凝血因子ix綴合物的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及與肝素原(HEP)聚合物綴合的因子IX多肽、其制備方法以及此類(lèi)綴合物的用途。所得綴合物可用于例如出血性病癥如B型血友病的治療或預(yù)防。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
凝血因子IX綴合物
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及凝血因子IX與肝素原化eparosan)聚合物之間的綴合物及其用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 在患有凝血病的受試者中，諸如在患有血友病的人中，凝血級(jí)聯(lián)的各個(gè)步驟由于 例如凝血因子的缺乏或存在不足而成為功能障礙的。凝血級(jí)聯(lián)的一部分的運(yùn)種功能障礙導(dǎo) 致不充分的血液凝固W及潛在危及生命的出血或?qū)?nèi)臟器官如關(guān)節(jié)的損傷。
[0003] B型血友病是由凝血因子IX活性的缺乏或功能障礙引起的，并且其患者可通過(guò)按 需施用因子IX來(lái)治療。
[0004] 目前的治療建議正從傳統(tǒng)的按需治療轉(zhuǎn)向預(yù)防。目前的預(yù)防性療法需要每周多次 給藥，但為了獲得最佳血漿水平和功效，每日一次注射將會(huì)更好。由于與每日施用相關(guān)的實(shí) 際和經(jīng)濟(jì)的限制，運(yùn)對(duì)于患者而言不是理想的解決方案。
[0005] 凝血因子IX是一種用于治療B型血友病的有價(jià)值的治療性多膚。雖然現(xiàn)今正在使 用商購(gòu)可得形式的因子IX，但本領(lǐng)域仍然普遍需要具有改善的藥代動(dòng)力學(xué)的更長(zhǎng)效的因子 IX多膚。
[0006] 治療性多膚如因子IX多膚可W與半衰期延長(zhǎng)部分融合或綴合，W便延長(zhǎng)所述藥物 在施用于患者之后的血漿半衰期。
[0007] 可通過(guò)使用酶法進(jìn)行例如親水聚合物形式的半衰期延長(zhǎng)部分與膚或多膚的綴合。 運(yùn)些方法可W是選擇性的，其要求在蛋白質(zhì)序列中存在特異性的膚共有基序，或要求存在 翻譯后部分如聚糖。
[0008] 已描述了用于修飾凝血因子上的N-或0-聚糖的選擇性酶法。例如，已描述了化學(xué) 修飾的唾液酸底物（Malmstromj Anal Bioanal 化em 2012;403:1167-1177)，其可用 于使用唾液酸轉(zhuǎn)移酶ST3Gaini使因子Vila在N-聚糖上發(fā)生糖基聚乙二醇化(Stennicke， 皿等人.Thromb 化emost. 2008年11月；100(5) :920-8),?及使用ST3GalI使因子VIII在0- 聚糖上發(fā)生糖基聚乙二醇化（Stennicke，皿等人，Blood. 2013年3月14日；121 (11): 2108- 16)。
[0009] 例如，US2006040856設(shè)及經(jīng)由完整的糖基連接基團(tuán)連接的因子IX與聚乙二醇 (PEG)部分之間的綴合物，該糖基連接基團(tuán)在膚與PEG部分之間插入并與該膚和PEG部分共 價(jià)連接。
[0010] W上提及的方法的共同特征是使用修飾的唾液酸底物，甘氨酷基唾液酸胞巧一憐 酸(GSC)和采用半衰期延長(zhǎng)部分對(duì)GSC的化學(xué)酷化。
[001。 例如，可W使激活為硝基苯基-或N-徑基-班巧酷亞胺醋的陽(yáng)G聚合物酷化至化SC的 甘氨酷基氨基基團(tuán)上，W產(chǎn)生可W酶促轉(zhuǎn)移至糖蛋白的N-和0-聚糖上的PEG取代的唾液酸 底物(參見(jiàn) W02006127896、W02007022512、US2006040856)。W類(lèi)似的方式，可W使用N-?基- 班巧酷亞胺激活的醋化學(xué)法使脂肪酸酷化到GSC的甘氨酷基氨基基團(tuán)上(W020m01277)。
[0012]然而，本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)先前公開(kāi)的方法不適合于將高度官能化的半衰期延長(zhǎng)部分 如碳水化合物聚合物附接至GSC。
[0013] 在本發(fā)明中，公開(kāi)了半衰期延長(zhǎng)聚合物肝素原與因子IX之間的新型綴合物，W及 該綴合物的用途和制備方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0014] 本文描述了新型肝素原-因子IX化EP-FIX)多膚綴合物及其制備。運(yùn)些綴合物提供 了優(yōu)于本領(lǐng)域已知的某些其他綴合物例如基于PEG的綴合物的生物學(xué)性質(zhì)。
[0015] 本文描述的綴合物被肝素原化EP)形式的生物可降解的半衰期延長(zhǎng)部分保護(hù)，該 部分延長(zhǎng)因子IX(FIX)的體內(nèi)半衰期。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的皿P-FIX多膚綴合物具 有與未綴合的FIX多膚相比延長(zhǎng)的循環(huán)半衰期;或與未綴合的FIX多膚相比延長(zhǎng)的功能性半 衰期。
[0016] 在一些實(shí)施方案中，該肥P-FIX多膚綴合物具有與未綴合的FIX多膚相比增加的平 均停留時(shí)間;或與未綴合的FIX多膚相比增加的功能性平均停留時(shí)間。
[0017] 而且，在一些實(shí)施方案中，所述綴合物在aPTT試驗(yàn)中尤其顯示了與類(lèi)似的聚乙二 醇化FIX變體相比改善的性能。
[001引在一些實(shí)施方案中，聚合物形式的皿P具有小于1.10或小于1.05的多分散性指數(shù) (Mw/Mn)0
[0019] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述聚合物可具有約13至約60kDa如38、41和44kDa的平均大 小。
[0020] 而且，可W使用具有改善的性質(zhì)(例如，穩(wěn)定性)的連接體產(chǎn)生本文描述的皿P-FIX 多膚綴合物。在一個(gè)運(yùn)樣的實(shí)施方案中，提供了皿P-FIX多膚綴合物，其中W獲得穩(wěn)定且無(wú) 異構(gòu)體的綴合物的方式將皿P部分與FIX連接。在一個(gè)運(yùn)樣的實(shí)施方案中，使用包含與唾液 酸衍生物如甘氨酷基唾液酸胞巧一憐酸(GSC)連接的4-甲基苯甲酯基的化學(xué)連接體，將肥P 聚合物與FIX連接。
[0021] 本文描述的肥P-FIX多膚綴合物在凝血病的治療、特別是B型血友病的預(yù)防性治療 中尤其有用。
【附圖說(shuō)明】
[0022] 圖1:甘氨酷基唾液酸胞巧一憐酸(GSC)采用苯甲醒基團(tuán)的官能化。用4-甲酯基苯 甲酸使GSC酷化，隨后通過(guò)還原胺化反應(yīng)使GSC與肝素原化EP)-胺反應(yīng)。
[0023] 圖2:肝素原化EP)聚合物采用苯甲醒基團(tuán)的官能化，及隨后在還原胺化反應(yīng)中與 甘氨酷基唾液酸胞巧一憐酸(GSC)的反應(yīng)。
[0024] 圖3:甘氨酷基唾液酸胞巧一憐酸(GSC)采用琉基的官能化，及隨后與馬來(lái)酷亞胺 官能化的肝素原化邸)聚合物的反應(yīng)。
[0025] 圖4:肝素原化EP)-甘氨酷基唾液酸胞巧一憐酸(GSC)。
[0026] 圖5:經(jīng)由4-甲基苯甲酯基亞連接（sublinkage)而綴合到因子IX上的雙觸角 (biantenna)N-聚糖（位置N157或N167)上的肝素原化EP)-甘氨酷基唾液酸胞巧一憐酸 (GSC)o
[0027] 圖6:F9-K0小鼠中相對(duì)于時(shí)間的血漿FIX濃度。通過(guò)基于抗原的試驗(yàn)(a) W及分別 基于凝固活性和顯色活性的試驗(yàn)(b)和（c)，隨時(shí)間測(cè)量該濃度。向F9-K0小鼠靜脈內(nèi)給予 27nmol/kg(1.5mg FIX/kg)的BeneFIX"、i〇kDa PEG-[N]-FIX和60kDa HEP-[C]-FIX 化162C)。結(jié)果為半對(duì)數(shù)圖中的平均值±SD，n = 3。
[002引圖7: F9-K0小鼠中相對(duì)于時(shí)間的FIX血漿濃度。通過(guò)基于抗原的試驗(yàn)（圖7a)和基于 顯色活性的試驗(yàn)（圖7b)測(cè)量該濃度。向小鼠靜脈內(nèi)給予27皿ol/kg(1.5mg FIX/kg)的與13 至60kDa皿P聚合物綴合的FIX。Τ'表示切S-綴合而"N"表示N-聚糖綴合。結(jié)果為半對(duì)數(shù)圖 中的平均值±SD，n = 3。
[00巧]圖8:60kDa皿P-[C]-FIX E162C和FIX劑量依賴(lài)性地且顯著地減少了F9-K0小鼠在 尾靜脈橫切后的失血，它們具有相當(dāng)?shù)男Я?。F9-K0小鼠在誘導(dǎo)出血前l(fā)Omin給藥。FIX-皿P 和FIX的抓50分別為0.012mg/kg和0.030mg/kg(p = 0.38)。*和***分別表示與接受載體的血 友病對(duì)照組相比在P<〇.〇5和p<0.001下的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異。數(shù)據(jù)為平均值±561。
[0030] 圖9:60kDa肥P-[C]-Fix E162C(FIX-肥P)和rFIX劑量依賴(lài)性地且顯著地縮短了 F9-K0小鼠在尾靜脈橫切后的出血時(shí)間，它們具有相當(dāng)?shù)男ЯΑ9-K0小鼠在誘導(dǎo)出血前 lOmin 給藥。FIX-肥巧日 FIX 的抓 50 分別為 0.009mg/kg 和 0.024111旨/1^(9 = 0.18)。*、**和***分 別表示與接受載體的血友病對(duì)照相比在P<0.05、p<0.01和p<0.001下的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差 異。數(shù)據(jù)為平均值±561。
[0031] 圖10:40W)a肥P-陽(yáng)]-FIX和rFIX劑量依賴(lài)性地且顯著地減少了F9-K0小鼠在尾靜 脈橫切后的失血，它們具有相當(dāng)?shù)男Я?。F9-K0小鼠
