一種殼聚糖藻酸鹽敷料及其浸漬制備方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種殼聚糖藻酸鹽敷料，通過將殼聚糖混合物溶于弱酸溶液中，制得殼聚糖混合液，然后將商品化的藻酸鹽敷料浸潤在殼聚糖混合液中制得殼聚糖藻酸鹽敷料。本發(fā)明結(jié)合了殼聚糖和傳統(tǒng)藻酸鹽敷料的優(yōu)勢，在加強藻酸鹽敷料原有的止血、吸濕保濕性能的同時，又具有抗菌性和促創(chuàng)面愈合等性能。產(chǎn)品對人體無明顯毒性，原料豐富，制作成本低，可廣泛應(yīng)用于創(chuàng)面處理。
【專利說明】
一種殼聚糖藻酸鹽敷料及其浸漬制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)用敷料領(lǐng)域，具體涉及一種殼聚糖藻酸鹽敷料及其浸漬制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 20世紀(jì)60年代初，英國科學(xué)家Winter(Winter G D.Formation of the scab and the rate of epithelization of superficial wounds in the skin of the young domestic pig. [J] .Rev.ci§nc.agron, 1995,4(8):293-4)通過動物傷口對比試驗提出了濕 潤性傷口愈合理論，即傷口在濕潤環(huán)境下愈合效果比在開放式的干燥環(huán)境下要好。這個理 論的產(chǎn)生帶動了一批濕性敷料的研發(fā)、生產(chǎn)和應(yīng)用，其中包括藻酸鹽類敷料(趙琳，宋建星. 創(chuàng)面敷料的研究現(xiàn)狀與進展[J].中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2007,11(9): 1724-6)。
[0003] 藻酸鹽類敷料的原料是從褐色的海藻中提取的一種類似纖維素的藻蛋白酸，是一 種難溶性多糖。海藻酸纖維可由濕法紡絲制備，將海藻酸鈉堿性濃溶液經(jīng)過噴絲板擠出后 送入含鈣離子的酸性凝固浴中，海藻酸鈉與鈣離子發(fā)生離子交換，即形成不溶于水的海藻 酸鹽纖維。纖維經(jīng)無紡技術(shù)制成藻酸鹽類敷料，該敷料易折疊和敷貼，同時也是一個理想的 填充體。本品覆蓋創(chuàng)面后與創(chuàng)面滲液接觸，通過離子交換將不溶性藻酸鹽變?yōu)榭扇苄栽逅?鈉，同時釋放鈣離子，故具有止血功能(王清華，鐘文菲，何盟.藻酸鹽敷料的臨床應(yīng)用:與傳 統(tǒng)材料特征的比較[J].中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2010,14(3) :533-6)，可用于術(shù)后創(chuàng) 口填塞，起到良好的止血引流作用。此外，藻酸鹽類敷料吸收性能好，可吸收自身質(zhì)量20倍 的滲液量(為紗布的5-7倍）（林曉華，黃宗海，俞金龍.海藻酸纖維的研究發(fā)展及生物醫(yī)學(xué)應(yīng) 用[J].中國組織工程研究，2013( 12) :2218-24)。吸收液體后，該敷料膨脹成藻酸鈉凝膠，在 創(chuàng)面上形成柔軟、潮濕、類似凝膠的半固體物質(zhì)（葉溱，陳炯.藻酸鹽敷料在燒傷供皮區(qū)創(chuàng)面 的應(yīng)用[J].浙江醫(yī)學(xué)，2001，23(4) :248-9)，使傷口同外界隔絕，這能形成一個密閉的無大 氣氧環(huán)境，加速新生微血管增生，對維持濕潤環(huán)境、提高表皮細(xì)胞的再生能力、加快表皮細(xì) 胞移動、促進創(chuàng)面愈合有重要意義（Lee K Y，Mooney D J.Alginate:Properties and biomedical applications[J].Progress in Polymer Science，2012，37(I):106-26)〇由 于傷口處凝膠形成，這使得在去除敷料時不會與傷口發(fā)生粘連，防止摘除敷料過程中對傷 口造成二次創(chuàng)傷。
