV應(yīng)當(dāng)具有高的PA負(fù)載因子。
7應(yīng)當(dāng)降低在可注射制劑中特異于PV的成本，在此再一次地，對(duì)于PV來(lái)說(shuō)合適的是具有高的PA負(fù)載因子。在最終分析中，小尺寸和高負(fù)載因子是用于尋找PV的主要要求。
8有利地，對(duì)于構(gòu)成的PV聚合物不誘導(dǎo)免疫響應(yīng)。
以下描述的較早技術(shù)申請(qǐng)?jiān)噲D滿足所有這些要求。通過(guò)示例，可以提及的是較早的申請(qǐng)(a)-(h)(a)專(zhuān)利US-A-5 286 495涉及使用具有相反電荷的材料，即藻酸鹽(帶負(fù)電荷)和聚賴氨酸(帶正電荷)，通過(guò)蛋白質(zhì)在水相中的蒸發(fā)而封囊的技術(shù)。此制造方法使得可以生產(chǎn)尺寸大于35μm的粒子。
(b)此外，乳液技術(shù)通常用于制備負(fù)載PA的微粒子。例如，專(zhuān)利申請(qǐng)WO91/06286，WO91/06287和WO89/08449公開(kāi)了這樣的乳液技術(shù)，其中使用有機(jī)溶劑以溶解聚合物，例如聚乳酸類(lèi)的聚合物。然而發(fā)現(xiàn)特別是對(duì)于肽或多肽PA，溶劑可能是變性的。
(c)已經(jīng)自1970年由X.FOX和K.DOSE描述在“分子進(jìn)化和生命起源”，(Marcel DEKKER Inc編輯(1977))中稱(chēng)作類(lèi)蛋白質(zhì)的生物相容性PV也是已知的。因此，專(zhuān)利申請(qǐng)WO88/01213提出了基于合成多肽的系統(tǒng)，它的溶解性依賴于pH。為了獲得根據(jù)該發(fā)明的基體微粒子，它們?nèi)芙舛嚯牡幕旌衔铮⑷缓箅S著pH的變化，它們引起類(lèi)蛋白質(zhì)粒子的沉淀。當(dāng)沉淀在PA存在的情況下進(jìn)行時(shí)，將后者封囊入粒子中。
(d)作為其余部分，也可以提及專(zhuān)利US4 351 337，它屬于一個(gè)不同于特異于本發(fā)明PA載體化(vectorization)的領(lǐng)域。此專(zhuān)利公開(kāi)了塊狀植入物，它在體內(nèi)相當(dāng)精確的位置連接和定位。這些植入物是中空管或顯微尺寸(160μm并具有等于2000μm的長(zhǎng)度)的膠囊，由共聚(氨基酸)-如聚(谷氨酸-亮氨酸)或聚(谷氨酸芐酯-亮氨酸)-的共聚物組成，它是通過(guò)氨基酸的N-羧基酸酐(NCA)的單體的共聚獲得的。通過(guò)用于聚合物的混合物和PA的混合物的溶劑蒸發(fā)技術(shù)進(jìn)行PA的引入。專(zhuān)利US4 450 150屬于以上研究的專(zhuān)利US4 351 337的同族專(zhuān)利并基本具有相同的目的。組分PAA是聚(谷氨酸-谷氨酸乙酯)。
(e)專(zhuān)利申請(qǐng)PCT/FR WO97/02810公開(kāi)了用于活性成分控制釋放的組合物，其包括至少部分結(jié)晶的(乳酸聚合物)生物可降解聚合物和吸收在所述粒子上的PA的許多層狀粒子。在此情況下，活性成分的釋放通過(guò)解吸進(jìn)行。
(f)出版物“CHEMISTRY LETTERS 1995，707，AKIYOSHI等”涉及通過(guò)與多糖超分子絡(luò)合的胰島素的穩(wěn)定化，所述多糖通過(guò)膽固醇的接枝而疏水化。
(g)出現(xiàn)在“MACROMOLECULES 1997，30，4013-4017”中的文章描述了由如下物質(zhì)組成的共聚物基于L-苯基苯胺、(-芐基-L-谷氨酸酯或O-(四-O-乙酰基-D-吡喃葡萄糖基)-L-絲氨酸的多肽嵌段，以及合成嵌段如聚(2-甲基-2-噁唑啉)或聚(2-苯基-2-噁唑啉)。聚合物在含水介質(zhì)中聚集以形成400nm的粒子，它能夠與酶、脂肪酶結(jié)合。術(shù)語(yǔ)結(jié)合表示蛋白質(zhì)通過(guò)物理現(xiàn)象(無(wú)共價(jià)鍵合)吸附在粒子上。
(h)專(zhuān)利申請(qǐng)F(tuán)R2 746 035，28頁(yè)，3-16行特別描述了復(fù)合凝膠微粒子的膠體懸浮液，它是從聚亮氨酸/谷氨酸鈉類(lèi)型的聚氨基酸，分餾的椰子油(miglyol)和去離子水或緩沖的鹽水溶液(磷酸鹽緩沖劑pH7.4，25℃)獲得的。這些復(fù)合凝膠微粒子的平均參考直徑D[4，3]為2800nm。從FR2 746 035的實(shí)施例來(lái)看，顯然最小的平均參考直徑D[4，3]等于1900nm。
此外，根據(jù)因子Ta≥7％，這些復(fù)合凝膠微粒子不能與膠體懸浮液中未溶解狀態(tài)的胰島素結(jié)合。在這些條件下，顯然復(fù)合凝膠微粒子不能滿足要求，并特別是涉及可注射性和涉及與胰島素相關(guān)的結(jié)合和釋放能力的要求。
此外，根據(jù)FR2 746 035的方法不包括非芳族極性溶劑并且微粒子的形成在含水介質(zhì)中并不自發(fā)進(jìn)行，但其涉及借助于轉(zhuǎn)子/定子型設(shè)備的劇烈勻化的使用。
(i)PCT申請(qǐng)WO96/29991的主題是用于PA載體化的聚氨基酸粒子。這些粒子的尺寸為10-500nm，優(yōu)選30-400nm。在此PCT申請(qǐng)的實(shí)施例中，粒子的尺寸由回轉(zhuǎn)半徑測(cè)量。在這些實(shí)施例中獲得的粒子的回轉(zhuǎn)半徑從55到280nm變化。存在用于測(cè)量膠體粒子尺寸的其它技術(shù)。通過(guò)準(zhǔn)彈性光散射(QELS)測(cè)量粒子的平均流體動(dòng)力學(xué)直徑(Dh)是測(cè)量的常規(guī)方法的例子。在整個(gè)本公開(kāi)內(nèi)容中，用于測(cè)量Dh的Md方法作為參考。后面再描述Md。因此，根據(jù)PCT WO96/29991實(shí)施例的粒子Dh為150nm-750nm。需要注意的是在此討論的PV由被親水性絲狀物圍繞的疏水性核組成。這些對(duì)象的流體動(dòng)力學(xué)直徑比它們的兩倍回轉(zhuǎn)半徑小，例如，如在以下書(shū)籍中解釋的那樣“動(dòng)態(tài)光散射”，B.J.Berue和R.Pecaran(Wiley，1976)和“物理化學(xué)流體動(dòng)力學(xué)”，R.F.Probstein(Wildy1994)。粒子的負(fù)載因子Ta通常表達(dá)為胰島素的質(zhì)量對(duì)干燥PV質(zhì)量的比例。根據(jù)WO96/29991的實(shí)施例，采用由胰島素組成的PA，最多是0.065mg/mg，即相對(duì)于PAA質(zhì)量的6.5wt％的胰島素的干燥重量。根據(jù)以后描述的方法Ma測(cè)量Ta。通過(guò)將PPA與水溶液接觸，而自發(fā)地形成根據(jù)WO96/29991的粒子。PAA包括中性和疏水性氨基酸單體AAO和可離子化和親水性單體AAI。在二噁烷/甲苯的混合物中，通過(guò)處于溶液中的AAI(如Glu-OMe)前體的NCA和AAO(如Leu)的NCA的前體的共聚，而制備這些PAA。通過(guò)在水中的沉淀，過(guò)濾和干燥，回收在溶液中獲得的共聚(Glu-OMe)(Leu)。然后將它引入到三氟乙酸(TFA)中，在其中溶解，對(duì)此共聚物進(jìn)行酸水解。在中和、透析、過(guò)濾和冷凍干燥之后，回收共聚物(Glu-OMe)(Leu)。將此coPAA分散在NaCl的水溶液中并自發(fā)地形成毫微粒子(nanoparticles)的懸浮液。如上所述，后者的Dh尺寸大于150nm，胰島素負(fù)載因子Ta為6.50％。