[0032] 在誘導(dǎo)出血前l(fā)Omin給藥。40kDa皿P-[N]-FIX和rFIX的抓50分別為0.032mg/kg和 0.027111旨/1^(9 = 0.67)。*林和****分別表示與接受載體的血友病對(duì)照相比在9<0.001和口 <0.0001下的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異。數(shù)據(jù)為平均值±561。
[0033] 圖11:在滲加的人FIX缺乏的血漿中的FIX活性相對(duì)于顯色活性的恢復(fù)率。將Ξ種 濃度的化合物滲加到人FIX耗盡的血漿中，并使用Biophen Hypen顯色試驗(yàn)和在一期凝固試 驗(yàn)(one-s化ge clotting assay)中使用五種指定的aPTT試劑進(jìn)行分析。結(jié)果W凝固活性占 顯色活性的百分比給出，并且為平均值+/-SD，n = 3。在所有試驗(yàn)中針對(duì)正常人血漿校準(zhǔn)物 (ILS)測(cè)量活性。
[0034] 化合物：柱l-5:BeneF^IX';;柱6-10:27kDa肥P-[C]-FIX巧162C);柱ll-15:40kDa HEP-[C]-FIX化162C);柱16-20:40kDa 肥P-[N]-FIX;柱21-25:60kDa HEP-[C]-FIX 化162C);柱26-30:N9-GP)。
[0035] 基于aPTT的試驗(yàn)的類(lèi)型：柱1、6、11、16、21、26iActinp'.S? (Siemens);柱2、7、12、 17、22、27:Syn化船il愈(ILS);柱3、8、13、18、23、28:SyrΓ出afaχK([LS);柱4、9、14、19、24、 29:APTT SP(ILS);柱5、10、15、20、25、30:STApTT?(S^go)。
[0036] 圖12:該圖顯示了與等效劑量的rFIX相比，40W)a肥P-陽(yáng)]-FIX的止血作用的顯著 延長(zhǎng)的持續(xù)時(shí)間。在F9-K0小鼠中運(yùn)兩種化合物在給藥后均立即顯著減少了由尾靜脈橫切 引起的失血，但在給藥后72小時(shí)與載體組（P = 0.0028)和rFIX治療組（P = 0.022)相比， 40kDa肥P-[N]-FIX的作用仍然是顯著的。*、林和****分別表示在p<0.05、p<0.01和口< 0.0001下的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異。數(shù)據(jù)為平均值±561。
[0037] 圖13:反應(yīng)方案，其中在ST3GalIII唾液酸轉(zhuǎn)移酶的存在下使去唾液酸FIX糖蛋白 與肥P-GSC反應(yīng)。
[00；3引 序列簡(jiǎn)述
[0039] 沈Q ID NO: 1給出了人因子IX的氨基酸序列。
【具體實(shí)施方式】
[0040] 本發(fā)明設(shè)及新型肝素原-因子IX多膚化EP-FIX)綴合物及其制備。運(yùn)些綴合物提供 了優(yōu)于本領(lǐng)域已知的其他綴合物的生物學(xué)性質(zhì)。
[0041] 因子IX(FIX)缺乏癥，常被稱(chēng)為B型血友病，是影響全世界約120,000人的先天性出 血性病癥，運(yùn)120,000人中約有27,000人目前得到診斷并且少于10,000人接受照護(hù)。常規(guī)治 療由替代療法組成，其作為出血發(fā)作的預(yù)防或按需治療而提供。當(dāng)前對(duì)于患有重度B型血友 病的人的治療通常是每周2-3次預(yù)防性注射BeneFIX'K (野生型rFix)。
[0042] 在患有凝血病的受試者中，諸如在患有A型和B型血友病的人中，凝血級(jí)聯(lián)的各個(gè) 步驟由于例如凝血因子的缺乏或存在不足而成為功能障礙的。凝血級(jí)聯(lián)的一部分的運(yùn)種功 能障礙導(dǎo)致不充分的血液凝固W及潛在危及生命的出血或?qū)?nèi)臟器官如關(guān)節(jié)的損傷?；加?B型血友病的個(gè)體可W接受凝血因子替代療法，如外源FIX。然而，運(yùn)樣的患者具有生成針對(duì) 此類(lèi)外源因子的中和抗體(所謂"抑制物"）的風(fēng)險(xiǎn)，從而使得先前有效的療法變得無(wú)效。此 夕h外源凝血因子只可W靜脈內(nèi)施用，運(yùn)對(duì)于患者是相當(dāng)不便和不適的。例如，對(duì)于嬰兒和 幼兒，可能必須將靜脈內(nèi)導(dǎo)管經(jīng)手術(shù)插入胸部靜脈，W確保靜脈通路。運(yùn)使他們處于很大的 發(fā)生細(xì)菌感染的風(fēng)險(xiǎn)中。因此，在血友病群體中，特別是在患有凝血病的受試者中，仍普遍 存在許多未得到滿(mǎn)足的醫(yī)療需求。
[0043] 先天性低凝血病化ypocoagulopathies)包括B型血友病。所述B型血友病可W是重 度、中度或輕度的。血友病的臨床嚴(yán)重性通過(guò)血液中FIX的功能單位的濃度來(lái)確定，并分類(lèi) 為輕度、中度或重度。按照對(duì)應(yīng)于小于正常水平的1%的<〇.〇lU/ml的凝血因子水平定義重 度血友病，而中度和輕度患者分別具有1-5%和>5%的水平。
[0044] FIX活性的先天性缺乏是X連鎖的出血性病癥即B型血友病的病因，該疾病影響到 100000個(gè)男性中的大約1個(gè)。目前通過(guò)采用重組的或血漿衍生的因子IX的替代療法來(lái)治療 運(yùn)些B型血友病患者。
[0045] 具有"抑制物"（即針對(duì)FIX的同種抗體）的B型血友病是部分先天性且部分獲得性 的凝血病的非限制性實(shí)例。
[0046] 獲得性凝血病的一個(gè)非限制性實(shí)例是由維生素 K缺乏引起的絲氨酸蛋白酶缺乏 癥;運(yùn)樣的維生素 K缺乏可能是由維生素時(shí)吉抗劑如華法林的施用引起的。獲得性凝血病還 可能在大面積創(chuàng)傷之后發(fā)生。在運(yùn)種也被稱(chēng)為"出血性惡性循壞'的情況下，其特征為血液 稀釋(稀釋性血小板減少癥和凝血因子的稀釋?zhuān)⒌腕w溫、凝血因子的消耗和代謝素亂(酸中 毒）。補(bǔ)液療法和纖維蛋白溶解增加可能使運(yùn)種情況惡化。所述出血可能來(lái)自身體的任何部 位。
[0047] 醫(yī)源性凝血病的一個(gè)非限制性實(shí)例是可被開(kāi)出用于治療血栓栓塞性疾病的抗凝 血藥物-如肝素、阿司匹林、華法林和其他血小板聚集抑制劑-的過(guò)量用藥。醫(yī)源性凝血病的 第二個(gè)非限制性實(shí)例是由過(guò)度和/或不適當(dāng)?shù)难a(bǔ)液療法誘發(fā)的醫(yī)源性凝血病，諸如可能由 輸血誘發(fā)的醫(yī)源性凝血病。
[0048] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，出血與B型血友病相關(guān)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，出血 與具有獲得的抑制物的B型血友病相關(guān)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，出血與血小板減少相關(guān)。在 另一個(gè)實(shí)施方案中，出血與馮?維勒布蘭德(von Willebrand)病相關(guān)。在另一個(gè)實(shí)施方案 中，出血與重度組織損傷相關(guān)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，出血與重度創(chuàng)傷相關(guān)。在另一個(gè)實(shí)施 方案中，出血與外科手術(shù)相關(guān)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，出血與出血性胃炎和/或腸炎相關(guān)。在 另一個(gè)實(shí)施方案中，出血為血崩，諸如在胎盤(pán)早剝中。在另一個(gè)實(shí)施方案中，出血發(fā)生在機(jī) 械止血的可能性有限的器官中，諸如煩內(nèi)、耳內(nèi)或眼內(nèi)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，出血與抗凝 血療法相關(guān)。
[0049] 因子 IX
[0050] FIX是與因子VII、凝血酶原、因子X(jué)和蛋白C具有結(jié)構(gòu)相似性的維生素 K依賴(lài)性凝血 因子。循環(huán)酶原形式由分為四個(gè)不同結(jié)構(gòu)域的415個(gè)氨基酸組成，運(yùn)四個(gè)結(jié)構(gòu)域包括N-末端 富含丫-簇基谷氨酸(Gla)的結(jié)構(gòu)域、兩個(gè)EGF結(jié)構(gòu)域和C-末端膜蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶結(jié) 構(gòu)域。"野生型Fir的一個(gè)例子是全長(zhǎng)人FIX分子，如SEQ ID NO: 1所示。
[0051] FIX的激活通過(guò)在ArgMS-AlaM哺Argiw-Valisi處的限制性蛋白水解而發(fā)生，該蛋 白水解釋放35-aa片段，即所謂的激活膚。該激活膚被高度糖基化，其含有兩個(gè)N-連接的(在 位置N157和N167處)和若干個(gè)0-連接的聚糖。激活的因子IX被稱(chēng)為因子IX(a)或FIX(aKFIX (a)是通過(guò)在凝結(jié)過(guò)程中產(chǎn)生支持形成適當(dāng)凝血酶所必需的大多數(shù)因子X(jué)a作為tenase復(fù)合 物的一部分而在止血中發(fā)揮關(guān)鍵作用的膜蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶。"FIX(ar包括可在個(gè)體 之間存在并發(fā)生的FlX(a)的天然等位基因變體。
[0052] 除非另有說(shuō)明，F(xiàn)IX結(jié)構(gòu)域包括W下氨基酸殘基:Gla結(jié)構(gòu)域，即殘基Tyrl至殘基 Lys43的區(qū)域;EGF1，即殘基Gln44至殘基Leu84的區(qū)域;EGF2,即殘基Asp85至殘基Argl45的 區(qū)域;激活膚，即殘基Alal46至殘基ArglSO的區(qū)域；W及蛋白酶結(jié)構(gòu)域，即殘基VallSl至 化r414的區(qū)域。輕鏈?zhǔn)侵赴珿la結(jié)構(gòu)域、EGF1和EGF2的區(qū)域，而重鏈?zhǔn)侵傅鞍酌附Y(jié)構(gòu)域。W 下列出了野生型人凝血FIX的序列：