[0004] 20世紀(jì)90年代初，英國研制出了首個海藻酸鹽纖維傷口敷料（Sorbsan) (Gilchrist T1Martin A M.Wound treatment with Sorbsan-An Alginate fibre dressing!!J] .Biomaterials，1983,4(4) :317-20)。之后以海藻酸鹽纖維為基本原料的敷料 不斷進入市場。目前市場上主要的海藻酸鹽纖維敷料品牌有Sorbsan ,Kahostat， Me IgisorbPlus ,Algi SiteM和Seasorb等。但單純海藻酸鹽敷料促進傷口愈合能力有限（顧 其勝，王帥帥，王慶生，等.海藻酸鹽敷料應(yīng)用現(xiàn)狀與研究進展[J].中國修復(fù)重建外科雜志， 2014(2) :255-8)。商品化的功能型海藻酸鹽敷料產(chǎn)品還比較單一，除了含銀海藻酸敷料外， 目前沒有看到其他有突破性的產(chǎn)品上市。而含銀海藻酸敷料作為抗菌傷口敷料，為了實現(xiàn) 有效抗菌的目的，一般含銀量都比較高。目前，市場上主要的含銀敷料包括含銀量9mg/ IOOcm的離子型敷料和104rag/100cm的金屬型敷料兩種。其含銀量換算成占海藻酸鹽纖維 質(zhì)量比例為1 %~7 %。此類敷料均存在一定的細(xì)胞毒性(Rattanaruengsrikul V,Pimpha N,Supaphol P.Development of Gelatin Hydrogel Pads as Antibacterial Wound Dressings[J] .Macromolecular Bioscience,2009,9(10): 1004-15)，且銀成分除了抗菌之 外，無其他明顯促進創(chuàng)面愈合的功能。兼具功能性和抗菌性的藻酸鹽敷料正在成為目前研 究的熱點。
[0005] 殼聚糖具有良好的生物相容性、生物可降解性以及抗菌消炎、止血促愈等生理功 能，是優(yōu)異的醫(yī)用敷料及組織工程材料。但是，并非單一殼聚糖都具有以上作用，而是不同 分子量的殼聚糖有不同的藥理作用，如高分子量的殼聚糖有抗金黃色葡萄球菌的作用，低 分子量的殼聚糖有抗大腸桿菌和保濕的作用(楊虎，鄭麗君，黃新建，等.殼聚糖護膚液促進 大鼠傷口愈合的研究[J].中華皮膚科雜志，2011，44(12): 891 -3)。本研究小組將不同分子 量的殼聚糖混合后，加以其他輔料，制成殼聚糖混合液，以充分發(fā)揮殼聚糖的性能，已獲得 國家發(fā)明專利（專利號:ZL 2011100512896,授權(quán)公告日：2012.11.28)(談偉強，楊虎.殼聚 糖護膚液及其制備方法.專利號：ZL 2011100512896，中華人民共和國國家知識產(chǎn)權(quán)局，國 家發(fā)明專利，授權(quán)公告日：2012.11.28)。該混合液性質(zhì)穩(wěn)定，成膜性好，同時具有良好的抗 菌、保濕(張利云，丁仕力，陳璋，等.殼聚糖護膚液保濕和抗菌作用的研究[J].材料導(dǎo)報， 2013，27(2): 52-6)、抗衰老和促進傷口愈合的作用(楊虎，鄭麗君，黃新建，等.殼聚糖護膚 液促進大鼠傷口愈合的研究[J ].中華皮膚科雜志，2011，44 (12): 891 -3)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種殼聚糖藻酸鹽敷料，通過以下方法制備:將一定量的殼 聚糖混合物溶于弱酸溶液中，制得殼聚糖混合液;然后將商品化藻酸鹽敷料浸漬在殼聚糖 混合液中一定時間，制成新型殼聚糖藻酸鹽敷料(浸漬法）。
[0007] 具體制備步驟如下：
[0008] (1)制備殼聚糖混合液:取一定量的酸溶液，加入一定量的殼聚糖混合物，均勻混 合，制得質(zhì)量濃度為10-20%的殼聚糖混合液。所用酸為醋酸、檸檬酸或山梨酸中的一種，酸 溶液的質(zhì)量濃度為1%。所用的殼聚糖混合物由高分子量和低分子量殼聚糖均勻混合，重量 比范圍為1:1;極端情況也可單獨應(yīng)用高分子量或低分子量殼聚糖。