因此從以上所述可以顯而易見(jiàn)，較早的技術(shù)申請(qǐng)、特別是申請(qǐng)(i)不完全滿足以上所述的新要求，特別是在通過(guò)過(guò)濾除菌的能力、高的降解速率、對(duì)用于通過(guò)注射給藥的限制條件的適應(yīng)性、低成本和高的PA負(fù)載因子方面。
關(guān)于除菌過(guò)濾能力，重要的是在液體中的懸浮液中的PV粒子足夠小以通過(guò)截留值小于或等于0.2μm的過(guò)濾器，而不發(fā)生堵塞。對(duì)于可注射藥物，特別重視這種過(guò)濾除菌的容易程度和效率。
關(guān)于PV的注射能力，對(duì)于給定劑量的PA，合適的是能夠注射小體積的懸浮液，并且懸浮液不是非常粘稠。這種情況要求與目標(biāo)治療劑量的PA相比，能夠降低賦形劑(PV)的量和提供尺寸盡可能小的PV，同時(shí)增加PA的負(fù)載能力。關(guān)于涉及PV生物可降解性的要求，PV的尺寸越小越好，并且其允許它們的快速消除。
此外，由于經(jīng)濟(jì)的原因，較好的是能夠降低賦形劑(PV)的量，以便增強(qiáng)可注射藥物的耐受性。
發(fā)明概述在這些情況下，基本的目的是提供能夠不借助于表面活性劑和有機(jī)溶劑自發(fā)形成穩(wěn)定的PV含水懸浮液的新穎PV。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)質(zhì)性的目的是提供以穩(wěn)定含水膠體懸浮液或以粉狀物形式存在的并基于聚(氨基酸)(PAA)的新穎PV，這些新穎PV必須盡可能滿足上述1-8中的要求。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)質(zhì)性的目的是改進(jìn)在PCT申請(qǐng)WO96/29991中公開(kāi)的粒子。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)質(zhì)性的目的是提供新穎的特性被良好控制的PV懸浮液，特別是在PA負(fù)載因子方面和在PA釋放動(dòng)力學(xué)的控制方面。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)質(zhì)性的目的是提供可注射醫(yī)用懸浮液。對(duì)用于這樣的懸浮液的要求是低的注射體積和低粘度。重要的是每個(gè)注射劑量的膠體粒子的質(zhì)量盡可能低，但不限制通過(guò)這些粒子轉(zhuǎn)運(yùn)的活性成分PA的量，從而不會(huì)損害治療效力。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)質(zhì)性的目的是提供含水膠體懸浮液或粉狀固體，其包括用于攜帶活性成分的粒子，這些粒子滿足以上預(yù)定的要求并且它構(gòu)成適當(dāng)和合適的蓋侖形式，用于對(duì)人體或動(dòng)物的給藥，例如口服給藥。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)質(zhì)性的目的是提供膠體懸浮液，其包括用于攜帶活性成分的粒子，它們可以在0.2μm過(guò)濾器上過(guò)濾，用于除菌目的。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)質(zhì)性的目的是提出PAA粒子(干燥或以在液體中的懸浮液形式存在的)的制備方法，該粒子特別可用作活性成分時(shí)載體，所述方法必須容易使用，對(duì)于活性成分是非變性的，另外總是可以對(duì)獲得的粒子的平均粒度進(jìn)行精細(xì)控制。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)質(zhì)性的目的是以含水懸浮液或以固體形式存在的上述粒子用于制備以下物質(zhì)的用途●藥物(如疫苗)，特別是用于給藥的，尤其是經(jīng)口服、鼻、陰道、眼睛、皮下、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮內(nèi)、腹膜內(nèi)、大腦內(nèi)或胃腸外給藥，特別地，就這些藥物的活性成分而言，其可能是蛋白質(zhì)、糖蛋白、肽、多糖、脂多糖、低聚核苷酸和多核苷酸，●和/或營(yíng)養(yǎng)物，●和/或化妝品或植物保護(hù)產(chǎn)品，●和/或有機(jī)醫(yī)用分子。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)質(zhì)性的目的是提供亞微PV懸浮液，該懸浮液基于PAA并能夠用作PA、特別是醫(yī)用PA的載體，用于所述PA對(duì)人體或動(dòng)物有機(jī)體的給藥，或者用于營(yíng)養(yǎng)、植物保護(hù)或化妝品PA的給藥。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供藥物，如用于活性成分延時(shí)釋放的系統(tǒng)，它可被容易地和經(jīng)濟(jì)性地生產(chǎn)，并且它是生物相容性的并能夠提供非常高的PA生物利用度水平。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)質(zhì)性的目的是提供用于攜帶疫苗的系統(tǒng)，它本身不致免疫并且與一種或多種抗原結(jié)合。
通過(guò)本發(fā)明達(dá)到了涉及產(chǎn)品(特別)的目的，本發(fā)明首先涉及亞微結(jié)構(gòu)粒子的穩(wěn)定膠體懸浮液，該粒子可特別用于攜帶活性成分PA，這些粒子是個(gè)體化(離散)的超分子排列°基于線性的兩親聚氨基酸(PAA)，含有肽鍵和包括至少兩種不同類(lèi)型的重復(fù)氨基酸親水性AAI和疏水性中性AAO，每種類(lèi)型的氨基酸彼此相同或不同，°以及能夠在膠體懸浮液中，以非溶解的狀態(tài)結(jié)合至少一種PA并能夠以延長(zhǎng)和/或延遲的方式釋放它，特別是在體內(nèi)，其特征●在于聚合物鏈的AAI選自含有可離子化側(cè)鏈的氨基酸、特別優(yōu)選是以羧酸形式和/或以鹽的形式的天然氨基酸Glu和Asp，●在于聚合物鏈的AAO選自天然中性氨基酸，優(yōu)選屬于亞組的那些，包括Leu、Ile、Val、Ala、Gly、Phe；●在于在4-13的pH下，在表面活性劑不存在的情況下粒子在水相中是穩(wěn)定的，●以與胰島素結(jié)合的載體粒子的負(fù)載因子Ta為特征，其表達(dá)為以質(zhì)量為基準(zhǔn)的結(jié)合胰島素質(zhì)量的％并根據(jù)方法Ma測(cè)量，Ta為如下所述7≤Ta，優(yōu)選，8≤Ta≤50，并且，更優(yōu)選，10≤Ta≤30，●并且以用納米(nm)表示的并根據(jù)方法Md測(cè)量的平均流體動(dòng)力學(xué)直徑(mean hydrodynamic diameter)Dh為特征，Dh為如下所述10nm≤Dh≤150nm，優(yōu)選，20nm≤Dh≤100nm。