[005；3] YNSGKL 丫丫 FVQGNL 丫 R 丫 CM 丫丫 KCSF 丫丫 AR 丫 VF 丫 NT 丫 RTT 丫 FWKQYVDGDQCESNP化NGGSC邸DINSYECWCPFGFEGKNCE…VTCN化NGRCEQFCKNSADNKVVCSCTEGYRL AENQKSCEPAVPFPCGRVSVSQTSKLTRAEAVFPDVDYVNSTEAETILDNITQSTQSFNDFTRVVGGEDAKPGQFPW QV化NGKVDAFCGGSIV肥KWIVTAAHCVETGVKITVVAGEHNIEET邸TEQKRNVIRIIPHHNYNAAINKYNHDIA LL 化肥 PLVLNSYVTPICIAD 邸 YTNI 化 KFGSGYVSGWGRVF 服 GRSAL 化 QYLRVPLVDRATCLRSTKFTIYNNM FCAGF肥GG畑SCQGDSGGPHVTEVEGTS化TGIISWG邸CAMKGKYGIYTKVSRYVNWIK邸TKLT
[0054] 其中丫表示丫-簇基化的Glu( 'E'）。在完全丫-簇基化的FIX中，前12個(gè)Glu殘基是 丫-簇基化的，但存在發(fā)生較少丫 -簇基化的變體(尤其在重組FIX的情況下）。在FIX中的位 置148處存在二態(tài)性，該位置可W是Ala或Τ'虹(參見(jiàn)McGraw等人（1985)PNAS，82:2847)。
[0055] 如本文所用的，"因子IX"或"FIX"是指人血漿FIX糖蛋白，它是凝血接觸激活途徑 (也稱(chēng)為內(nèi)源性凝血途徑）的成員并且對(duì)于血液凝固是必需的。除非另有說(shuō)明或指示，F(xiàn)IX意 指在凝血中發(fā)揮其正常作用的任何功能性人FIX蛋白質(zhì)分子。
[0056] 如本文所用的，術(shù)語(yǔ)"FIX類(lèi)似物"意在表示具有SEQ ID N0:1的序列的FIX,不同之 處在于FIX的一個(gè)或多個(gè)氨基酸已被另一個(gè)氨基酸置換，和/或其中FIX的一個(gè)或多個(gè)氨基 酸已經(jīng)缺失，和/或其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸已經(jīng)插入FIX中，和/或其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸已 添加至FIX。運(yùn)樣的添加可在母體蛋白質(zhì)的N-末端或C-末端或運(yùn)兩個(gè)末端處發(fā)生。該定義中 的"類(lèi)似物"在其激活形式下仍具有FIX活性。在一個(gè)實(shí)施方案中，變體與SEQ ID NO: 1的序 列至少90%相同。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，變體與SEQ ID NO: 1的序列至少95%相同。如本 文所用的，任何提及的具體位置均指SEQ ID N0:1中的相應(yīng)位置。
[0057]如本文所用的，術(shù)語(yǔ)"因子IX多膚"或"FIX多膚"包括但不限于野生型人FIX和FIX (a) W及相對(duì)于野生型人FIX顯示出基本相同或改善的生物活性的多膚。運(yùn)些多膚包括但不 限于已化學(xué)修飾的FIX或FIXa，W及已引入特定氨基酸序列變化的FIX或FIXa類(lèi)似物，該變 化改變了該多膚的生物活性，除非另有說(shuō)明。還包括具有修飾的氨基酸序列的多膚，例如， 相對(duì)于人FIX具有修飾的N-末端(包括N-末端氨基酸缺失或添加）的多膚。還包括具有修飾 的氨基酸序列的多膚，例如，相對(duì)于人FIX具有修飾的C-末端(包括C-末端氨基酸缺失或添 加)的多膚。
[005引FIX多膚(包括與野生型FIX相比顯示出基本相同或更好的生物活性的FIX的類(lèi)似 物、變體和衍生物)包括但不限于具有與野生型FIX的序列相差一個(gè)或多個(gè)氨基酸的添加、 插入、缺失或置換的氨基酸序列的多膚。
[0059] 本發(fā)明絕不限于本文所述的序列。FIX類(lèi)似物例如在US5521070(其中在第一位的 酪氨酸被丙氨酸替代及W02007/135182(其中FIX中的一個(gè)或多個(gè)天然氨基酸殘基被半 脫氨酸殘基置換）中公開(kāi)。所述參考文獻(xiàn)通過(guò)引用W其全文并入于此。因此，F(xiàn)IX的類(lèi)似物和 變體是本領(lǐng)域公知的，并且本公開(kāi)內(nèi)容涵蓋那些已知的或未來(lái)將會(huì)開(kāi)發(fā)或發(fā)現(xiàn)的類(lèi)似物或 變體。
[0060] FIX或FlX(a)可W使用公知的生產(chǎn)和純化方法從血漿衍生或重組產(chǎn)生。糖基化、 丫-簇基化和其他翻譯后修飾的程度和位置可W根據(jù)所選的宿主細(xì)胞及其生長(zhǎng)條件而不 同。
[0061 ]用于產(chǎn)生重組蛋白的宿主細(xì)胞優(yōu)選為哺乳動(dòng)物來(lái)源的，W便確保分子在折疊和翻 譯后修飾例如0-和N-糖基化和硫酸化過(guò)程中適當(dāng)?shù)乇患庸?。合適的宿主細(xì)胞包括但不限于 中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CH0)、幼倉(cāng)鼠腎(BHK)和HEK29始田胞系。
[0062] 在一些實(shí)施方案中，使用例如包含與肥P綴合的FIX多膚的制劑形式的藥物組合物 治療患有凝血病的受試者，所述凝血病例如是B型血友病。
[0063] 在一些實(shí)施方案中，提供了包含皿P-FIX綴合物的組合物和制劑。特定的實(shí)施方案 包括包含與藥學(xué)上可接受的載體配制在一起的本文所述肥P-FIX綴合物的藥物組合物。
[0064] 凝血因子如因子IX的治療用途的主要限制是成本，特別是由于運(yùn)些蛋白質(zhì)的有效 劑量很高。常見(jiàn)劑量為250此蛋白質(zhì)/kg體重。
[0065] 提供具有成本效益的糖膚治療劑的問(wèn)題的一個(gè)解決方案是提供具有較長(zhǎng)體內(nèi)半 衰期的膚。例如，已通過(guò)將合成聚合物附接至膚骨架上產(chǎn)生了具有改善的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì) 的糖膚治療劑。與膚綴合的一種示例性聚合物為聚乙二醇(PEG)。
[0066] 當(dāng)前采用FIX對(duì)B型血友病的治療通常包括每周約兩次注射，并根據(jù)需要補(bǔ)充注 射，例如在拔牙或外科手術(shù)之前。FIX作為無(wú)活性的酶原而循環(huán)，并且僅在要阻止出血時(shí)才 轉(zhuǎn)化成活性形式的因子IX(a)。因此，基于例如每周一次注射實(shí)現(xiàn)預(yù)防性FIX治療的一種方 式是增加 FIX在患者血流中的循環(huán)時(shí)間。W運(yùn)種方式，將總是存在一定水平的有待激活的酶 原FIX, W確保在患者中任何時(shí)間都有正常的血液凝固條件。
[0067]半衰期延長(zhǎng)部分，或者被稱(chēng)為側(cè)鏈或側(cè)基，可W包括生物相容的脂肪酸及其衍生 物W及親水聚合物如徑乙基淀粉、PEG、透明質(zhì)酸和皿P聚合物。多年來(lái)，聚乙二醇化已成為 用于產(chǎn)生長(zhǎng)效藥物的優(yōu)選半衰期延長(zhǎng)技術(shù)之一，并且若干種PEG-蛋白質(zhì)綴合物現(xiàn)已上市銷(xiāo) 售。PEG聚合物具有降低與其結(jié)合的蛋白質(zhì)藥物的活性的傾向。運(yùn)通常導(dǎo)致在溶液中較低的 藥物-受體親和力或較低的與相應(yīng)藥物結(jié)合配偶體的結(jié)合親和力。在大多數(shù)情況下，活性的 降低與附接至蛋白質(zhì)藥物的陽(yáng)G大小或陽(yáng)G基團(tuán)的數(shù)目相關(guān)。因此，大陽(yáng)G基團(tuán)的附接導(dǎo)致比 小PEG基團(tuán)的附接高得多的活性損失。
[006引除了PEG大小和PEG數(shù)目的活性調(diào)節(jié)作用之外，最近已證明了陽(yáng)G強(qiáng)烈干擾在止血 中使用的標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)。例如，在一期凝固試驗(yàn)中測(cè)得的糖基聚乙二醇化FVIII的比活性根據(jù)所 用的aPTT試劑而不同（Stennicke，Blood 2013; 121(11) :2108-16)。
[0069] aPTT-期FIX凝固試驗(yàn)的應(yīng)用是用于在治療起始過(guò)程中對(duì)劑量和給藥方案的單獨(dú) 優(yōu)化和用于常規(guī)監(jiān)測(cè)FIX預(yù)防的標(biāo)準(zhǔn)程序。通常，aPTT試驗(yàn)在中屯、實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，在該實(shí)驗(yàn)室 中通過(guò)添加 aPTT試劑和重新巧化啟動(dòng)從患者獲得的血液的凝固，之后在血凝分析儀上測(cè)量 到纖維蛋白凝塊形成的時(shí)間。有很多該試驗(yàn)的商購(gòu)可得形式。
[0070] 干擾PEG性能的試驗(yàn)可能在臨床前開(kāi)發(fā)中具有顯著影響，并且在臨床應(yīng)用中尤為 如此，其中需要在多組分一期凝固試驗(yàn)中精確測(cè)量患者的凝血因子。
[0071] 肝素原