[0009] 殼聚糖混合物由高分子量殼聚糖和低分子量殼聚糖組成，分子量大于10萬道爾頓 的為高分子量殼聚糖，低于10萬道爾頓的為低分子量殼聚糖。
[0010] (2)制備殼聚糖藻酸鹽敷料:將商品化藻酸鹽敷料浸入殼聚糖混合液一定時間（15 分鐘-2小時），取出后干燥處理(冷凍凍干機干燥3-12小時或干燥箱烘干30分鐘-1小時）。
[0011] (3)消毒處理:采用紫外光照30分鐘。
[0012] 本發(fā)明結(jié)合殼聚糖和傳統(tǒng)藻酸鹽敷料的優(yōu)勢，制備出具有抗菌、保濕、止血和促進 創(chuàng)面愈合功能的新型殼聚糖藻酸鹽敷料，是一種新型醫(yī)用敷料。具有以下優(yōu)點：（一)無明顯 細(xì)胞毒性:大量研究證實，殼聚糖是由葡萄糖胺以苷鍵連接成的多糖，可被傷口處中性粒細(xì) 胞分泌的溶菌酶、殼多糖酶等降解為低聚糖、氨基葡萄糖和N-乙酰氨基葡萄糖，從而被機體 組織和器官吸收，無細(xì)胞毒性，不溶血，不致敏，生物相容性良好，可以滿足醫(yī)藥衛(wèi)生及化妝 品原料的基本要求。1998年，Suzuki等利用成纖維細(xì)胞(L929)進行海藻酸的體外細(xì)胞毒性 實驗，發(fā)現(xiàn)海藻酸對成纖維細(xì)胞的增殖無明顯影響，具有良好的細(xì)胞相容性。（二)抗菌性： (1)所用殼聚糖混合物由高分子量和低分子量殼聚糖均勻混合，可以從不同機制上對細(xì)菌 起到抑制作用；（2)藻酸鹽遇到含有鈉離子的滲出液后，鈉離子-鈣離子發(fā)生交換，形成藻酸 鈉凝膠，起到殼聚糖緩釋效果；（3)殼聚糖的抗菌性隨脫乙酰度的升高而增強，本實驗所用 殼聚糖脫乙酰度達到90-95%，增加了殼聚糖的抗菌性能；（4)殼聚糖抗菌活性隨著殼聚糖 濃度的增加而加強，本敷料采用15 %的殼聚糖混合液制作，殼聚糖濃度較高；（5)殼聚糖的 抗菌性與PH值成反比關(guān)系，本實驗采用1 %弱酸溶液溶解殼聚糖，提供了低PH值的酸性環(huán) 境。（三)吸濕保濕性:殼聚糖被降解后，殼聚糖分子中的氫鍵作用被削弱，晶體結(jié)構(gòu)受到破 壞，分子呈松散狀態(tài)，有利于水分子的接近進而與其分子中的親水基團如羥基和氨基形成 氫鍵，大大提高了吸濕和保濕性能，特別是低聚殼聚糖(分子量IOkD以下）具有優(yōu)于甘油和 透明質(zhì)酸的吸濕保濕功能，且在一定的分子量范圍內(nèi)，隨著分子量的降低，保濕增濕性能逐 漸增強。當(dāng)海藻酸鹽敷料與含鈉離子的傷口滲出液接觸時，藻酸鹽纖維通過離子交換被轉(zhuǎn) 換成藻酸鈉纖維而形成纖維狀的膠體，后者可吸收相當(dāng)于自身重量20倍的滲液量(為紗布 的5-7倍）。且藻酸鈉纖維吸收液體后膨脹成藻酸鈉凝膠，在創(chuàng)面上形成柔軟、潮濕、類似凝 膠的半固體物質(zhì)，在傷口表面形成濕潤、適合傷口愈合的環(huán)境。（四）止血性:海藻酸鹽敷料 與血液接觸時，會和Na+發(fā)生離子置換產(chǎn)生部分海藻酸鈉。此反應(yīng)一方面打破了血液中的的 電離平衡而激活凝血因子的釋放，另一方面海藻酸鈉溶液具有粘滯性而阻止血液的流動。 且海藻酸鹽遇水膨脹，吸收血液中的水分，使血液濃度和粘度增大，流速減慢，加速凝血。 (五)促進創(chuàng)傷組織再生:殼聚糖是巨噬細(xì)胞的趨化劑，巨噬細(xì)胞表面存在著細(xì)菌多糖的受 體，而殼聚糖作為細(xì)菌多糖的類似物，能刺激巨噬細(xì)胞活化。巨噬細(xì)胞在吞噬異物碎片和細(xì) 菌的同時，產(chǎn)生成纖維細(xì)胞生長因子、血管內(nèi)皮生長因子等大量的生長因子，誘導(dǎo)成纖維細(xì) 胞增殖、迀移、細(xì)胞外基質(zhì)沉淀，刺激內(nèi)皮細(xì)胞形成新的血管，為組織修復(fù)提供氧氣和必要 的營養(yǎng)物質(zhì)。（六）易揭除性:海藻酸鹽纖維與滲出液接觸后，可形成柔軟的水凝膠，防止摘 除紗布過程中對傷口造成二次創(chuàng)傷。（七)該敷料所需材料簡單，無復(fù)雜的技術(shù)要求和高端 的設(shè)備需求，易于推廣。