發(fā)明詳述以下詳細(xì)說(shuō)明用于Dh和Ta測(cè)量的方法Md和Ma。
方法Md在pH7.4、25℃和0.01-0.5g/l、優(yōu)選等于0.1g/l的聚合物濃度的條件下，將粉狀PAA粉末懸浮于0.15M的氯化鈉水溶液中。將此懸浮液攪拌4小時(shí)，和然后引入到Brookhaven型的光散射設(shè)備的散射池中，采用波長(zhǎng)為488nm的激光束處理和垂直極化。通過(guò)累積量方法，從電場(chǎng)自相關(guān)函數(shù)計(jì)算流體動(dòng)力學(xué)直徑，如在以下手冊(cè)中描述的那樣“表面活性劑科學(xué)系列叢書(shū)”22卷，表面活性劑溶液，R.Zana編輯，第3章，M.Dekker，1984。
方法Ma(a)胰島素水溶液的制備在5min內(nèi)，在25℃下，將冷凍干燥的人體重組胰島素(SigmaNo.10259)傾入0.1N HCl溶液中。然后將此溶液傾入磷酸鹽緩沖劑溶液中，最后通過(guò)加入0.1N NaOH而中和。然后允許溶液在室溫下靜置30min，并然后在0.8-0.2μ的acrodisc膜上過(guò)濾。根據(jù)所需的溶液體積，計(jì)算胰島素的質(zhì)量，以獲得60IU/ml的濃度。
(b)載體粒子在要在胰島素溶液中結(jié)合的PAA中的分散以10mgPV/ml溶液的量，將冷凍干燥的PV加入到胰島素溶液中。將此混合物在渦流中攪拌兩或三次，然后在室溫下放入搖擺振動(dòng)器中18小時(shí)。然后將膠體懸浮液在4℃下貯存。
(c)游離胰島素從結(jié)合胰島素的分離和游離胰島素的測(cè)定20℃下，在60000g下，在將包含胰島素和PV的溶液離心1小時(shí)。將上層清液放置在備有超濾膜(截留值100000Da)的管子中并在3000g、20℃下離心2小時(shí)。通過(guò)HPLC測(cè)定濾液中的胰島素。
穩(wěn)定的含水膠體懸浮液或粉狀固體形式的新穎載體粒子PV的發(fā)明性基礎(chǔ)之一在于聚合物組和創(chuàng)新方法的創(chuàng)新性選擇，它使得可以獲得亞微尺寸的粒子，該種粒子在表面活性劑或溶劑不存在的情況下可以形成穩(wěn)定的含水膠體懸浮液。
穩(wěn)定的含水膠體懸浮液或粉狀固體狀態(tài)的這些新穎載體粒子PV的另一個(gè)發(fā)明性基礎(chǔ)在于通過(guò)它們的負(fù)載因子Ta≥7％和它們的尺寸Da≤150nm的特定亞微結(jié)構(gòu)粒子組的創(chuàng)新性選擇。這種選擇是對(duì)于生產(chǎn)粒子方法的主要和長(zhǎng)期研究的結(jié)果。事實(shí)上，聚氨基酸粒子的尺寸的降低和負(fù)載能力的增加在現(xiàn)有技術(shù)(priori)中是不明顯的。因此，使用在PCT申請(qǐng)WO96/29991中教導(dǎo)的生產(chǎn)聚氨基酸毫微粒子的方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員不能獲得以及“測(cè)量”相應(yīng)于如上所述新要求的粒子。
最后，通過(guò)改進(jìn)聚合物的組成和操作條件，發(fā)明人能夠分離這些尺寸非常小的結(jié)構(gòu)粒子，這些粒子基于PAA并具有相當(dāng)令人驚奇地和不可預(yù)料的對(duì)于胰島素的負(fù)載能力Ta，該負(fù)載因子是根據(jù)WO96/29991獲得的粒子的該特征的三倍。
有利地，根據(jù)本發(fā)明的懸浮液特征在于，不同于根據(jù)專(zhuān)利申請(qǐng)F(tuán)R2 746035的微粒子的懸浮液，亞微粒子并不從以下三種化合物的存在獲得它們的內(nèi)聚-I)油-II)水相-III)以及至少一種合成非交聯(lián)線性共聚氨基酸，其包括至少兩種不同類(lèi)型的氨基酸共聚單體親水性AAI和疏水性AAO。
選擇PAA聚合物的結(jié)構(gòu)和氨基酸的本性使得●聚合物鏈自發(fā)地結(jié)構(gòu)為小尺寸粒子(PV)的形式，●粒子在水中和在生理介質(zhì)中形成穩(wěn)定的膠體懸浮液，●在含水介質(zhì)中，通過(guò)對(duì)于蛋白質(zhì)是非變性的自發(fā)機(jī)理，PV與蛋白質(zhì)或其它PA結(jié)合，●在生理介質(zhì)中并且更精確地在體內(nèi)，PV釋放PA；釋放的動(dòng)力學(xué)依賴于PAA聚合物的本性，該聚合物是PV的前體。
因此，通過(guò)改進(jìn)PAA的特定結(jié)構(gòu)，從動(dòng)力學(xué)和定量觀點(diǎn)來(lái)看，可以控制結(jié)合和釋放PA的事件。
難能可貴的是申請(qǐng)人已經(jīng)選擇了兩親的并因此在PAA中具有PV性能的聚氨基酸的特定組合作為PV的組成材料，即●自發(fā)地形成PV的膠體懸浮液的可能性，所述膠體懸浮液與在靶向治療應(yīng)用中遇到的生理介質(zhì)的pH相容，
●在沒(méi)有除水以外的另一種試劑存在的情況下，PA與PV的自發(fā)結(jié)合，水用作它們的溶劑，并且在蛋白質(zhì)的情況下，它是非變性的，●在生理?xiàng)l件下，從PA-PV結(jié)合復(fù)合物釋放PA的可能性，具有藥物動(dòng)力學(xué)和藥效特征，從而使得可以想象其在治療領(lǐng)域的有利用途(PA載體化)，此外，它具有如下的新穎性能●具有小于或等于0.2μm的截留值的可過(guò)濾性用于除菌目的，●改進(jìn)的生物可降解性，●優(yōu)化的注射能力。
借助PV的基本技術(shù)功能可以獲得這些新性能，這些新性能是小的納米尺寸和高的負(fù)載因子。
為稍微進(jìn)一步地定義這些PAA，可以指出它們是交替連續(xù)的有序(嵌段)型或是無(wú)規(guī)連續(xù)的無(wú)序型。
因此，根據(jù)本發(fā)明PV的第一個(gè)實(shí)施方案，組分PAA是“嵌段”型并且特征為AAO/(AAI+AAO)摩爾比如下●10％≤AAO/(AAO+AAI)≤70％，●優(yōu)選，20％≤AAO/(AAI+AAO)≤60％●并更優(yōu)選，35％≤AAO/(AAI+AAO)≤50％。
有利地，表達(dá)為AAO的數(shù)目的每個(gè)AAO嵌段的絕對(duì)長(zhǎng)度如下●優(yōu)選，AAO＞10，●并且更優(yōu)選，20≤AAO≤100。
根據(jù)本發(fā)明PV的第二個(gè)實(shí)施方案，組分PAA是“無(wú)規(guī)”型，即通過(guò)AAI和AAO單體的同時(shí)共聚制備的，AAO(AAI+AAO)比例如下●AAO/(AAO+AAI)＞10％●并且，優(yōu)選，AAO/(AAO+AAI)＞20％●并且更優(yōu)選，30％≤AAO/(AAI+AAO)≤70％。