[0072] 肝素原化EP)是包含(-GlcUA-l，4-GlcNAc-l，4-)重復(fù)單元的天然糖聚合物。它屬 于糖胺聚糖多糖家族，并且在生理pH下為帶負(fù)電荷的聚合物。HEP可見(jiàn)于某些細(xì)菌的芙膜 中，但它還見(jiàn)于更高等的脊椎動(dòng)物中，在脊椎動(dòng)物中它充當(dāng)天然聚合物肝素和硫酸乙酷肝 素的前體。HEP可被溶酶體酶如N-乙酷基-a-D-氨基葡糖巧酶(NA化U)和β-葡萄糖醒酸酶 (GUSB)降解。一些實(shí)施方案提供了式(-GlcUA-f31，4-GlcNAc-al，4-)n的肝素原聚合物。皿Ρ 聚合物的大小可由重復(fù)單元的數(shù)目η來(lái)定義。所述重復(fù)單元的數(shù)目η可W是例如2至約5， 000。重復(fù)單元的數(shù)目可W是例如50至2，000個(gè)單元，諸如105個(gè)單元、100至1，000個(gè)單元、5 至450個(gè)或200至700個(gè)單元。重復(fù)單元的數(shù)目可W是200至250個(gè)單元、500至550個(gè)單元或 350至400個(gè)單元。運(yùn)些范圍的任何下限均可W與運(yùn)些范圍的任何較高的上限組合，W形成 肥Ρ聚合物中單元數(shù)目的合適范圍。
[0073] 肥Ρ聚合物的大小還可W由其分子量來(lái)定義。該分子量可W是一群肥Ρ聚合物分子 的平均分子量，如重均分子量。
[0074] 在實(shí)踐中，如本文就皿Ρ聚合物大小所述的分子量值可能并非恰好是所列出的大 小。由于在皿Ρ聚合物生產(chǎn)過(guò)程中批次間的差異，因此一些變化是可W預(yù)期的。因此應(yīng)當(dāng)理 解，為了包含批次間的差異，可W預(yù)期在目標(biāo)肥Ρ聚合物大小左右約+/-1〇%、9%、8%、7%、 6%、5%、4%、3%、2%或1 %的變化。例如，40kDa的肥Ρ聚合物大小表示40kDa+/-10%，例如 4〇kDa實(shí)際上可W例如意指38.8kDa或41.5kDa，均落在40kDa的+/-10%范圍36至44kDa之 內(nèi)。
[00巧]在一些實(shí)施方案中，該皿P聚合物具有500Da至1，000kDa的分子量。在其他實(shí)施方 案中，該聚合物的分子量為500Da至650kDa、5至750kDa、10至500kDa、15至550kDa、25至 250kDa或50至175kDa。
[0076]在一些實(shí)施方案中，選擇在前述范圍內(nèi)的特定水平的分子量，W便實(shí)現(xiàn)在FIX多膚 的活性與綴合物的半衰期之間的適當(dāng)?shù)钠胶?。例如，該皿P聚合物的分子量可W在選自5至 15403、15至251^)3、25至351^)3、35至451^)3、45至551^)3、55至651^)3、65至751^)3、75至851^)曰、 85至95kDa、95至105kDa、105至115kDa、115至125kDa、125至135kDa、135至145kDa、145至 15化化、155至16化化或165至17化化的范圍內(nèi)。在其他實(shí)施方案中，分子量可W是500Da至 21kDa，諸如IkDa至15kDa，諸如5至15kDa，諸如8至17kDa，諸如10至14kDa，諸如約12kDa。分 子量可W是20至35kDa，諸如22至32kDa，諸如25至30kDa，諸如約27kDa。分子量可W是35至 65kDa，諸如40至60kDa，諸如47至57kDa，諸如50至55kDa，諸如約52kDa。分子量可W是50至 75kDa，諸如60至70kDa，諸如63至67kDa，諸如約65kDa。分子量可W是75至125kDa，諸如90至 120kDa，諸如95至llSkDa，諸如100至11240日，諸女日106至llOkDa，諸如約lOSkDa。分子量可W 是125至17化Da,諸如140至165kDa，諸如150至16化Da,諸如155至leOkDa，諸如約157kDa。分 子量可W是5至lOOkDa，諸如13至60kDaW及諸如27至40kDa。
[0077] 在一些實(shí)施方案中，與FIX多膚綴合的肥P聚合物具有在選自13至65kDa、13至 60kDa、13至55kDa、13至50kDa、13至49kDa、13至48kDa、13至47kDa、13至46kDa、13至45kDa、 13至44kDa、13至43kDa、13至42kDa、13至41kDa、13至40kDa、13至39kDa、13至38kDa、13至 37kDa、13至36kDa、13至35kDa、13至：MkDa、13至33kDa、13至32kDa、13至31kDa、13至30kDa、 13至29kDa、13至28kDa、13至27kDa、13至26kDa、13至25kDa、13至21kDa、25至55kDa、25至 50kDa、25至45kDa、27至40kDa、27至41kDa、27至42kDa、27至43kDa、27至43kDa、27至44kDa、 27 至 45kDa、27 至 60kDa、30 至 45kDa、36 至 44kDaW 及 38 至 42kDa 的范圍內(nèi)的大小。
[007引運(yùn)些分子量范圍的任何下限可W與運(yùn)些范圍的任何較高的上限組合，W形成如本 文所述的HEP聚合物的分子量的合適范圍。
[0079] 關(guān)于如本文所述的FIX多膚綴合物，在側(cè)鏈中使用肥P提供了一種延長(zhǎng)體內(nèi)循環(huán)半 衰期的非常靈活的方式，因?yàn)榉蔖大小的范圍導(dǎo)致了顯著改善的半衰期。
[0080] 肥P聚合物在高質(zhì)量濃度下變?yōu)楦叨日吵淼摹?br>[0081] 皿P聚合物可具有窄的大小分布（即單分散)或?qū)挼拇笮》植迹炊喾稚ⅲ？筛鶕?jù) 式Mw/Mn W數(shù)字表示多分散性的水平，其中Mw =重均分子量且Μη =數(shù)均分子量。對(duì)于理想的 單分散聚合物，使用該等式獲得的多分散性值為1。優(yōu)選地，皿Ρ聚合物是單分散的。因此該 聚合物可具有約為1的多分散性，多分散性可W小于1.25,優(yōu)選小于1.20,優(yōu)選小于1.15,優(yōu) 選小于1.10,優(yōu)選小于1.09,優(yōu)選小于1.08,優(yōu)選小于1.07,優(yōu)選小于1.06,優(yōu)選小于1.05。 可通過(guò)與可W在瓊脂糖凝膠上運(yùn)行的單分散大小標(biāo)準(zhǔn)品化A L〇-Ladde;r，Hyalose化C)進(jìn) 行比較來(lái)測(cè)量HEP的分子量大小分布。
[0082] 或者，可通過(guò)高效大小排阻色譜法-多角度激光散射(SEC-MA化S)確定皿P聚合物 的大小分布?？蒞使用運(yùn)樣的方法來(lái)評(píng)估肥P聚合物的分子量和多分散性?？蒞在酶促生產(chǎn) 方法中調(diào)節(jié)聚合物大小。通過(guò)控制肥P受體鏈與UDP糖的摩爾比，可W選擇所需的最終肥P聚 合物大小。
[0083] 可通過(guò)同步的酶聚合反應(yīng)制備肥P聚合物化S20100036001)。該方法使用來(lái)自多殺 己斯德氏菌(Pasturella multocida)的乙酷肝素合成酶I(PmHSl)，該酶可W在大腸桿菌 化.coin中表達(dá)為麥芽糖結(jié)合蛋白融合構(gòu)建體。當(dāng)將純化的MBP斗mHSl添加至糖核巧酸 (G1 cNAc-UDP和G1 cUA-UDP)的等摩爾混合物中時(shí)，該MBP-PmHS 1能夠在同步的、化學(xué)計(jì)量控 制的反應(yīng)中產(chǎn)生單分散聚合物?？墒褂忙且l(fā)劑(GlcUA-GlcNAc-GlcUA)引發(fā)反應(yīng)，聚合 物長(zhǎng)度取決于引物:糖核巧酸之比。通常，聚合反應(yīng)運(yùn)行至消耗掉約90 %的糖核巧酸。通過(guò) 陰離子交換色譜法將聚合物從反應(yīng)混合物中分離出來(lái)，隨后冷凍干燥為穩(wěn)定的粉末。
[0084] 制備肥P-FIX綴合物的方法
[0085] 在一些實(shí)施方案中，如本文所述的FIX多膚與如本文所述的皿P聚合物綴合。如本 文所述的任何FIX多膚可W與如本文所述的任何肥P聚合物組合。
[0086] 用于將半衰期延長(zhǎng)部分如碳水化合物聚合物連接至糖蛋白的常用方法包括朽、腺 或酷阱鍵的形成。W02006094810描述了用于將徑乙基淀粉聚合物附接至糖蛋白如紅細(xì)胞生 成素的方法，該方法避免了與使用活化醋化學(xué)法相關(guān)的問(wèn)題。在運(yùn)些方法中，在碳水化合物 部分上用高艦酸鹽單獨(dú)地氧化徑乙基淀粉和紅細(xì)胞生成素，并使用雙徑胺連接劑將反應(yīng)性 幾基連接在一起。該方法將產(chǎn)生經(jīng)由朽鍵與紅細(xì)胞生成素連接的徑乙基淀粉。
[0087] 對(duì)于將碳水化合物聚合物附接至GSC，可W想到類(lèi)似的基于目虧的連接方法（參見(jiàn) W02011101267)，然而，由于已知運(yùn)樣的目虧鍵W順式和反式異構(gòu)體兩種形式存在，因此聚合 物與蛋白質(zhì)之間的連接將含有順式和反式異構(gòu)體組合。運(yùn)樣的異構(gòu)體混合物在用于長(zhǎng)期重 復(fù)施用的蛋白質(zhì)藥物中通常是不希望的，因?yàn)檫B接體不均一性可能導(dǎo)致生成抗體的風(fēng)險(xiǎn)。
[0088] W上提到的方法具有進(jìn)一步的缺點(diǎn)。在激活糖蛋白所需的氧化過(guò)程中，一部分碳 水化合物殘基被化學(xué)裂解，因此碳水化合物將不會(huì)W完整形式存在于最終的綴合物中。此 夕h該氧化過(guò)程將產(chǎn)生產(chǎn)物異質(zhì)性，因?yàn)樵诖蠖鄶?shù)情況下氧化劑即高艦酸鹽對(duì)于氧化哪一 個(gè)聚糖殘基是非特異性的。在最終的藥物綴合物中產(chǎn)物異質(zhì)性和不完整聚糖殘基的存在均 可能造成免疫原性風(fēng)險(xiǎn)。
[0089] 用于將碳水化合物聚合物連接至糖蛋白的替代方案包括使用馬來(lái)酷亞胺化學(xué)法 (W02006094810)。例如，可W向碳水化合物聚合物提供馬來(lái)酷亞胺基，該基團(tuán)可W選擇性地 與祀蛋白上的琉基反應(yīng)。該連接隨后將含有環(huán)狀班巧酷亞胺基團(tuán)。
[0090] 可W將碳水化合物聚合物如肥P經(jīng)由馬來(lái)酷亞胺基連接至硫修飾的GSC分子，并借 助于唾液酸轉(zhuǎn)移酶將該試劑轉(zhuǎn)移至糖蛋白上的完整糖基基團(tuán)，從而產(chǎn)生含有環(huán)狀班巧酷亞 胺基團(tuán)的連接。然而，當(dāng)綴合物在水溶液中儲(chǔ)存延長(zhǎng)的時(shí)間段時(shí)，基于班巧酷亞胺的連接可 能經(jīng)歷水解開(kāi)環(huán)（Bioconjugation Techniques，G.T.Hermanson，Academic Press，第3版， 2013p. 309)，并且盡管該連接可能仍然完整，但開(kāi)環(huán)反應(yīng)將在最終的綴合物中增加區(qū)域異 構(gòu)體(regi0 isomerS)和立體異構(gòu)體形式的不期望的異質(zhì)性。