【附圖說明】
[0013] 圖1為浸漬法制備的殼聚糖藻酸鹽敷料成品(含15%的殼聚糖）。
[0014] 圖2為殼聚糖藻酸鹽敷料對金黃色葡萄球菌(a)、大腸桿菌(b)的抑菌實驗結(jié)果。
[0015] 圖3為外用殼聚糖藻酸鹽敷料后大鼠皮膚濕度增加百分比。
[0016] 圖4為促進創(chuàng)面愈合實驗研究中的大鼠創(chuàng)面模型。
[0017]圖5為大鼠第3天(左）、7天（中）和14天(右)的創(chuàng)面愈合情況。
[0018] 圖6為大鼠第3天、7天、14天創(chuàng)面面積統(tǒng)計。
[0019] 圖7為大鼠第3天、7天、14天時殼聚糖藻酸鹽敷料組和藻酸鹽敷料組創(chuàng)面組織HE染 色圖片。
【具體實施方式】
[0020] 本發(fā)明結(jié)合附圖和實施例作進一步的描述。
[0021] 實施例1新型殼聚糖藻酸鹽敷料的制作
[0022]將7.5g高分子量殼聚糖（分子量為80萬）、7.5g低分子量殼聚糖（分子量為3千）加 入85g弱酸性溶液中，攪拌均勻后制得15%的殼聚糖混合液;將商品化藻酸鹽敷料浸入殼聚 糖溶液中1小時，取出敷料，在60 °C干燥箱里干燥30分鐘，再紫外光照30分鐘消毒，即得15 % 新型殼聚糖藻酸鹽敷料(圖1)。
[0023]實施例2新型殼聚糖藻酸鹽敷料的制作
[0024]將5.Og高分子量殼聚糖（分子量為80萬）、5.Og低分子量殼聚糖（分子量為3千）加 入90g弱酸性溶液中，攪拌均勻后制得10%的殼聚糖混合液;將商品化藻酸鹽敷料浸入殼聚 糖溶液中15分鐘，取出敷料，在冷凍凍干機干燥12小時，再紫外光照30分鐘消毒，即得10 % 新型殼聚糖藻酸鹽敷料。
[0025]實施例3新型殼聚糖藻酸鹽敷料的制作
[0026]將10.0 g高分子量殼聚糖（分子量為80萬）、10.0 g低分子量殼聚糖（分子量為3千） 加入80g弱酸性溶液中，攪拌均勻后制得20%的殼聚糖混合液;將商品化藻酸鹽敷料浸入殼 聚糖溶液中2小時，取出敷料，在60°C干燥箱里干燥1小時，再紫外光照30分鐘消毒，即得 20%新型殼聚糖藻酸鹽敷料。
[0027]實施例4新型殼聚糖藻酸鹽敷料的制作
[0028]將15g高分子量殼聚糖（分子量為80萬）加入85g弱酸性溶液中，攪拌均勻后制得 15 %的殼聚糖混合液;將商品化藻酸鹽敷料浸入殼聚糖溶液中1小時，取出敷料，在冷凍凍 干機干燥3小時，再紫外光照30分鐘消毒，即得15%新型殼聚糖藻酸鹽敷料。
[0029] 實施例5 CCK-8法檢測新型殼聚糖藻酸鹽敷料對細(xì)胞的增殖毒性
[0030] 原理：
[0031] Cell counting kit-8簡稱CCK-8試劑，利用CCK-8試劑檢測細(xì)胞活性的方法通常 稱為cck-8法，它是為克服MTT法檢測細(xì)胞活性穩(wěn)定性不佳、對于重復(fù)性實驗結(jié)果容易出現(xiàn) 較大差異等不足而近年來新出現(xiàn)的細(xì)胞活性檢測方法?；赪ST-8,廣泛應(yīng)用于細(xì)胞增殖和 細(xì)胞毒性的快速高靈敏度檢測。WST-8與MTT類似，在電子耦合劑存在的情況下，可以被線粒 體內(nèi)的脫氫酶還原生成高度水溶性的橙黃色的甲臜染料(formazan)。生成的甲臜物的數(shù)量 與活細(xì)胞的數(shù)量成正比，因此可利用這一特性直接進行細(xì)胞增殖和毒性分析。使用酶標(biāo)儀 在450mM波長處測定OD值，反映活細(xì)胞數(shù)量。
[0032]實驗方法：
[0033] 1)材料浸提液制備:根據(jù)《68/1'16886.5-2003/130 10993-5:1999醫(yī)療器械生物 學(xué)評價第5部分:體外細(xì)胞毒性試驗》中的浸提液試驗。將新型殼聚糖藻酸鹽敷料、藻酸鹽敷 料分別制成Imm厚，Icm2的正方形片，加入IOml培養(yǎng)基置37°C恒溫箱中浸提24小時即成材料 浸提液。