有利地，這些無(wú)規(guī)PAA的摩爾質(zhì)量Mw如下●Mw≥2000g/mol，●優(yōu)選，Mw≥5500g/mol，
●并且更優(yōu)選，5500g/mol≤Mw≤200000g/mol。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選特性，粒子的組分嵌段或無(wú)規(guī)PAA的聚合度DP為30-600，優(yōu)選50-200，更優(yōu)選60-150。
有利地，PV粒子的組分PAA是“二嵌段”P(pán)AA。
本發(fā)明不僅僅涉及如上所述的未涂敷粒子的懸浮液，也涉及包括至少一種活性成分PA的粒子。優(yōu)選，根據(jù)本發(fā)明的懸浮液是含水的和穩(wěn)定的。這些負(fù)載或未負(fù)載PA的粒子有利地是在液體(懸浮液)、優(yōu)選含水液體中的分散形式，但也可以為粉狀固體狀態(tài)，它是從如上所述的PV懸浮液獲得的。
因此，除涉及PV的膠體懸浮液(優(yōu)選含水懸浮)以外，本發(fā)明涉及粉狀固體，該固體包括PV并且是從本發(fā)明的懸浮液獲得的。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)質(zhì)性的主題涉及選擇粒子(如上所述)的制備，粒子或是膠體懸浮液的形式也可以是粉狀固體的形式?？紤]的制備方法實(shí)質(zhì)地在于合成前體PAA并在于將它們轉(zhuǎn)化成結(jié)構(gòu)粒子。
更精確地，其首先包括制備能夠特別用于攜帶活性成分的亞微結(jié)構(gòu)粒子的方法，這些粒子是離散超分子排列的●基于線性的兩親聚氨基酸(PAA)，含有鍵(-AAI親水性和-AAO疏水性，每種類(lèi)型的氨基酸彼此相同或不同)；●具有以nm表示并且根據(jù)方法Md測(cè)量的平均直徑Dh，使得10≤Dh≤150，優(yōu)選，20≤Dh≤100；●一方面通過(guò)在含水介質(zhì)中的簡(jiǎn)單混合能夠形成穩(wěn)定的膠體懸浮液，而不需要向其中加入溶劑或表面活性劑；●另一方面，能夠在液體介質(zhì)中結(jié)合至少一種PA，特別是根據(jù)表達(dá)為％并根據(jù)方法Ma測(cè)量的負(fù)載因子Ta與胰島素結(jié)合，使得7≤Ta，優(yōu)選，8≤Ta≤25，和另一方面，以延長(zhǎng)和控制的方式能夠釋放它，特別是在體內(nèi)。
此方法的特征在于1.在以下物質(zhì)存在的情況下進(jìn)行至少兩種不同類(lèi)型的氨基酸的N-羧基酸酐(NCA)單體的共聚，一方面是NCA-pAAI(“pAAI”表示AAI的前體)，另一方面是NCA-AAO°至少一種非芳族極性溶劑，優(yōu)選選自N-甲基吡咯烷酮(NMP)、二甲基甲酰胺(DMF)、二甲亞砜(DMSO)、二甲基乙酰胺(DMAc)、吡咯烷酮、最特別優(yōu)選是NMP；°和任選地至少一種質(zhì)子共溶劑，質(zhì)子共溶劑優(yōu)選選自吡咯烷酮、水、醇，特別優(yōu)選是甲醇；2.使用水解、優(yōu)選酸水解，將在粒子的前體PAA共聚物的重復(fù)pAAI基元轉(zhuǎn)化成重復(fù)AAI基元，為此將含水酸相加入到上述有機(jī)介質(zhì)中；3.任選地中和反應(yīng)介質(zhì)；4.任選地，將反應(yīng)介質(zhì)經(jīng)過(guò)透析精制以獲得結(jié)構(gòu)粒子的含水懸浮液；5.任選地，濃縮此懸浮液；6.任選地，除去液體介質(zhì)以收集包括粒子的粉狀固體。
方法的第一步驟基于N-羧基-(-氨基酸(NCA)的酸酐聚合的已知技術(shù)，例如在如下文獻(xiàn)中的描述文章“生物聚合物，15，1869(1976)”和H.R.KRICHELDORF的書(shū)籍“氨基酸-N-羧基酸酐和相關(guān)的雜環(huán)”SpringerVerlag(1987)。同時(shí)避免任何沉淀的明智選擇的極性非芳族非質(zhì)子共聚溶劑的使用以及在水和非芳族極性有機(jī)溶劑存在下的酸水解的使用構(gòu)成新穎和發(fā)明性的特征，它們導(dǎo)致具有高PA負(fù)載能力的結(jié)構(gòu)的、離散的亞微粒子，并且在含水介質(zhì)中形成穩(wěn)定的膠體懸浮液。這些粒子一點(diǎn)也不能與相關(guān)于較早申請(qǐng)(d)的上述類(lèi)型的肉眼可見(jiàn)的附聚沉淀物相比。
根據(jù)一個(gè)變化方案，在步驟1結(jié)束時(shí)，將獲得的共聚物聚(AAO)(pAAI)沉淀，優(yōu)選在水中，并回收沉淀物。此變化方案相應(yīng)于制備粒子的間歇模式，其中共聚物聚(AAO)(pAAI)以沉淀物的形式分離，形成穩(wěn)定的中間體產(chǎn)物。例如，也可以過(guò)濾、洗滌和干燥此沉淀物。
更優(yōu)選，NCA-pAAI是O-烷基化的谷氨酸或天冬氨酸的NCA，例如NCA-Glu-O-Me、NCA-Glu-O-Et或NCA-Glu-O-Bz(Me＝甲基-Et＝乙基-Bz＝芐基)。
采用已知的方式，在20-120℃的溫度下、在大氣壓下和在含胺引發(fā)劑如NH3存在的情況下進(jìn)行共聚。在合成期間，可以根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的所需效果調(diào)節(jié)其它實(shí)驗(yàn)參數(shù)，如NCA和/或聚合物在非芳族極性溶劑(優(yōu)選NMP)中的濃度，和/或質(zhì)子溶劑的濃度或本性。使用水和至少一種無(wú)機(jī)酸如磷酸或鹽酸-后者是優(yōu)選的-和/或有機(jī)酸如三氟乙酸(TFA)、乙酸、二氯乙酸或有機(jī)磺酸進(jìn)行酸水解(步驟2)。
在用于水解的酸性含水相中以重量份表達(dá)的水/酸比例有利地是●60/1-2/1，●優(yōu)選40/1-2/1，●并且更優(yōu)選，20/1-2/1。
以重量份表達(dá)的用于水解的酸性含水相/NMP比例有利地是●5/100-200/100，●優(yōu)選10/100-100/100，●并且更優(yōu)選，20/100-80/100。
根據(jù)所需效果調(diào)節(jié)其它實(shí)驗(yàn)參數(shù)，如聚合物濃度、反應(yīng)混合物的溫度、用于水解的酸性含水相的加入模式、降低壓力的使用、反應(yīng)的持續(xù)時(shí)間等，這些參數(shù)對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是公知的。例如，在實(shí)際中使用氫氧化鈉進(jìn)行中和(步驟3)。
然后通過(guò)任何合適的物理分離處理，例如通過(guò)膜過(guò)濾(透析)(步驟4)、過(guò)濾、pH改性、色譜等除去在中和之后形成的鹽以及溶劑。
如此給出結(jié)構(gòu)粒子的含水懸浮液，其可以例如通過(guò)蒸餾或任何其它合適的物理方式超濾、離心進(jìn)行濃縮。