[0091] 由上文可知，優(yōu)選將半衰期延長(zhǎng)部分W運(yùn)樣的方式連接至糖蛋白：1) W完整形式 保留糖蛋白的聚糖殘基，和2)在完整糖基殘基與半衰期延長(zhǎng)部分之間的連接體部分中不存 在異質(zhì)性。
[0092] 本領(lǐng)域中需要將半衰期延長(zhǎng)部分如肥P與蛋白質(zhì)聚糖如FIX多膚聚糖綴合的方法， 其中連接運(yùn)些化合物W便獲得穩(wěn)定且無(wú)異構(gòu)體的綴合物。
[0093] 在一些實(shí)施方案中，提供穩(wěn)定且無(wú)異構(gòu)體的連接體W供在肥P與FIX的基于唾液酸 的綴合中使用，其中可將HEP聚合物附接至唾液酸的適合于衍生化的位置處。合適的位點(diǎn)是 技術(shù)人員已知的，或者可W從W003031464(其通過(guò)引用W其全文并入于此）中推斷出，其中 W多種方式將PEG聚合物附接至唾液酸胞巧一憐酸。
[0094] 在一些實(shí)施方案中，唾液酸化喃糖環(huán)的C4和巧位置W及側(cè)鏈的C7、C8和C9位置可 W充當(dāng)衍生化位點(diǎn)。衍生化優(yōu)選設(shè)及唾液酸的現(xiàn)有雜原子如徑基或胺基團(tuán)，但用于在唾液 酸上提供合適的附接點(diǎn)的官能團(tuán)轉(zhuǎn)化也是可能的。
[00M]在一些實(shí)施方案中，可通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法將唾液酸N-乙酷基神經(jīng)氨酸的9-徑 基轉(zhuǎn)化為氨基巧ur J Biochem 168,594-602(1987))。如下所示的所得9-脫氧-氨基N-乙酷 基神經(jīng)氨酸胞巧一憐酸是可W充當(dāng)GSC的替代物的激活的唾液酸衍生物。
[0096]
[0097] 在一些實(shí)施方案中，還可W按照相同的方案將不含胺的唾液酸如2-酬基-3-脫氧- 壬酬糖酸（2-ket〇-3-deoxy-nonic acid)(也稱(chēng)為邸N)轉(zhuǎn)化為9-氨基衍生化的唾液酸。
[009引
[0099] 類(lèi)似的方案可用于屬于唾液酸家族的更短的C8-糖類(lèi)似物。因此，唾液酸的更短形 式如2-酬基-3-脫氧辛酬糖酸（2-ket〇-3-deoxyoctonate)(也稱(chēng)為邸0)可轉(zhuǎn)化為8-脫氧-8- 氨基-2-酬基-3-脫氧辛酬糖酸胞巧一憐酸，并用作不缺乏C9碳原子的唾液酸的替代物。
[0100] 在一些實(shí)施方案中，在本發(fā)明中可W使用神經(jīng)氨酸胞巧一憐酸?？扇鏓ur J化g Chem. 2000,1467-1482中所述制備該材料。 h
[0101]
[0102] 在一些實(shí)施方案中，提供了在皿P與FIX的基于甘氨酷基唾液酸胞巧一憐酸(GSC) 的綴合中使用的穩(wěn)定且無(wú)異構(gòu)體的連接體。本發(fā)明中使用的GSC起始材料可W化學(xué)合成 (Dufner，G.Eur.J 0巧 Chem 2000,1467-1482)，或者可W通過(guò)如W02007056191 中所述的化 學(xué)酶途徑獲得。W下示出了 GSC結(jié)構(gòu)：
[0103]
[0104] 在一些實(shí)施方案中，本文描述的綴合物包含連接體，該連接體包含W下結(jié)構(gòu)：
[0105]
[0106] 該連接體在下文中還稱(chēng)為亞連接體或亞連接，其W下列方式之一將皿P-胺與GSC 連接：
[0107]
[0108] 因此，突出顯示的4-甲基苯甲酯基亞連接體構(gòu)成了連接半衰期延長(zhǎng)部分與祀蛋白 的完整連接結(jié)構(gòu)的一部分。該亞連接體與替代物如基于班巧酷亞胺的連接體（由馬來(lái)酷亞 胺與琉基的反應(yīng)制備）相比本身是穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，因?yàn)楫?dāng)綴合物在水溶液中儲(chǔ)存延長(zhǎng)的時(shí)間 段時(shí)，后一種類(lèi)型的環(huán)狀連接具有經(jīng)歷水解開(kāi)環(huán)的傾向（Bioconjugation Techniques， G. Τ. Hermanson，Academic Press，第3版2013p. 309)。即使在運(yùn)種情況下連接(例如在肥P與 糖蛋白上的唾液酸之間）仍可能保持完整，但開(kāi)環(huán)反應(yīng)將向最終的綴合物組合物中增加區(qū) 域異構(gòu)體和立體異構(gòu)體形式的異質(zhì)性。
[0109] 因此，與根據(jù)本發(fā)明的綴合物相關(guān)的一個(gè)優(yōu)勢(shì)是得到了同質(zhì)組合物，即由連接體 結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性引起的異構(gòu)體形成的趨勢(shì)顯著降低。另一個(gè)優(yōu)勢(shì)是根據(jù)本發(fā)明的連接體和綴 合物可W在簡(jiǎn)單的過(guò)程、優(yōu)選一步過(guò)程中產(chǎn)生。
[0110] 異構(gòu)體是不希望的，因?yàn)檫\(yùn)些異構(gòu)體可能導(dǎo)致異質(zhì)產(chǎn)物并增加人體中不需要的免 疫應(yīng)答的風(fēng)險(xiǎn)。
[0川]如在本文描述的方法中所用的，在肥P與GSC之間使用的4-甲基苯甲酯基亞連接不 能形成立體異構(gòu)體或區(qū)域異構(gòu)體。在一個(gè)非限制性實(shí)施方案中，圖5顯示了使用本發(fā)明的4- 甲基苯甲酯基亞連接綴合到因子IX上的雙觸角N-聚糖(位置N157或N167)上的肥P。
[0112] US20100036001中描述了功能性皿P聚合物的制備方法，其列出了例如醒、胺和馬 來(lái)酷亞胺官能化的皿P試劑。US20100036001通過(guò)引用W其全文并入于此，如同在本文中充 分闡述。使用類(lèi)似的化學(xué)法可得到一系列其他功能修飾的皿P衍生物。根據(jù)US20100036001 中描述的方法，最初產(chǎn)生了在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中使用的肥P聚合物，其在還原末端處 具有伯胺柄。例如，可W如Sism巧-Ragatz等人，2007 J Biol Chem和US8088604所述制備具 有伯胺柄的肥P聚合物化EP-N也）。簡(jiǎn)而言之，使用大腸桿菌麥芽糖結(jié)合蛋白與Pm服1的融合 體作為催化劑，W采用UDP-GlcNAc和UDP-GlcUA前體將在還原末端處具有游離胺的肝素原 寡糖受體延長(zhǎng)為更長(zhǎng)的鏈。該受體使反應(yīng)同步發(fā)生，因此所有鏈均具有相同的長(zhǎng)度(準(zhǔn)單分 散大小分布），并且它還賦予糖鏈游離胺基團(tuán)w進(jìn)行隨后的修飾或偶合反應(yīng)。
[0113] 可通過(guò)與N-班巧酷亞胺基4-甲酯基苯甲酸醋的反應(yīng)將根據(jù)US20100036001制備的 胺官能化的皿P聚合物（即具有胺柄的皿P)轉(zhuǎn)化為皿P-苯甲醒，隨后通過(guò)還原胺化反應(yīng)與 GSC的甘氨酷基氨基基團(tuán)偶合。隨后可使用唾液酸轉(zhuǎn)移酶將所得的肥P-GSC產(chǎn)物與糖蛋白酶 促綴合。
[0114] 例如，可根據(jù)W下方案通過(guò)與N-班巧酷亞胺基4-甲酯基苯甲酸醋反應(yīng)將皿P上的 所述胺柄轉(zhuǎn)化為苯甲醒官能團(tuán)：
[0115]
[0116] 在W上方案中肥P胺（υ到4-甲酯基苯甲酯胺化合物(2)的轉(zhuǎn)化可W通過(guò)與4-甲酯 基苯甲酸的酷基激活形式反應(yīng)來(lái)進(jìn)行。
[0117] 可W選擇N-徑基班巧酷亞胺基作為酷基激活基團(tuán)，但許多其他的酷基激活基團(tuán)是 技術(shù)人員已知的。非限制性實(shí)例包括由膚化學(xué)所知的1-徑基-7-氮雜苯并Ξ挫-醋、1-徑基- 苯并Ξ挫-醋、五氣苯基-醋。
[0118] 當(dāng)W干燥形式冷凍(-80°C)儲(chǔ)存時(shí)，經(jīng)苯甲醒官能團(tuán)修飾的肥Ρ試劑可W在延長(zhǎng)的 時(shí)間段內(nèi)保持穩(wěn)定。
[0119] 或者，可將苯甲醒部分附接至GSC化合物，從而產(chǎn)生適合與胺官能化的皿P部分綴 合的GSC-苯甲醒化合物。圖1中示出了該合成路線。
[0120] 例如，GSC可與N-班巧酷亞胺基4-甲酯基苯甲酸醋在中性抑條件下反應(yīng)，W得到含 有反應(yīng)性醒基團(tuán)的GSC化合物。隨后可使醒衍生化的GSC化合物(GSC-苯甲醒)與肥P-胺和還 原劑反應(yīng)，W形成肥P-GSC試劑。
[0121] W上提到的反應(yīng)可W顛倒，使得皿P-胺首先與N-班巧酷亞胺基4-甲酯基苯甲酸醋 反應(yīng)，W形成醒衍生化的皿P-聚合物，隨后該皿P-聚合物在還原劑的存在下直接與GSC反 應(yīng)。在實(shí)踐中，運(yùn)消除了GSC-C冊(cè)的冗長(zhǎng)的色譜處理。圖2中示出了該合成路線。
[0122] 因此，在一些實(shí)施方案中，肥P-苯甲醒通過(guò)還原胺化與GSC偶合。
[0123] 還原胺化是如下進(jìn)行的兩步反應(yīng):首先，在醒組分與胺組分（在本實(shí)施方案中為 GSC的甘氨酷基氨基基團(tuán)）之間形成亞胺(也稱(chēng)為希夫堿）。隨后在第二步中將該亞胺還原成 胺。選擇還原劑使得它選擇性地將形成的亞胺還原成胺衍生物。
[0124] 技術(shù)人員可利用多種合適的還原劑。非限制性實(shí)例包括氯基棚氨化鋼(化B曲CN)、 棚氨化鋼(NaBH4)、化晚棚燒復(fù)合物(B出:Py)、二甲基硫酸棚燒復(fù)合物(MesS: B出)和甲基化晚 棚燒復(fù)合物。
[0125] 盡管到碳水化合物的還原端(例如皿P聚合物的還原末端）的還原胺化是可能的， 但它通常被描述為緩慢且低效的反應(yīng)(JC. Gi Idersleeve，Biocon jug Chem. 2008年7月；19 (7) :1485-1490)。諸如Amadori反應(yīng)(其中最初形成的亞胺重排為酬胺）的副反應(yīng)也可能發(fā) 生，并將導(dǎo)致如先前所述在本情況下不期望的異質(zhì)性。