[0034] 2)細(xì)胞懸液制備：取對數(shù)生長期的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞NIH3T3(中國科學(xué)院細(xì)胞 庫），用DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液離心稀釋吹打成濃度為10 X 104/ml的單細(xì)胞懸液。
[0035] 3)96孔培養(yǎng)板接種:將配置好的單細(xì)胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板，每孔細(xì)胞懸液量 為IOOul，復(fù)孔5孔，孔板周圍加 PBS IOOul，保持濕度。置37 °C、5 % CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。
[0036] 4)浸提液交換：24小時后，細(xì)胞已完全貼壁。棄去原培養(yǎng)基，取含體積分?jǐn)?shù)10 %、 50%、100%新型殼聚糖藻酸鹽敷料浸提液的DMEM高糖培養(yǎng)液(實驗組）、含體積分?jǐn)?shù)10%、 50 %、100 %藻酸鹽敷料浸提液的DMEM高糖培養(yǎng)液（陰性對照組）、含體積分?jǐn)?shù)10 %胎牛血清 的DMEM高糖培養(yǎng)液(空白對照組）、含5 %二甲基亞砜的DMEM高糖培養(yǎng)液(陽性對照組），每孔 I OOul，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24h。
[0037] 5)吸光度測定：取出96孔板，每孔加 CCK-8檢測劑IOuL，置于⑶2培養(yǎng)箱孵育2h，選 擇450nm波長在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定每孔的吸光度值，實驗重復(fù)3次取平均值，并記錄結(jié) 果。
[0038] 6)根據(jù)公式計算細(xì)胞相對增殖率(Relative growth rate，RGR) :RGR =實驗A值/ 空白對照組A值X 100%。然后根據(jù)RGR值按《GB/T 16175-1996。醫(yī)用有機硅材料生物評價試 驗方法》中細(xì)胞相對增殖率與細(xì)胞毒性的分級的關(guān)系評定材料的細(xì)胞毒性等級。RGR多 100 %，毒性0級；在75%-99%之間，毒性1級；在50 %-74%之間，毒性2級；在25 %-49 %之 間，毒性3級;在1 %-24%之間，毒性4級;0，毒性5級。細(xì)胞毒性評價在0、1級內(nèi)可認(rèn)為符合無 細(xì)胞毒性的標(biāo)準(zhǔn)。
[0039]實驗結(jié)果：各敷料浸提液培養(yǎng)NIH3T3細(xì)胞24小時的吸光度值、相對增殖率及細(xì)胞 毒性檢測結(jié)果參見表1。
[0040]表1.各敷料浸提液培養(yǎng)NIH3T3細(xì)胞24h的吸光度值、相對增殖率及細(xì)胞毒性檢測 (n = 6)
[0042] 表1提示體積分?jǐn)?shù)10%、50%、100%的新型殼聚糖藻酸鹽敷料浸提液對細(xì)胞生長 無明顯抑制作用，毒性均為〇級或1級，即新型殼聚糖藻酸鹽敷料無明顯細(xì)胞毒性。
[0043] 實施例6抑菌圈法檢測新型殼聚糖藻酸鹽敷料的抗菌性
[0044] 實驗方法：
[0045] 1)敷料制作:將商品化藻酸鹽敷料裁剪為直徑為6_的圓形敷料若干，然后將其分 別浸入15 %殼聚糖溶液、1 %的弱酸溶液、青霉素注射液（160萬U溶解于20ml生理鹽水）、鏈 霉素注射液（100萬U溶解于20ml生理鹽水）1小時，60 °C干燥箱干燥30分鐘，紫外光照30分鐘 滅菌，分別制得新型殼聚糖藻酸鹽敷料、藻酸鹽敷料、青霉素敷料、鏈霉素敷料。