在步驟6中，為從它們的液體懸浮介質(zhì)分離粒子，例如，通過(guò)干燥(如在烘箱中)、通過(guò)冷凍干燥或任何其它合適的物理方式超濾、離心，任選地除去水相。在此步驟6結(jié)束時(shí)回收白色粉狀固體。
根據(jù)一種變化方案，可以通過(guò)化學(xué)處理，如pH的降低進(jìn)行濃縮步驟，它將谷氨酸酯單體的親水性部分轉(zhuǎn)化成酸，使得它們不溶于水。這些酸性PAA中間體可以過(guò)濾、洗滌和干燥。在隨后的步驟中可以采用化學(xué)堿中和該酸性中間體，以獲得粒子的懸浮液。
應(yīng)當(dāng)注意到上述方法中的步驟1，2，3，4和任選地5的使用相應(yīng)于亞微粒子的膠體懸浮液的制備并相應(yīng)于對(duì)PA的高負(fù)載因子。
在此膠體懸浮液的制備過(guò)程中，將步驟2的兩親PAA聚(AAO)(AAI)放入含水介質(zhì)中，其中至少一部分AAI是可溶的和至少一部分AAO是不溶的。在此含水介質(zhì)中，PAA以毫微粒子的形式存在。
用于制備本發(fā)明PV懸浮液的替代方案在于將如上所述和作為產(chǎn)物并通過(guò)它的生產(chǎn)方法得到的粉狀固體與用于AAO的非溶劑含水介質(zhì)接觸。
為進(jìn)行一種或多種PA與粒子的結(jié)合，可以使用本發(fā)明的幾種方法。以下列出這些方法的非限制性例子。
根據(jù)第一種方法，通過(guò)將包含PA的液體相(含水或另外的)與粒子的膠體懸浮液接觸，進(jìn)行PA與粒子的結(jié)合。
根據(jù)第二種方法，通過(guò)將固體狀態(tài)的PA與粒子的膠體懸浮液接觸，進(jìn)行PA與粒子的結(jié)合。固體PA可以為例如冷凍干燥、沉淀物或粉末等形式。
根據(jù)第三種方法，將如上所述作為產(chǎn)物并通過(guò)它的生產(chǎn)特性限定的粉狀固體(PAA)與包含PA的液體相(含水或另外的)接觸。
根據(jù)第四種方法，將如上所述作為產(chǎn)物并通過(guò)它的生產(chǎn)特性限定的粉狀固體(PAA)與固體形式的PA接觸。然后將此固體混合物分散在液體相中，優(yōu)選水溶液。
在所有這些方法中，使用的PA可以是純或?yàn)轭A(yù)配制的形式。
給定粒子的納米尺寸，可以在除菌過(guò)濾器上過(guò)濾懸浮液，它使得可以容易地和在低成本下獲得無(wú)菌可注射醫(yī)用液體。依靠本發(fā)明可以控制粒子的尺寸并達(dá)到25-100nm的Dh值的事實(shí)是主要的優(yōu)點(diǎn)。
本發(fā)明也涉及上述方法的新穎中間體產(chǎn)物，其特征在于它們由PAA共聚物組成，該共聚物是粒子的前體。
工業(yè)應(yīng)用根據(jù)它的另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及如上所定義的和/或如由以上方法獲得的懸浮和/或粉狀固體，此懸浮液和此固體包括至少一種活性成分，活性成分優(yōu)選選自●疫苗，●蛋白質(zhì)和/或肽，其中最優(yōu)選的選自血紅蛋白、細(xì)胞色素、白蛋白、干擾素、抗原、抗體、紅細(xì)胞生成素、胰島素、生長(zhǎng)激素、因子VIII和IX、白細(xì)胞介素或其混合物、血細(xì)胞生成刺激因子，●多糖，更特別優(yōu)選肝素，●核酸并且優(yōu)選RNA和/或DNA低聚核苷酸，●屬于各種抗癌化療類(lèi)的非肽蛋白質(zhì)分子，并特別是蒽環(huán)類(lèi)藥和紫杉類(lèi)(taxoids)，●及其混合物。
本發(fā)明也涉及負(fù)載有營(yíng)養(yǎng)、植物保護(hù)或化妝品PA的懸浮液和/或粉狀固體。
最后，本發(fā)明涉及藥物、營(yíng)養(yǎng)、植物保護(hù)或化妝品專(zhuān)用產(chǎn)品，其特征在于它包括負(fù)載有如上所述PA的懸浮液和/或粉狀固體。
根據(jù)它的另一個(gè)目的，本發(fā)明也涉及負(fù)載有PA的這些PV(以懸浮液或固體形式)用于制備藥物如具有PA的控制釋放系統(tǒng)的藥物的用途。
在藥物的情況下，它們可以是例如優(yōu)選可以通過(guò)如下方式給予的那些口服、鼻、陰道、眼睛、皮下、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮內(nèi)、腹膜內(nèi)、大腦內(nèi)或胃腸外途徑。
可以想象的化妝品用途是例如包含與本發(fā)明PV結(jié)合的PA的組合物并且它可以通過(guò)經(jīng)皮途徑涂敷。
相關(guān)的植物保護(hù)產(chǎn)物可以是例如除草劑、滅害劑、殺昆蟲(chóng)劑、殺真菌劑等。
以下實(shí)施例可以使得在它的各種產(chǎn)物/方法/用途方面更好地理解本發(fā)明。這些實(shí)施例說(shuō)明負(fù)載有或沒(méi)有負(fù)載活性成分的聚氨基酸的粒子的制備，它們同樣呈現(xiàn)這些粒子的結(jié)構(gòu)特性和性能。
附圖簡(jiǎn)述

圖1相應(yīng)于如下嵌段共聚物Ia的毫微粒子根據(jù)專(zhuān)利WO96/29991的教導(dǎo)獲得的亮氨酸50/谷氨酸酯50。
圖2采用本發(fā)明的嵌段共聚物獲得的毫微粒子(實(shí)施例2)。注意到線條(bar)在此僅表示50nm。
圖3在以2IU/kg的數(shù)量注射負(fù)載有胰島素的PV配制劑之后，葡萄糖濃度的變化(4只狗上的％基礎(chǔ)的平均值)。
圖4在以2IU/kg的數(shù)量注射負(fù)載有胰島素的PV配制劑之后，血清胰島素濃度的變化(4只狗上的平均值)。
實(shí)施例實(shí)施例1-從嵌段聚氨基酸，聚(Leu/Glu)40/80二嵌段生產(chǎn)含水穩(wěn)定膠體懸浮液和粉狀固體形式的載體粒子采用攪拌，將112.4g的NCA-GluOMe(0.60mol)和449g的N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)引入到恒溫在20℃的1升反應(yīng)器中。在溶解之后，加入21.38g的氨在1，4-二噁烷中的0.34M溶液(1.25mol％/NCA)。通過(guò)測(cè)量溢出到氣體鐘形容器(gas bell jar)中的二氧化碳監(jiān)測(cè)聚合并通過(guò)NCA在1860和1790cm-1處的振動(dòng)譜帶特征的消失而證實(shí)聚合。在30min之后，引入47.17g的NCA亮氨酸(0.30mol)在631g的NMP中的溶液。反應(yīng)10min之后，溫度增加到60℃。如上所述監(jiān)測(cè)聚合并在2小時(shí)之后聚合完全。獲得的反應(yīng)混合物的溫度增加到80℃。采用機(jī)械攪拌在30min之內(nèi)，將31.5g的濃鹽酸(35％，12M)加入到在步驟1結(jié)束時(shí)獲得的350g反應(yīng)混合物中。將反應(yīng)器放置在調(diào)節(jié)為600mBar的減壓下6小時(shí)。然后在60min之內(nèi)加入31.5g的35％鹽酸和126g水的混合物，隨后進(jìn)行250mBar的第二階段真空18小時(shí)。在此實(shí)施例中，按質(zhì)量計(jì)總體水/純鹽酸的比例為7.6/1，并且按質(zhì)量計(jì)酸性含水相/NMP的比例為60/100。