[0126] 芳香醒如苯甲醒衍生物不能形成運(yùn)樣的重排反應(yīng)，因?yàn)閬啺窡o(wú)法締醇化并且也缺 乏通常在碳水化合物衍生的亞胺中發(fā)現(xiàn)的所需的相鄰徑基。因此，芳香醒如苯甲醒衍生物 在用于生成無(wú)異構(gòu)體的肥P-GS村式劑的還原胺化反應(yīng)中是特別有用的。
[0127] 任選地使用過(guò)量的GSC和還原劑，W推動(dòng)還原胺化化學(xué)反應(yīng)快速地完成。當(dāng)反應(yīng)完 成時(shí)，過(guò)量(未反應(yīng))的GS村式劑和其他小分子組分如過(guò)量的還原劑隨后可通過(guò)透析、正切流 動(dòng)過(guò)濾或大小排阻色譜法來(lái)去除。
[01%]唾液酸轉(zhuǎn)移酶的天然底物Sia-CMPW及GSC的衍生物均為帶電荷且高度親水的多 功能分子。此外，它們?cè)谘娱L(zhǎng)的時(shí)間段內(nèi)在溶液中是不穩(wěn)定的，尤其在抑低于6.0時(shí)。在運(yùn)樣 的低pH下，由于酸催化的憐酸二醋水解而失去底物轉(zhuǎn)移所必需的CMP激活基團(tuán)（Yasuhiro Kajihara等人，化em Eur J 2011，17,7645-7655)。因此，65巧日51曰-〔1?衍生物的選擇性修 飾和分離需要小屯、控制抑，W及快速且有效的分離方法，W避免CMP水解。
[0129] 在一些實(shí)施方案中，使用還原胺化化學(xué)法將大的半衰期延長(zhǎng)部分與GSC綴合。已發(fā) 現(xiàn)芳醒如苯甲醒修飾的皿P聚合物對(duì)于運(yùn)種類(lèi)型的修飾是最優(yōu)的，因?yàn)樗鼈兛蒞在還原胺 化條件下與GSC高效地反應(yīng)。
[0130] 由于GSC在酸性介質(zhì)中可能經(jīng)歷水解，因此在與肥P-苯甲醒偶合的過(guò)程中維持接 近中性或微堿性環(huán)境至關(guān)重要。皿P聚合物和GSC均是高度水溶性的，因此優(yōu)選水性緩沖液 系統(tǒng)用于使pH維持在接近中性水平。可W使用多種有機(jī)和無(wú)機(jī)緩沖液;然而，緩沖液組分應(yīng) 當(dāng)優(yōu)選在還原胺化條件下不具有反應(yīng)性。運(yùn)排除了例如含有伯氨基和一一在較小程度 上一一仲氨基的有機(jī)緩沖液系統(tǒng)。由本說(shuō)明書(shū)可知，技術(shù)人員將會(huì)了解哪些緩沖液合適而 哪些不合適。W下表1顯示了合適的緩沖液的一些實(shí)例：
[0131] 表1-緩沖液
[0132]
[0133] 通過(guò)應(yīng)用該方法，具有無(wú)異構(gòu)體的穩(wěn)定連接的經(jīng)半衰期延長(zhǎng)部分如皿P修飾的GSC 試劑可W得到高效制備，并在使CMP激活基團(tuán)水解的可能性最小化的簡(jiǎn)單過(guò)程中進(jìn)行分離。
[0134] 通過(guò)使所述化合物彼此反應(yīng)，可W產(chǎn)生包含4-甲基苯甲酯基亞連接體部分的肥P- GSC綴合物。
[0135] GSC還可W與硫代下內(nèi)醋反應(yīng)，從而產(chǎn)生琉基修飾的GSC分子(GSC-SH)。運(yùn)樣的試 劑可W與馬來(lái)酷亞胺官能化的皿P聚合物反應(yīng)W形成皿P-GS村式劑。圖3中示出了該合成路 線。所得產(chǎn)物具有包含班巧酷亞胺的連接結(jié)構(gòu)。
[0136]
[0137] 然而，基于班巧酷亞胺的（亞)連接可能經(jīng)歷水解開(kāi)環(huán)，尤其當(dāng)修飾的GS村式劑在水 溶液中儲(chǔ)存延長(zhǎng)的時(shí)間段時(shí)，并且盡管該連接可能仍然完整，但開(kāi)環(huán)反應(yīng)將增加區(qū)域異構(gòu) 體和立體異構(gòu)體形式的不期望的異質(zhì)性。
[0138] 糖綴合方法
[0139] 可經(jīng)由多膚骨架中的殘基上存在的聚糖進(jìn)行皿P-GSC綴合物與多膚的綴合。運(yùn)種 形式的綴合還被稱(chēng)為糖綴合。
[0140] 與基于半脫氨酸烷基化、賴(lài)氨酸酷基化和設(shè)及蛋白質(zhì)骨架中氨基酸的類(lèi)似綴合的 綴合方法相反，經(jīng)由聚糖的綴合是一種有吸引力的方法，它將較大結(jié)構(gòu)如皿P聚合物附接至 生物活性蛋白質(zhì)上，而對(duì)生物活性的干擾較小。運(yùn)是因?yàn)楦叨扔H水的聚糖通常傾向于遠(yuǎn)離 蛋白質(zhì)表面并在溶液中向外定向，使對(duì)于蛋白質(zhì)活性至關(guān)重要的結(jié)合表面處于游離狀態(tài)。
[0141] 所述聚糖可W是天然存在的，或者可使用本領(lǐng)域公知的方法經(jīng)由例如N-連接的聚 糖的插入而插入。
[0142] 肥P聚合物的糖綴合方法包括基于半乳糖氧化酶的綴合(W02005014035)和基于高 艦酸鹽的綴合(W02008025856)。多年來(lái)已經(jīng)證明基于唾液酸轉(zhuǎn)移酶的方法對(duì)于修飾凝血因 子如FIX上的N-聚糖或0-聚糖是溫和且高度選擇性的。
[0143] GSC是通過(guò)使用唾液酸轉(zhuǎn)移酶可轉(zhuǎn)移至糖蛋白的唾液酸衍生物?？蒞在甘氨酷基 氨基基團(tuán)上用諸如PEG或皿P的取代基選擇性地修飾GSC，并仍然通過(guò)使用唾液酸轉(zhuǎn)移酶將 65(：酶促轉(zhuǎn)移至糖蛋白?？蒦通過(guò)酶法大規(guī)模地高效制備65(：(￥02007056191)。
[0144] 在一些實(shí)施方案中，通過(guò)唾液酸酶處理去除FIX聚糖上的末端唾液酸，W得到去唾 液酸FIX(asialoFIX)。去唾液酸FIX和經(jīng)肥P修飾的GSC將一起充當(dāng)唾液酸轉(zhuǎn)移酶的底物。唾 液酸轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)的產(chǎn)物是具有經(jīng)由聚糖上的完整糖基連接基團(tuán)連接的皿P的皿P-FIX綴合 物。
[0145] 唾液酸轉(zhuǎn)移酶
[0146] 唾液酸轉(zhuǎn)移酶是一類(lèi)糖基轉(zhuǎn)移酶，它將唾液酸從天然激活的唾液酸(Sia) -CMP (胞 巧一憐酸）化合物轉(zhuǎn)移至例如蛋白質(zhì)上的半乳糖基部分。許多唾液酸轉(zhuǎn)移酶（ST3GalIII、 ST3GalI、ST6GalNAcI)能夠轉(zhuǎn)移已在巧乙酷氨基基團(tuán)上尤其經(jīng)大基團(tuán)如40kDa陽(yáng)G修飾的 唾液酸-CMP(Sia-CMP)衍生物(W003031464)dW02006094810中公開(kāi)了本發(fā)明可W使用的相 關(guān)唾液酸轉(zhuǎn)移酶的廣泛但非限制性的列表，該文獻(xiàn)通過(guò)引用W其全文并入于此。
[0147] 在一些實(shí)施方案中，通過(guò)唾液酸酶處理去除糖蛋白上的末端唾液酸，W得到去唾 液酸糖蛋白。去唾液酸糖蛋白和經(jīng)半衰期延長(zhǎng)部分修飾的GSC將一起充當(dāng)唾液酸轉(zhuǎn)移酶的 底物。該反應(yīng)的產(chǎn)物是具有經(jīng)由完整糖基連接基團(tuán)-在該情況下為完整的唾液酸連接體基 團(tuán)-連接的半衰期延長(zhǎng)部分的糖蛋白綴合物。圖13中顯示了在唾液酸轉(zhuǎn)移酶的存在下去唾 液酸FIX糖蛋白與肥P-GSC反應(yīng)的反應(yīng)方案。
[0148] 肥P-FIX綴合物的性質(zhì)
[0149] 在一些實(shí)施方案中，本文描述的綴合物具有各種有利的生物學(xué)性質(zhì)。例如，與合適 的對(duì)照FIX分子相比，該綴合物可顯示W(wǎng)下(非限制性)優(yōu)勢(shì)中的一個(gè)或多個(gè)：
[0150] -改善的體內(nèi)循環(huán)半衰期
[0151] -改善的體內(nèi)平均停留時(shí)間
[0152] -改善的體內(nèi)生物可降解性
[0153] -在FIX敲除小鼠的尾靜脈橫切(TVT)模型中改善的出血時(shí)間和失血
[0154] -在各種基于aPTT的試驗(yàn)中改善的試驗(yàn)間變異性。
[0155] 所述綴合物可顯示如本文所述的FIX的任何生物活性的改善，并且運(yùn)可使用如本 文所述的任何試驗(yàn)或方法如W下關(guān)于FIX活性描述的方法來(lái)測(cè)量。
[0156] 當(dāng)本發(fā)明的綴合物與合適的對(duì)照FIX分子相比時(shí)可看出優(yōu)勢(shì)。對(duì)照分子可W是例 如未綴合的FIX多膚或綴合的FIX多膚。綴合的對(duì)照可W是與水溶性聚合物綴合的FIXa多膚 或與蛋白質(zhì)化學(xué)連接的FIXa多膚。綴合的FIX對(duì)照可W是一種FIX多膚，它與大小與感興趣 的綴合物中的皿P分子類(lèi)似的化學(xué)部分(是蛋白質(zhì)或水溶性聚合物)綴合。該水溶性聚合物 可W是例如PEG、支鏈PEG、葡聚糖、聚（1-徑甲基乙締徑甲基縮甲醒)或2-甲基丙締酷氧基- 2^-乙基Ξ甲基憐酸錠(MPC)。
[0157] 對(duì)照FIX分子中的FIX多膚優(yōu)選為存在于感興趣的綴合物中的相同F(xiàn)IX多膚。例如， 對(duì)照FIX分子可具有與感興趣的綴合物中的FIX多膚相同的氨基酸序列。對(duì)照FIX可具有與 感興趣的綴合物中的FIX多膚相同的糖基化模式。
[0158] 在一些實(shí)施方案中，與合適的對(duì)照相比，如本文所述的綴合物具有改善的循環(huán)半 衰期或平均停留時(shí)間。