[0046] 2)抑菌圈實驗:取金黃色葡萄球菌和大腸桿菌，含菌數(shù)濁度為0.5mcf的菌懸液，用 醫(yī)用棉簽將細(xì)菌均勻涂在平板上，每種菌重復(fù)3塊平皿。用無菌鑷子將制得的圓形敷料貼在 含菌皿上，每皿貼3種不同敷料(分別為新型殼聚糖藻酸鹽敷料、藻酸鹽敷料，以及青霉素敷 料或鏈霉素敷料），敷料之間間隔一定的距離。以上操作均在超凈臺上進行，37°C培養(yǎng)24h后 測定敷料的抑菌圈直徑。
[0047] 如果敷料有抑菌作用，則在敷料片貼敷區(qū)域周圍會出現(xiàn)一個無菌生長的透明圈， 即抑菌圈。以抑菌圈的直徑作為評定指標(biāo)，抑菌圈直徑越大，說明該敷料對此種供試菌的抑 制效果越好，反之則抑制效果越差。
[0048] 實驗結(jié)果:各敷料對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的抑菌圈直徑參見圖2,統(tǒng)計結(jié)果 參見表2。
[0049] 表2.各敷料樣品對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的抑菌圈直徑(_，乙>D,n = 3)
[0051 ]注:敷料空白直徑6mm，表中各個數(shù)據(jù)均為減去空白直徑后的數(shù)值。
[0052]金黃色葡萄球菌的實驗結(jié)果（圖2a):青霉素敷料對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑 最大，平均達到36mm;新型殼聚糖藻酸鹽敷料對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑平均為12mm， 有一定抑菌作用;藻酸鹽敷料對金黃色葡萄球菌無明顯抑菌圈出現(xiàn)，無抑菌作用。
[0053]大腸桿菌的實驗結(jié)果（圖2b):鏈霉素敷料對大腸桿菌的抑菌圈直徑最大，平均達 到35mm;新型殼聚糖藻酸鹽敷料對大腸桿菌的抑菌圈直徑平均為5mm，有一定抑菌作用;藻 酸鹽敷料對大腸桿菌無明顯抑菌圈出現(xiàn)，無抑菌作用。
[0054]實驗結(jié)果表明：殼聚糖藻酸鹽敷料對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均有顯著的抗菌 作用。
[0055]實施例7新型殼聚糖藻酸鹽敷料保濕性能的檢測 [0056]實驗方法：
[0057] 取SD大鼠6只（浙江大學(xué)附屬第一醫(yī)院動物實驗室提供，體重200_250g，均為雄 性），背部脫毛后統(tǒng)一用溫和清潔劑洗凈，在恒定環(huán)境中靜置30min，在大鼠左右背部各畫1 個2cmX2cm方格。用數(shù)字皮膚水分檢測儀檢測受試部位，重復(fù)3次，得出其平均值作為大鼠 背部皮膚初始濕度值，記為A〇。將新型殼聚糖藻酸鹽敷料、藻酸鹽敷料覆貼于相應(yīng)的受試部 位，外包扎后211、611、1211、2411、4811、7211分別檢測受試部位的濕度值，均重復(fù)檢測3次，取平均 值，記為△"(11 = 2,6，12,24,48,72)。受試部位濕度增加百分比％?11=以1^())/^()(11 = 2,6，12， 24，48，72) X 100%。數(shù)據(jù)以均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差表示，所有數(shù)據(jù)用SPSS19.0軟件處理，p〈0.05有統(tǒng) 計學(xué)意義。兩組間比較采用配對樣本T檢驗。
[0058]實驗結(jié)果:外用敷料后大鼠皮膚水分增加值的檢測結(jié)果參見表3,濕度增加百分比 隨時間變化的曲線參見圖3。
[0059]表3.外用敷料后大鼠皮膚水分增加值（％，X土 SD，η = 6)
[0062] 表3和圖3是各樣品在2h、6h、12h、24h、48h的大鼠背部皮膚濕度增加的比例及皮膚 濕度增加比例隨時間變化的曲線。從表3和圖3中可以看出，新型殼聚糖藻酸鹽敷料對大鼠 皮膚濕度增加的比例高于藻酸鹽敷料。經(jīng)過配對樣本T檢驗，在2h、6h、12h、24h、48h時，新型 殼聚糖藻酸鹽敷料組濕度增加百分比高于藻酸鹽敷料組，且有顯著性差異(P〈〇.05)。所以 與傳統(tǒng)藻酸鹽敷料相比，新型殼聚糖藻酸鹽敷料在使用2天及以內(nèi)時具有更好的保濕性。