然后將反應(yīng)混合物冷卻到50℃和然后采用含水氫氧化鈉(35％質(zhì)量)中和。在MWCO為1000道爾頓的膜(Pellicon II系統(tǒng)，Millipore)上，通過(guò)針對(duì)20倍體積的Milli Q水的透析，除去NMP和在中和過(guò)程中形成的氯化鈉。因此獲得載體毫微粒子的穩(wěn)定含水膠體懸浮液。最后將毫微粒子的懸浮液冷凍干燥。
亮氨酸基元的含量由質(zhì)子核磁共振測(cè)定(在2.10，2.22和2.58ppm處的信號(hào)是Glu的4H，在0.85ppm處的信號(hào)是Leu的6H)。平均流體動(dòng)力學(xué)直徑(Dh)是70nm(根據(jù)Md)。
實(shí)施例2-胰島素與聚(Leu/Glu)40/80毫微粒子的結(jié)合使用方法Ma。由HPLC色譜測(cè)定的游離胰島素的濃度，其等于0.59mg/ml并從中推導(dǎo)出結(jié)合的胰島素濃度等于1.51mg/ml。 10mg/ml的膠體溶液的負(fù)載能力達(dá)到1.51mg/ml胰島素。因此，結(jié)合胰島素質(zhì)量對(duì)bLE(Ta)質(zhì)量的比例是15.1％。
實(shí)施例3-從嵌段PAA聚(Leu/Glu)25/70二嵌段生產(chǎn)穩(wěn)定膠體含水懸浮液和粉狀固體形式的載體粒子將146.4g的NCA GluOMe溶于586g的NMP中，向其中加入18.43g的氨在甲醇中的0.48M溶液。當(dāng)NCA GluOMe的聚合完成時(shí)，引入43.9g的NCA Leu在708g的NMP中的溶液，繼續(xù)NCA Leu的聚合直到單體的消失。然后將介質(zhì)加熱到80℃并在30min至1小時(shí)內(nèi)，向其中滴加129.4g的35％HCl。施加600mBar真空6小時(shí)，然后將129.4g的35％HCl以與517.5g水的混合物加入。施加250mBar真空18小時(shí)。在此步驟之后，溫度降低到50℃，引入1升水，隨后引入280ml的35％NaOH以將pH變成7.4。然后將懸浮液過(guò)濾(5μm)，在水中透析(截留值1000Da)以除去溶劑和鹽，最后過(guò)濾(0.22μm)。此懸浮液可以直接使用或可以進(jìn)行進(jìn)一步的處理，如水的蒸餾(步驟5)或冷凍干燥(步驟6)。
平均流體動(dòng)力學(xué)直徑Dh(根據(jù)Md)是35nm。根據(jù)方法Ma測(cè)定的胰島素負(fù)載因子Ta是14.8％。
實(shí)施例4-從嵌段聚氨基酸，聚(Leu/Glu)50/70二嵌段生產(chǎn)穩(wěn)定的含水膠體懸浮液形式的載體毫微粒子以及毫微粒子的表征采用攪拌，將38.9g的NCA-GluOMe(0.208mol)和156g的N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)引入到恒溫在30℃的0.5升反應(yīng)器中。在溶解之后，加入5.79g的氨在甲醇中的0.407M溶液(1.25mol％/NCA)。通過(guò)測(cè)量溢出到氣體鐘形容器中的二氧化碳監(jiān)測(cè)聚合并通過(guò)NCA在1860和1790cm-1處的振動(dòng)譜帶特征的消失而證實(shí)聚合。在30min之后，引入23.3g的NCA亮氨酸(0.148mol)在263g的NMP中的溶液。反應(yīng)10min之后，溫度增加到60℃。如上所述監(jiān)測(cè)聚合并在1-2小時(shí)之后聚合完全。先前獲得的反應(yīng)混合物的溫度增加到80℃。采用機(jī)械攪拌在30min之內(nèi)，將41.9g的含水鹽酸(35％質(zhì)量)加入到反應(yīng)混合物中。然后將反應(yīng)器放置在調(diào)節(jié)為600mBar的減壓下6小時(shí)。然后在60min之內(nèi)加入41.9g的35％鹽酸和167.5g水的混合物，隨后進(jìn)行250mBar的第二階段真空18小時(shí)。然后將反應(yīng)混合物冷卻到50℃并采用含水氫氧化鈉(35％質(zhì)量)中和。在MWCO為1000道爾頓的膜(Pellicon II系統(tǒng)，Millipore)上，通過(guò)針對(duì)20倍體積的Milli Q水的透析除去NMP和在中和過(guò)程中形成的氯化鈉。因此獲得載體毫微粒子的穩(wěn)定含水膠體懸浮液。最后將毫微粒子的懸浮液冷凍干燥。
根據(jù)Md，對(duì)冷凍干燥產(chǎn)物的含水懸浮液測(cè)量平均流體動(dòng)力學(xué)直徑Dh。根據(jù)方法Ma，測(cè)定胰島素負(fù)載因子Ta。
實(shí)施例5-從嵌段聚氨基酸，聚(Leu/Glu)25/35二嵌段生產(chǎn)穩(wěn)定的含水膠體懸浮液形式的載體毫微粒子以及毫微粒子的表征采用攪拌，將38.9g的NCA-GluOMe(0.208mol)和156g的N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)引入到恒溫在30℃的0.5升反應(yīng)器中。在溶解之后，加入5.78g的氨在甲醇中的0.452M溶液(1.25mol％/NCA)。通過(guò)測(cè)量溢出到氣體鐘形容器中的二氧化碳監(jiān)測(cè)聚合和通過(guò)NCA在1860和1790cm-1處的振動(dòng)譜帶特征的消失而證實(shí)聚合。在30min之后，引入23.3g的NCA亮氨酸(0.149mol)在5219g的NMP中的溶液。反應(yīng)10min之后，溫度增加到60℃。如上所述監(jiān)測(cè)聚合和在1-2小時(shí)之后聚合完全。先前獲得的反應(yīng)混合物的溫度增加到80℃。采用機(jī)械攪拌在30min之內(nèi)，將42.0g的含水鹽酸(35％質(zhì)量)加入到反應(yīng)混合物中。然后將反應(yīng)器放置在調(diào)節(jié)為600mBar的減壓下6小時(shí)。然后在60min之內(nèi)加入42.0g的35％鹽酸和167.9g水的混合物，隨后進(jìn)行250mBar的第二階段真空18小時(shí)。然后將反應(yīng)混合物冷卻到50℃并采用含水氫氧化鈉(35％質(zhì)量)中和。在MWCO為1000道爾頓的膜(Pellicon II系統(tǒng)，Millipore)上，通過(guò)針對(duì)20倍體積的Milli Q水的透析除去NMP和在中和過(guò)程中形成的氯化鈉。因此獲得載體毫微粒子的穩(wěn)定含水膠體懸浮液。最后將毫微粒子的懸浮液冷凍干燥。
亮氨酸基元的含量由質(zhì)子核磁共振測(cè)量(在2.10，2.22和2.58ppm處的信號(hào)是Glu的4H，在0.85ppm處的信號(hào)是Leu的6H)。根據(jù)Md，對(duì)冷凍干燥產(chǎn)物的含水懸浮液測(cè)量平均流體動(dòng)力學(xué)直徑Dh。根據(jù)方法Ma，測(cè)定胰島素負(fù)載因子Ta。