[0159] 在一些實(shí)施方案中，如本文所述的綴合物具有與野生型蛋白質(zhì)分子相比改變的循 環(huán)半衰期，優(yōu)選延長(zhǎng)的循環(huán)半衰期。循環(huán)半衰期優(yōu)選延長(zhǎng)至少10%，優(yōu)選至少15%，優(yōu)選至 少20 %，優(yōu)選至少25%，優(yōu)選至少30%，優(yōu)選至少35%，優(yōu)選至少40%，優(yōu)選至少45%，優(yōu)選 至少50%，優(yōu)選至少55%，優(yōu)選至少60%，優(yōu)選至少65%，優(yōu)選至少70%，優(yōu)選至少75%，優(yōu) 選至少80%，優(yōu)選至少85 %，優(yōu)選至少90 %，優(yōu)選至少95 %，優(yōu)選至少100%，更優(yōu)選至少 125%，更優(yōu)選至少150%，更優(yōu)選至少175 %，更優(yōu)選至少200%，最優(yōu)選至少250 %或300 %。 甚至更優(yōu)選地，運(yùn)樣的分子具有延長(zhǎng)至少400 %、500 %、600 %或甚至700 %的循環(huán)半衰期。
[0160] 當(dāng)比較的活性是FIX的生物活性如凝固活性或蛋白水解時(shí)，對(duì)照可W是綴合至大 小與本發(fā)明肥P綴合物相當(dāng)?shù)乃苄跃酆衔锷系暮线m的FIX多膚。
[0161] 所述綴合物可能無(wú)法保持在沒(méi)有通過(guò)添加皿P而修飾的FIX中所見(jiàn)的生物活性水 平。優(yōu)選地，該綴合物保持未綴合的FIX的盡可能多的生物活性。例如，該綴合物可保持未綴 合的FIX對(duì)照的至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、 至少50%、至少60 %、至少70%、至少80 %或至少90 %的生物活性。如上所述，該對(duì)照可W是 具有與綴合物中的FIX多膚相同的氨基酸序列但缺乏皿P的FIX分子。然而，與合適的對(duì)照相 比，該綴合物可顯示生物活性的改善。本文的生物活性可W是如本文所述的FIX的任何生物 活性，如凝固活性或蛋白質(zhì)水解活性。
[0162] 與本文所述的合適對(duì)照相比改善的生物活性可W是任何可測(cè)量的或統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著 的生物活性增加。該生物活性可W是如本文所述的FIX的任何生物活性，如凝固活性、蛋白 水解活性、出血時(shí)間和失血的減少。例如，所述增加可W是與合適的對(duì)照的相同活性相比， 相關(guān)生物活性的至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30 %、至少35%、 至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少70%或更多的增加。
[0163] 如本文所述的綴合物的優(yōu)勢(shì)在于肥P聚合物是可酶促生物降解的。因此，該綴合物 優(yōu)選為可體內(nèi)酶促降解的。
[0164] 在一些實(shí)施方案中，當(dāng)使用不同的基于aPTT的凝固試驗(yàn)時(shí)，包含與FIX連接的皿P 聚合物的綴合物減少或不引起顯著的試驗(yàn)間變異性。
[01化]組合物
[0166] 在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了包含如本文所述的綴合物的組合物。在一些實(shí)施方 案中，該藥物組合物包含與藥學(xué)上可接受的載體配制在一起的一種或多種綴合物。
[0167] 如本文所用的，"藥學(xué)上可接受的載體"包括任何和全部生理學(xué)上相容的溶劑、分 散介質(zhì)、涂料、抗細(xì)菌劑和抗真菌劑、等滲和吸收延遲劑等。
[0168] 優(yōu)選的藥學(xué)上可接受的載體包括水性載體或稀釋劑?？稍诒景l(fā)明的藥物組合物中 使用的合適的水性載體的實(shí)例包括水、緩沖水和鹽水。其他載體的實(shí)例包括乙醇、多元醇 (諸如甘油、丙二醇、PEG等)及其合適的混合物，植物油如橄攬油，W及可注射的有機(jī)醋如油 酸乙醋。例如，通過(guò)使用涂層材料如卵憐脂，通過(guò)在分散體的情況下維持所需的顆粒大小， W及通過(guò)使用表面活性劑，可W維持適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性。在許多情況下，將優(yōu)選在組合物中包含 等滲劑，例如糖，多元醇如甘露醇、山梨糖醇，或氯化鋼。
[0169] 所述藥物組合物主要旨在用于預(yù)防性和/或治療性處理的腸胃外施用。優(yōu)選地，該 藥物組合物腸胃外即靜脈內(nèi)、皮下或肌內(nèi)施用，或者它可W通過(guò)連續(xù)或脈沖式輸注而施用。 用于腸胃外施用的組合物包含與藥學(xué)上可接受的載體、優(yōu)選水性載體組合(優(yōu)選溶解在該 載體中）的本發(fā)明FIX綴合物?？蒞使用多種水性載體，如水、緩沖水、ο . 9 %鹽水、ο . 4 %鹽 水、0.3%甘氨酸等。還可將如本文所述的FIX綴合物配制成脂質(zhì)體制劑，W遞送至或祀向至 損傷部位。例如，在US4837028、US4501728和US4975282中概括地描述了脂質(zhì)體制劑。所述組 合物可通過(guò)常規(guī)的公知滅菌技術(shù)進(jìn)行滅菌。所得的水溶液可進(jìn)行包裝W供使用或在無(wú)菌條 件下過(guò)濾并凍干，在施用前將凍干的制劑與無(wú)菌水溶液合并。所述組合物可含有接近生理 條件所需的藥學(xué)上可接受的輔助性物質(zhì)，如pH調(diào)節(jié)劑和緩沖劑、張度調(diào)節(jié)劑等，例如乙酸 鋼、乳酸鋼、氯化鋼、氯化鐘、氯化巧等。
[0170] 運(yùn)些制劑中的FIX綴合物的濃度可廣泛地變化，即，從小于約0.5重量％，通常等于 或至少約1重量％，至高達(dá)15重量％或20重量％，并且將根據(jù)選擇的特定施用方式主要按照 流體體積、粘度等來(lái)選擇。用于制備可腸胃外施用的組合物的實(shí)際方法對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人 員將是已知的或顯而易見(jiàn)的，并且在例如Remington' S曲armaceutical Sciences,第18 版.，Mack Publishing Company,Easton,PA(1990)中更加詳細(xì)地描述。
[0171] 可將所述組合物配制成溶液、微乳液、脂質(zhì)體或適合于高藥物濃度的其他有序結(jié) 構(gòu)。
[0172] 所述組合物應(yīng)當(dāng)是無(wú)菌的并且應(yīng)當(dāng)是達(dá)到易于注射程度的流體。該組合物在制備 和儲(chǔ)存條件下應(yīng)當(dāng)是穩(wěn)定的，并且可W對(duì)抗微生物如細(xì)菌和真菌的污染作用而保存。在用 于制備無(wú)菌可注射溶液的無(wú)菌粉末的情況下，優(yōu)選的制備方法是真空干燥和冷凍干燥(凍 干），該方法由其預(yù)先無(wú)菌過(guò)濾的溶液產(chǎn)生活性劑加上任何所需附加成分的粉末。
[0173] 可通過(guò)各種抗細(xì)菌劑和抗真菌劑例如對(duì)徑基苯甲酸醋、氯下醇、苯酪、抗壞血酸、 硫柳隸等實(shí)現(xiàn)對(duì)微生物作用的阻止。在許多情況下，在組合物中將優(yōu)選包含等滲劑，例如 糖、氯化鋼或多元醇如甘露醇和山梨糖醇。通過(guò)將延遲吸收的試劑例如單硬脂酸侶或明膠 包含在組合物中可導(dǎo)致可注射組合物的吸收延長(zhǎng)。
[0174] 可通過(guò)根據(jù)需要將所需量的如本文所述的綴合物并入具有一種或組合的W上所 列成分的適當(dāng)溶劑中，然后進(jìn)行過(guò)濾除菌，來(lái)制備無(wú)菌可注射溶液。通常，通過(guò)將該綴合物 并入含有堿性分散介質(zhì)和來(lái)自W上列舉的那些的所需其他成分的無(wú)菌載體中來(lái)制備分散 體。在用于制備無(wú)菌可注射溶液的無(wú)菌粉末的情況下，制備方法可包括真空干燥、噴霧干 燥、噴霧冷凍和冷凍干燥，該方法由其預(yù)先無(wú)菌過(guò)濾的溶液產(chǎn)生活性成分（即，皿P綴合物） 加上任何所需附加成分的粉末。
[0175] 組合物可W配制成劑量單位形式，W易于施用和保證劑量的一致性。如本文所用 的劑量單位形式是指適合作為待治療受試者的單一劑量的物理上離散的單元;每個(gè)單元含 有經(jīng)計(jì)算將產(chǎn)生所需治療效果的預(yù)定量的綴合物。請(qǐng)求保護(hù)和公開(kāi)的本發(fā)明的劑量單位形 式的規(guī)格取決于并直接依賴(lài)于(a)皿P綴合物的獨(dú)特特性和待實(shí)現(xiàn)的特定治療效果，W及 (b)在合成用于治療受試者的所選病況的運(yùn)種治療性化合物的技術(shù)中固有的限制。
[0176] 除了如本文所述的綴合物之外，如本文所述的藥物組合物還可W包含附加的活性 成分。例如，藥物組合物可包含附加的治療劑或預(yù)防劑。例如，當(dāng)藥物組合物意欲用于治療 出血性病癥時(shí)，其可額外地包含一種或多種旨在減輕該出血性病癥的癥狀的藥劑。例如，該 組合物可包含一種或多種附加的凝血因子。該組合物可包含一種或多種旨在改善患者的狀 況的其他組分。例如，當(dāng)該組合物意欲用于治療遭遇不希望的出血的患者如經(jīng)歷手術(shù)的患 者或遭受創(chuàng)傷的患者時(shí)，該組合物可包含一種或多種止痛劑、麻醉劑、免疫抑制劑或抗炎 劑。
[0177] 所述組合物可配制用于在特定方法中使用或通過(guò)特定途徑施用。本發(fā)明的綴合物 或組合物可腸胃外、腹膜內(nèi)、脊柱內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、陰道內(nèi)、皮下、鼻內(nèi)、經(jīng)直腸或腦內(nèi)施用。
[0178] 如本文所述的皿P-FIX多膚綴合物的一個(gè)有利特性是，該聚合物具有大約在13至 65kDa(尤其是 13 至 55kDa、13 至 50kDa、13 至 45kDa、13 至 40kDa、25 至 55kDa、25 至 50kDa、25 至 45kDa、30至45kDa或38至42kDa)范圍內(nèi)的聚合物大小，因?yàn)檫\(yùn)可W允許體內(nèi)有用的半衰期 或平均停留時(shí)間，同時(shí)還在液體溶液中具有合適的粘度。
[0179] 綴合物的用途
[0180] 如本文所述的綴合物可施用于有需要的個(gè)體，W便向該個(gè)體遞送FIX多膚。該個(gè)體 可W是需要FIX多膚的任何個(gè)體。