[0063] 實施例8新型殼聚糖藻酸鹽敷料對大鼠創(chuàng)面愈合的影響 [0064]實驗方法：
[0065] 1)實驗動物與分組：
[0066]清潔級大鼠16只（浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院動物實驗中心提供），體重200-250g，雄性，隨機分為A、B 2組，每組8只，A組大鼠左側(cè)創(chuàng)面敷新型殼聚糖藻酸鹽敷料，右側(cè) 創(chuàng)面敷藻酸鹽敷料。B組大鼠右側(cè)創(chuàng)面敷新型殼聚糖藻酸鹽敷料，左側(cè)創(chuàng)面敷藻酸鹽敷料。 [0067] 2)動物創(chuàng)傷模型的建立(圖4):
[0068] 大鼠常規(guī)飼養(yǎng)3d后，于腹腔內(nèi)注射2%戊巴比妥鈉30-50ml/1000g，麻醉成功后背 部局部備皮。在大鼠背部正中線兩側(cè)設(shè)計對稱的直徑2cm圓形切口，消毒后沿切口線切除包 括肉膜在內(nèi)的大鼠皮膚全層，形成開放創(chuàng)面，深達筋膜。
[0069] 3)給藥方法：
[0070] 創(chuàng)傷模型建立后，即刻用生理鹽水棉球行創(chuàng)面止血，在A組大鼠左側(cè)創(chuàng)面敷新型殼 聚糖藻酸鹽敷料，右側(cè)創(chuàng)面敷藻酸鹽敷料。B組大鼠右側(cè)創(chuàng)面敷新型殼聚糖藻酸鹽敷料，左 側(cè)創(chuàng)面敷藻酸鹽敷料。敷料覆蓋整個創(chuàng)面。外包扎后單籠飼養(yǎng)，每3天換藥1次，直至愈合。
[0071] 4)評估創(chuàng)面愈合情況
[0072] (1)肉眼觀察創(chuàng)面愈合情況。
[0073] (2)創(chuàng)面面積計算:采用透明硫酸膜描記法，每組內(nèi)隨機選取2只大鼠，共4只。分別 于給藥〇、3、7、14d后用半透明紙繪得創(chuàng)面圖形，再將圖形描至小方格紙上，測定小方格紙的 格數(shù)標(biāo)示創(chuàng)面面積，并記錄最終創(chuàng)面愈合時間。創(chuàng)面愈合率=(原始創(chuàng)面面積-未愈合創(chuàng)面 面積)/原始創(chuàng)面面積X 100%。愈合時間：創(chuàng)面制作后，以創(chuàng)面愈合率大于或等于95%的天 數(shù)為創(chuàng)面愈合時間。記錄造模后至創(chuàng)面愈合所需時間。
[0074] (3)創(chuàng)面組織學(xué)染色:于敷料貼敷后3、7、14d分別取4只大鼠（A組隨機2只，B組隨機 2只）處死取材。過未愈合創(chuàng)面中心取寬3mm修復(fù)組織，長度包括5mm正常皮膚組織，做HE染 色。顯微鏡下觀察新生組織情況，包括新生血管及膠原纖維分布情況。
[0075] 5)統(tǒng)計學(xué)分析:用SPSS19.0統(tǒng)計軟件行配對樣本T檢驗進行顯著性檢驗，P〈0.05為 差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
[0076] 實驗結(jié)果：
[0077] 1)肉眼觀察示:造模后3天，大鼠兩側(cè)傷口均有收縮，新型殼聚糖藻酸鹽敷料側(cè)收 縮較好，肉眼觀察到創(chuàng)面面積縮小。造模后7天，新型殼聚糖藻酸鹽敷料側(cè)傷口收縮明顯，收 縮程度明顯大于藻酸鹽側(cè)。造模后14天，新型殼聚糖藻酸鹽敷料側(cè)創(chuàng)面面積明顯小于藻酸 鹽敷料側(cè)。（圖5)。