實(shí)施例6-從嵌段聚氨基酸，聚(Leu/Glu)50/150二嵌段生產(chǎn)穩(wěn)定膠體懸浮液形式的載體毫微粒子以及毫微相的表征采用攪拌，將46.4g的NCA-GluOMe(0.248mol)和186g的N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)引入到恒溫在30℃的0.5升反應(yīng)器中。在溶解之后，加入6.90g的氨在甲醇中的0.19M溶液(1.25mol％/NCA)。通過(guò)測(cè)量溢出到氣體鐘形容器中的二氧化碳監(jiān)測(cè)聚合并通過(guò)NCA在1860和1790cm-1處的振動(dòng)譜帶特征的消失而證實(shí)聚合。在30min之后，引入12.97g的NCA亮氨酸(0.083mol)在218g的NMP中的溶液。反應(yīng)10min之后，溫度增加到60℃。如上所述監(jiān)測(cè)聚合并在1-2小時(shí)之后聚合完全。先前獲得的反應(yīng)混合物的溫度增加到80℃。采用機(jī)械攪拌在30min之內(nèi)，將40.3g的鹽酸(35％質(zhì)量)加入到反應(yīng)混合物中。然后將反應(yīng)器放置在調(diào)節(jié)為600mBar的減壓下6小時(shí)。然后在60min之內(nèi)加入40.3g的35％鹽酸和161.3g水的混合物，隨后進(jìn)行250mBar的第二階段真空18小時(shí)。然后將反應(yīng)混合物冷卻到50℃并采用含水氫氧化鈉(35％質(zhì)量)中和。在MWCO為1000道爾頓的膜(PelliconII系統(tǒng)，Millipore)上，通過(guò)針對(duì)20倍體積的Milli Q水的透析除去NMP和在中和過(guò)程中形成的氯化鈉。因此獲得載體毫微粒子的穩(wěn)定含水膠體懸浮液。最后將毫微粒子的懸浮液冷凍干燥。
亮氨酸基元的含量由質(zhì)子核磁共振測(cè)量(在2.10，2.22和2.58ppm處的信號(hào)是Glu的4H，在0.85ppm處的信號(hào)是Leu的6H)。根據(jù)Md，測(cè)量平均流體動(dòng)力學(xué)直徑Dh。根據(jù)方法Ma，測(cè)定胰島素負(fù)載因子Ta。
實(shí)施例7-采用PCT專(zhuān)利WO96/29991的教導(dǎo)形成的粒子本性的對(duì)比實(shí)施例通過(guò)專(zhuān)利WO96/29991的教導(dǎo)獲得的粒子是在圖1中出現(xiàn)的那些，有利地，根據(jù)本發(fā)明的粒子是在附圖2中出現(xiàn)的相應(yīng)于在透射電鏡下拍攝的照片的那些。
比較代表根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)的PV的圖1和顯示根據(jù)本發(fā)明的PV的圖2，明顯顯示形態(tài)和尺寸的差異。在此觀察到形態(tài)上的顯著差異。圖2的PV為這樣的情況，其中的大部分較大尺寸的粒子呈現(xiàn)橢圓形狀。
實(shí)施例8-采用聚合物聚(Leu/Glu)40/80，根據(jù)實(shí)施例2制備的膠體懸浮液的穩(wěn)定性測(cè)試將實(shí)施例2的粉狀粉末以60mg/ml粉末的量溶于磷酸鹽緩沖劑中。將pH調(diào)節(jié)到7.3并使用5M NaCl溶液將懸浮液的重量克分子滲透濃度調(diào)節(jié)到300mOsm/kg。在以5ml的量分裝到無(wú)菌10ml瓶中之前，將溶液過(guò)濾(0.22μm)。在4個(gè)月的時(shí)間內(nèi)評(píng)價(jià)樣品的穩(wěn)定性。將一半樣品保持在4℃(±2℃)下而將其它樣品保持在實(shí)驗(yàn)室溫度25℃(±5℃)下。在給定的時(shí)間，從貯存地點(diǎn)收取樣品并在分析之前將樣品在室溫下平衡1小時(shí)。分析方法是詳細(xì)的，結(jié)果以兩個(gè)表格的形式呈現(xiàn)。
1)膠體溶液同質(zhì)的證實(shí)不攪拌懸浮液，收集100μl樣品三次以代表瓶子的頂部、中間和底部溶液的狀態(tài)。在25℃下，在相對(duì)于純水標(biāo)定的Abbe折射儀上測(cè)量每個(gè)樣品的折射指數(shù)。對(duì)于每個(gè)樣品給出三個(gè)讀數(shù)并比較三個(gè)平均值。溶液濃度的任何變化導(dǎo)致折射指數(shù)的差異。
2)流體動(dòng)力學(xué)直徑的測(cè)量采用0.15M NaCl溶液將要分析的100μl樣品溶液稀釋120倍，并根據(jù)方案Md測(cè)量膠體粒子的Dh。
3)粘度的測(cè)量在0.75ml樣品上，使用裝配有錐形/平面幾何形狀物(錐形4cm/2℃)的AR1000流變儀(TA instruments)，在20.0℃+/-0.1℃(通過(guò)Pelletier作用調(diào)節(jié))的溫度下進(jìn)行測(cè)量。從1-100s-1的梯度，記錄作為剪切梯度函數(shù)的粘度曲線。在這些濃度下，將溶液輕微流變流體化，并且選擇的粘度值是對(duì)于10s-1的梯度取得的。
在4℃和25℃老化之后獲得的結(jié)果見(jiàn)表I和II。
表I-在4℃下老化

表II-在25℃下老化

實(shí)施例9-在給予包含胰島素的粒子懸浮液之后動(dòng)物體內(nèi)胰島素的釋放測(cè)試從PV(實(shí)施例3的)和胰島素配制制劑，根據(jù)結(jié)合比率的測(cè)量值確定每種物質(zhì)的數(shù)量(Ma)。將重10-12kg的一組4只小獵犬(雄性和雌性)禁食18小時(shí)。配制制劑，制劑由80IU的胰島素及在1ml的PBS緩沖劑中的56mg PV組成。然后在2IU/kg重量的比率下經(jīng)皮下給予狗此胰島素制劑。在注射之前(-2h，-1h和0h)和之后(1h，2h，4h，6h，12h，16h，20h，24h，28h，32h，36h，40h，44h，48h)收集用于葡萄糖和胰島素測(cè)定的血樣。通過(guò)葡萄糖氧化酶方法測(cè)定樣品中葡萄糖濃度并使用放射免疫方法測(cè)定血清胰島素。圖3給出此制劑葡萄糖變化的平均值。圖4給出此制劑血清胰島素變化的平均值。
通過(guò)生物活性，此實(shí)施例顯示蛋白質(zhì)的非變性以及延長(zhǎng)釋放＞24h的可能性這兩個(gè)本發(fā)明的有利方面。
權(quán)利要求
1.一種亞微粒子的膠體懸浮液，該粒子特別可用于攜帶活性成分(PA(s))，這些粒子是個(gè)體化的超分子排列●基于線性的兩親聚氨基酸(PAA)，含有肽鍵和包括至少兩種不同類(lèi)型的重復(fù)氨基酸親水性AAI和疏水性中性AAO，每種類(lèi)型的氨基酸彼此相同或不同，●以及能夠在膠體懸浮液中，以非溶解的狀態(tài)結(jié)合至少一種PA并能夠以延長(zhǎng)和/或延遲的方式釋放它，特別是在體內(nèi)，其特征°在于AAI選自含有可離子化側(cè)鏈的氨基酸、特別優(yōu)選是羧酸形式和/或鹽的形式的天然氨基酸Glu和Asp，°在于或是AAO選自天然中性氨基酸，優(yōu)選屬于亞組的那些，包括Leu、Ile、Val、Ala、Gly、Phe；°在于在4-13的pH下，其在不存在表面活性劑的情況下是穩(wěn)定的，°以與胰島素結(jié)合的負(fù)載因子Ta為特征，其表達(dá)為以質(zhì)量為基準(zhǔn)的結(jié)合胰島素質(zhì)量的％并根據(jù)方法Ma測(cè)量，Ta為如下所述Δ7≤Ta，Δ優(yōu)選，8≤Ta≤50，Δ并且，仍然更優(yōu)選，10≤Ta≤30，°并且以用nm表示的并根據(jù)方法Md測(cè)量的平均流體動(dòng)力學(xué)直徑Dh為特征，Dh為如下所述Δ10nm≤Dh≤150nm，Δ優(yōu)選，20nm≤Dh≤100nm。