[0078] 2)創(chuàng)面面積計算（圖6):新型殼聚糖藻酸鹽敷料側(cè)在3d、7d、14d時，創(chuàng)面面積均小 于藻酸鹽敷料側(cè)，兩側(cè)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(3d時117 ± I Imm2Vs 178 ± 7mm2，P〈0.05; 7d時71 土 13mm2vs 136±5mm2，P〈0.05; 14d時24±4mm2vs 64±9mm2，P〈0.05)。兩側(cè)創(chuàng)面愈合時間，新 型殼聚糖藻酸鹽敷料側(cè)為17 ± 1.80天，藻酸鹽敷料側(cè)為21 ± 1.45天，兩側(cè)差異有統(tǒng)計學(xué)意 義(P〈0.05)。所以，相比藻酸鹽敷料，新型殼聚糖藻酸鹽敷料有更好的促創(chuàng)面愈合效果。
[0079] 3)組織學(xué)觀察結(jié)果：術(shù)后3天可觀察到組織修復(fù)，兩側(cè)創(chuàng)面均以白細(xì)胞浸潤為主， 新型殼聚糖藻酸鹽敷料側(cè)(實驗側(cè))有毛細(xì)血管芽及新生血管形成（圖7d);而藻酸鹽敷料側(cè) (對照側(cè)）出現(xiàn)大量炎癥細(xì)胞，少有內(nèi)皮細(xì)胞(圖7a)。術(shù)后7天，新型殼聚糖藻酸鹽敷料側(cè)(實 驗側(cè))新生血管數(shù)量明顯增多，初步形成毛細(xì)血管網(wǎng)，炎癥細(xì)胞較前稀疏，成纖維細(xì)胞增多， 有膠原纖維形成（圖7e);而藻酸鹽敷料側(cè)(對照側(cè))新生血管也有形成，數(shù)量較少，炎癥細(xì)胞 較實驗組密集，散在分布成纖維細(xì)胞，未見明顯膠原纖維形成（圖7b)。術(shù)后14天，新型殼聚 糖藻酸鹽敷料側(cè)(實驗側(cè))毛細(xì)血管較多，毛細(xì)血管網(wǎng)結(jié)構(gòu)正常，可見部分新生血管分化為 成熟血管，膠原纖維多且排列有序，基本平行于皮膚創(chuàng)面(圖7f);藻酸鹽敷料側(cè)(對照側(cè))仍 以新生血管為主，量較前增多，未分化，成纖維細(xì)胞增殖紊亂，形態(tài)不規(guī)則，膠原纖維數(shù)量也 較少且排列不規(guī)則（圖7c)。
[0080] 綜上，肉眼觀察、創(chuàng)面面積統(tǒng)計、組織學(xué)觀察均提示:與藻酸鹽敷料側(cè)相比，新型殼 聚糖藻酸鹽敷料側(cè)(實驗側(cè))創(chuàng)面愈合更快。即新型殼聚糖藻酸鹽敷料相比于市面上的藻酸 鹽敷料，有更好的促創(chuàng)面愈合效果。
【主權(quán)項】
1. 一種殼聚糖藻酸鹽敷料，其特征在于，通過以下步驟實現(xiàn)： (1) 制備殼聚糖混合液:取酸溶液，加入殼聚糖混合物，均勻混合，制得質(zhì)量濃度為10-20%的殼聚糖混合液，酸溶液的質(zhì)量濃度為1% ; (2) 制備殼聚糖藻酸鹽敷料:將商品化藻酸鹽敷料浸入殼聚糖混合液15分鐘-2小時，取 出后干燥處理，冷凍凍干機干燥3-12小時或干燥箱烘干30分鐘-1小時，得殼聚糖藻酸鹽敷 料； (3) 消毒處理:采用紫外光照30分鐘。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種殼聚糖藻酸鹽敷料，其特征在于，步驟（1)所用酸為醋酸、 檸檬酸或山梨酸中的一種。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種殼聚糖藻酸鹽敷料，其特征在于，步驟（1)所用的殼聚糖 混合物由高分子量和低分子量殼聚糖均勻混合，重量比范圍為1:1;極端情況也可單獨應(yīng)用 高分子量或低分子量殼聚糖。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種殼聚糖藻酸鹽敷料，其特征在于，分子量大于10萬道爾頓 的為高分子量殼聚糖，低于10萬道爾頓的為低分子量殼聚糖。
【文檔編號】A61L15/44GK106075534SQ201610545807
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年7月7日
【發(fā)明人】談偉強, 張利云, 王曉維, 方青青, 徐驥華
【申請人】浙江大學(xué)