2.權(quán)利要求1的懸浮液，其特征在于亞微粒子并不從以下三種化合物的存在獲得它們的內(nèi)聚-I)油-II)水相-III)以及至少一種合成非交聯(lián)線性共聚氨基酸，其包括至少兩種不同類(lèi)型的氨基酸共聚單體親水性AAI和疏水性AAO。
3.權(quán)利要求1或2的懸浮液，其特征在于粒子的組分PAA是“嵌段”P(pán)AA，為此表達(dá)為％的AAO(AAI+AAO)摩爾比為如下所述Δ10％≤AAO/(AAI+AAO)≤70％，Δ優(yōu)選，20％≤AAO/(AAI+AAO)≤60％，并且為此鏈聚合度DP為30-600，優(yōu)選50-100，并更優(yōu)選60-150。
4.權(quán)利要求1-3任意一項(xiàng)的懸浮液，其特征在于粒子的組分PAA是“二嵌段”P(pán)AA。
5.權(quán)利要求1-4任意一項(xiàng)的懸浮液，其特征在于它是含水的和穩(wěn)定的。
6.權(quán)利要求1-5任意一項(xiàng)的懸浮液，其特征在于粒子包括至少一種活性成分PA。
7.一種粉狀固體，其特征在于它是從權(quán)利要求1-6任意一項(xiàng)的懸浮液獲得的。
8.一種制備權(quán)利要求7的粉狀固體的方法，其特征在于1)在以下物質(zhì)存在的情況下，進(jìn)行單體的共聚，單體由至少兩種不同類(lèi)型的氨基酸的N-羧基的酸酐(NCA)組成，一方面是NCA-pAAI(“pAAI”表示AAI的前體)并且另一方面是NCA-AAO-至少一種非芳族極性溶劑，優(yōu)選選自N-甲基吡咯烷酮(NMP)、二甲基甲酰胺(DMF)、二甲亞砜(DMSO)、二甲基乙酰胺(DMAc)、吡咯烷酮、最特別優(yōu)選的是NMP；-以及任選地至少一種共溶劑，共溶劑選自非質(zhì)子溶劑(優(yōu)選1，4-二噁烷)和/或質(zhì)子溶劑(優(yōu)選吡咯烷酮)和/或水和/或醇，特別優(yōu)選是甲醇；2)使用水解，優(yōu)選酸水解，將在步驟1中獲得的共聚物的重復(fù)pAAI基元轉(zhuǎn)化成重復(fù)AAI基元，為此將在步驟1中獲得的共聚物與用于酸水解的水相+水接觸；3)將反應(yīng)介質(zhì)中和；4)任選地，將反應(yīng)介質(zhì)透析以精制結(jié)構(gòu)粒子的含水懸浮液；5)任選地，濃縮步驟4的懸浮液；6)除去液體介質(zhì)以收集包括粒子的粉狀固體。
9.權(quán)利要求8的方法，其特征在于，在步驟1結(jié)束時(shí)，將獲得的共聚物聚(AAO)(pAAI)沉淀，優(yōu)選在水中，并回收沉淀物。
10.一種制備權(quán)利要求1-6任意一項(xiàng)的懸浮液的方法，其特征在于將權(quán)利要求7的粉狀固體和/或由權(quán)利要求8的方法獲得的粉狀固體與用于AAO的非溶劑含水介質(zhì)接觸。
11.一種制備權(quán)利要求1-6任意一項(xiàng)的懸浮液的方法，其特征在于它包括權(quán)利要求8的方法中的步驟1，2，3，4和任選地5。
12.一種制備權(quán)利要求6的懸浮液的方法，其特征在于通過(guò)將包含PA的液體相與粒子的膠體懸浮液接觸從而進(jìn)行PA與粒子的結(jié)合。
13.一種制備權(quán)利要求6的懸浮液的方法，其特征在于通過(guò)將固體狀態(tài)的PA與粒子的膠體懸浮液接觸從而進(jìn)行PA與粒子的結(jié)合。
14.一種制備權(quán)利要求6的懸浮液的方法，其特征在于將權(quán)利要求7的粉狀固體和/或由權(quán)利要求8的方法獲得的粉狀固體與包含PA的液體相接觸。
15.一種制備權(quán)利要求6的懸浮液的方法，其特征在于將權(quán)利要求7的粉狀固體和/或由權(quán)利要求8的方法獲得的粉狀固體與固體形式的PA接觸，并在于將此固體混合物分散在液體相中，優(yōu)選水溶液中。
16.一種權(quán)利要求8或9的方法的中間體產(chǎn)物，其特征在于它由PAA共聚物組成，該共聚物是粒子的前體。
17.權(quán)利要求6的和/或由權(quán)利要求12-15任意一項(xiàng)的方法獲得的懸浮液和/或權(quán)利要求7的粉狀固體，包括至少一種活性成分，活性成分優(yōu)選選自°疫苗，°蛋白質(zhì)和/或肽，其中最優(yōu)選的選自血紅蛋白、細(xì)胞色素、白蛋白、干擾素、抗原、抗體、紅細(xì)胞生成素、胰島素、生長(zhǎng)激素、因子VIII和IX、白細(xì)胞介素或其混合物、血細(xì)胞生成刺激因子，°多糖，更特別優(yōu)選肝素，°核酸，并優(yōu)選RNA和/或DNA低聚核苷酸，°屬于各種抗癌化療類(lèi)的非肽蛋白質(zhì)分子并且特別是蒽環(huán)類(lèi)藥和紫杉類(lèi)，°及其混合物。
18.權(quán)利要求6的懸浮液和/或由權(quán)利要求12-15任意一項(xiàng)的方法獲得的懸浮液和/或權(quán)利要求7的粉狀固體，其包括至少一種營(yíng)養(yǎng)的植物保護(hù)或化妝品活性成分。
19.藥物、營(yíng)養(yǎng)、植物保護(hù)或化妝品專(zhuān)用產(chǎn)品，其特征在于它包括權(quán)利要求17或18的懸浮液和/或粉狀固體。
全文摘要
本發(fā)明涉及作為活性成分(PA)載體(PV)的粒子的懸浮液。所述的載體粒子(PV)是以聚氨基酸(PAA)為基礎(chǔ)的。它們具有的平均流體動(dòng)力學(xué)直徑(Dh)為30－120nm，并且具有相對(duì)于形成載體成分的聚氨基酸的有關(guān)的胰島素?cái)?shù)量為5－25％的胰島素負(fù)載因子(Ta)。聚氨基酸為含有親水性(AAI)和疏水性(AAO)單體的二嵌段聚合物。本發(fā)明還涉及可以衍生載體粒子的粉末狀物質(zhì)以及所述的固體粉末物質(zhì)和所述的載體粒子的懸浮液的制備。所述的制備由以下步驟組成使疏水性單體的N－羧基酸酐與親水性單體的前體在N－甲基吡咯烷酮和甲醇的存在下進(jìn)行共聚。然后通過(guò)酸水解將親水性單體的前體轉(zhuǎn)化為親水性單體。任選地，中和共聚體、透析、濃縮并去除水。由此得到固體粉末物質(zhì)或懸浮的載體粒子?；钚猿煞?例如胰島素或疫苗)與所述的用于制備特定的藥物產(chǎn)品的載體粒子有關(guān)。
文檔編號(hào)A61Q19/00GK1399541SQ0081610
公開(kāi)日2003年2月26日 申請(qǐng)日期2000年10月11日 優(yōu)先權(quán)日1999年11月23日
發(fā)明者F·圖勞德, N·布萊森 申請(qǐng)人:弗拉梅技術(shù)公司