[0181] 根據(jù)本發(fā)明的FIX多膚綴合物可用來(lái)控制可能由例如凝血因子缺乏(例如B型血友 病)或凝血因子抑制劑引起的出血性病癥，或者可用來(lái)控制在具有功能正常的血凝級(jí)聯(lián)(沒(méi) 有凝血因子缺乏或針對(duì)任何凝血因子的抑制物）的患者中發(fā)生的過(guò)量出血。
[0182] 對(duì)于與有意干預(yù)有關(guān)的治療，通常在進(jìn)行該干預(yù)之前約24小時(shí)內(nèi)-或由于延長(zhǎng)的 半衰期而甚至更早一施用本發(fā)明的FIX多膚綴合物，并在此后持續(xù)多達(dá)7天或更長(zhǎng)時(shí)間?？?W通過(guò)如本文所述的多種途徑進(jìn)行施用。
[0183] 根據(jù)病況的嚴(yán)重程度，對(duì)70kg受試者遞送的FIX多膚的劑量可為每天約0.05mg至 500mg FIX多膚綴合物，優(yōu)選每天約Img至lOOmg，并且更優(yōu)選每天約5mg至約75mg，作為負(fù)荷 和維持劑量。對(duì)于本發(fā)明的特定綴合物，合適的劑量還可W根據(jù)該綴合物的特性進(jìn)行調(diào)整， 該特性包括其體內(nèi)半衰期或平均停留時(shí)間及其生物活性。例如，具有較長(zhǎng)半衰期的綴合物 可W按減少的劑量施用，和/或與野生型FIX相比具有降低的活性的組合物可W按增加的劑 量施用。
[0184] 可W施用含有本發(fā)明的FIX多膚綴合物的組合物W用于預(yù)防性和/或治療性處理。 在治療性應(yīng)用中，W足W治愈、減輕或部分抑制疾病如W上所述的任何出血性病癥及其并 發(fā)癥的量，向已經(jīng)患有該疾病的受試者施用組合物。足W實(shí)現(xiàn)該目的的量被定義為"治療有 效量"。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，對(duì)該目的而言有效的量將依賴(lài)于疾病或損傷的嚴(yán)重程 度，W及受試者的體重和一般狀態(tài)。然而，通常，對(duì)于70kg受試者，有效遞送量的范圍將為每 天約0.05mg至約500mg FIX多膚綴合物，其中每天遞送約l.Omg至約lOOmg綴合物的劑量更 常使用。
[0185] 在嚴(yán)重的疾病或損傷情況，即，危及生命或潛在危及生命的狀況中，通?？刹捎萌?本文所述的綴合物。在運(yùn)樣的情況下，考慮到外來(lái)物質(zhì)的最小化W及人FIX多膚變體的免疫 原性在人類(lèi)中的普遍缺乏，治療醫(yī)生可能認(rèn)為需要施用大大過(guò)量的運(yùn)些FIX綴合物組合物。 在預(yù)防性應(yīng)用中，向易患疾病狀態(tài)或損傷或處于其風(fēng)險(xiǎn)中的受試者施用含有本發(fā)明FIX綴 合物的組合物，W增強(qiáng)該受試者自身的凝血能力。運(yùn)樣的量被定義為"預(yù)防有效劑量"。在預(yù) 防性應(yīng)用中，遞送的FIX多膚綴合物的精確量仍然依賴(lài)于受試者的健康狀態(tài)和體重，但對(duì)于 70kg受試者，劑量通常在每天約0.05mg至約500mg的范圍內(nèi)，對(duì)于70kg受試者更常見(jiàn)的是每 天約1 .Omg至約lOOmg。
[0186] 可采用治療醫(yī)生選擇的劑量水平和方式進(jìn)行所述組合物的單次或多次施用。對(duì)于 需要每日維持水平的能走動(dòng)的受試者，可使用例如便攜式累系統(tǒng)通過(guò)連續(xù)輸注施用FIX多 膚綴合物。
[0187]可通過(guò)例如噴霧、灌注、雙球囊導(dǎo)管、支架、引入血管移植物或支架內(nèi)、用于涂覆球 囊導(dǎo)管的水凝膠或其他完善的方法進(jìn)行本發(fā)明的FIX綴合物的局部遞送，例如局部施用。在 任何情況下，所述藥物組合物應(yīng)當(dāng)提供足W有效治療受試者的量的FIX多膚綴合物。
[018引 定義
[0189] 除非另有定義，否則本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)通常具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域 的普通技術(shù)人員通常所理解的含義相同的含義。
[0190] 如本文所用的，術(shù)語(yǔ)"受試者"包括任何人類(lèi)患者或非人類(lèi)脊椎動(dòng)物。
[0191] 術(shù)語(yǔ)"治療"是指對(duì)任何有需要的人或其他脊椎動(dòng)物受試者的醫(yī)學(xué)療法。所述受試 者預(yù)期已經(jīng)經(jīng)歷由醫(yī)生或獸醫(yī)進(jìn)行的體檢，該醫(yī)生已經(jīng)給出將表明所述特定治療的使用有 益于所述人或其他脊椎動(dòng)物的健康的初步或明確診斷。根據(jù)受試者的健康現(xiàn)狀，所述治療 的時(shí)機(jī)和目的可W在個(gè)體之間不同。因此，所述治療可W是預(yù)防性、姑息性、對(duì)癥性和/或根 治性的。就本發(fā)明而言，預(yù)防性、姑息性、對(duì)癥性和/或根治性治療可W代表本發(fā)明的不同方 面。
[0192] 術(shù)語(yǔ)"凝血病"是指可能由正常凝血級(jí)聯(lián)的任何促凝組分的任何性質(zhì)或含量上的 缺陷或纖維蛋白溶解的任何上調(diào)引起的增強(qiáng)的出血傾向。運(yùn)樣的凝血病可能是先天性和/ 或獲得性和/或醫(yī)源性的，并且由本領(lǐng)域技術(shù)人員加 W確定。
[0193] 術(shù)語(yǔ)"聚糖"是指與單個(gè)氨基酸殘基共價(jià)連接的整個(gè)寡糖結(jié)構(gòu)。聚糖通常是N-連接 的或0-連接的，例如，聚糖連接至天冬酷胺殘基(N-連接的糖基化)或絲氨酸或蘇氨酸殘基 (0-連接的糖基化）dN-連接的寡糖鏈可W是多觸角的，例如，二三或四觸角的，并且大多數(shù) 通常含有Man3-GlcNAc-GlcNAc-的核屯、結(jié)構(gòu)。產(chǎn)生蛋白質(zhì)的細(xì)胞將N-聚糖和0-聚糖兩者附 接至蛋白質(zhì)上。當(dāng)初生蛋白質(zhì)從核糖體易位至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)時(shí)，細(xì)胞的N-糖基化機(jī)器識(shí)別氨基酸 鏈中的N-糖基化共有基序（N-X-S/T基序）并使其糖基化化iely等人（1976)Journalof Biological Chemistry 251，549〇-5495;Glabe等人（1980)Jou;rnal of Biological 化emis化y 255,9236-9242)。當(dāng)在人體中原位產(chǎn)生時(shí)，一些糖蛋白具有運(yùn)樣的聚糖結(jié)構(gòu)：其 具有末端或"加帽"唾液酸殘基，即，每個(gè)觸角的末端糖是經(jīng)由曰2->3或曰2->6連接與半乳 糖連接的N-乙酷基神經(jīng)氨酸。其他糖蛋白具有用其他糖殘基封端的聚糖。然而，當(dāng)在其他情 況下產(chǎn)生時(shí)，糖蛋白可含有在其一個(gè)或多個(gè)觸角上具有不同末端結(jié)構(gòu)的寡糖鏈，例如，含有 N-徑乙酷基神經(jīng)氨酸(Neu5Gc)殘基或含有末端N-乙酷基半乳糖胺(GalNAc)殘基來(lái)代替半 乳糖。
[0194] 本文在向患者施用膚藥物的上下文中所用的術(shù)語(yǔ)"半衰期"是指患者中藥物的血 漿濃度減少一半所需的時(shí)間。
[0195] 術(shù)語(yǔ)"半衰期延長(zhǎng)部分"是指當(dāng)與多種治療性蛋白質(zhì)/膚綴合時(shí)能夠延長(zhǎng)運(yùn)些蛋白 質(zhì)/膚的體內(nèi)循環(huán)半衰期的一個(gè)或多個(gè)化學(xué)基團(tuán)。半衰期延長(zhǎng)部分的實(shí)例包括:生物相容性 脂肪酸及其衍生物、徑基烷基淀粉(HAS)例如徑乙基淀粉化ES)、聚乙二醇(PEG)和它們的任 意組合。
[0196] 術(shù)語(yǔ)"因子IX活性的恢復(fù)率"是指在aPTT試驗(yàn)中測(cè)得的活性占使用顯色試驗(yàn)測(cè)得 的活性的百分比。
[0197] 術(shù)語(yǔ)"唾液酸"是指九個(gè)碳的簇基化糖的家族中的任何成員。唾液酸家族的最常見(jiàn) 成員是N-乙酷基神經(jīng)氨酸（2-酬基-5-乙酷氨基-3,5-二脫氧-D-甘油-D-半乳糖化喃壬-1- 酬糖酸(通?？s寫(xiě)為Neu5Ac、化uAc、NeuNAc或NANA))。該家族的第二個(gè)成員是N-徑乙酷基- 神經(jīng)氨酸(Neu5(ic或化uGc)，其中化uNAc的N-乙酷基被徑基化。第Ξ個(gè)唾液酸家族成員是2- 酬基-3-脫氧-壬酬糖酸（2-ket〇-3-deo巧-nonulosonic acid)化DN)(化dano等人（1986) J Biol Chem 261:11550-11557;Kanamori等人，J Biol Chem 265:21811-21819(1990))。還 包括9-取代的唾液酸，諸如9-0-C1-C6酷基-Neu5Ac，如9-0-乳酷基化u5Ac或9-0-乙酷基- Neu5Ac。在1992年10月1日公布的國(guó)際申請(qǐng)W092/16640中公開(kāi)了在唾液酸化程序中唾液酸 化合物的合成和使用。
[0198] 術(shù)語(yǔ)"唾液酸衍生物"是指經(jīng)一個(gè)或多個(gè)化學(xué)部分修飾的如上定義的唾液酸。例 如，修飾基團(tuán)可W是烷基如甲基、疊氮基-和氣基團(tuán)，或可W充當(dāng)用于附接其他化學(xué)部分的 柄的官能團(tuán)，如氨基或琉基。實(shí)例包括9-脫氧-9-氣-Neu5Ac和9-疊氮基-9-脫氧-Neu5Ac。該 術(shù)語(yǔ)還包括缺乏一個(gè)或多個(gè)官能團(tuán)如簇基或一個(gè)或多個(gè)徑基的唾液酸。該術(shù)語(yǔ)還包括其中 簇基被甲酯胺基團(tuán)或醋基團(tuán)替代的衍生物。該術(shù)語(yǔ)還指其中一個(gè)或多個(gè)徑基已被氧化為幾 基的唾液酸。此外，該術(shù)語(yǔ)還指在例如用高艦酸鹽氧化處理之后缺乏C9碳原子或C9-C8碳鏈 的唾液酸。
[0199] 甘氨酷基唾液酸是根據(jù)上述定義的唾液酸衍生物，其中化uNAc的N-乙酷基被甘氨 酷基(也稱(chēng)為氨基乙酷基)所替代。甘氨酷基唾液酸可W用W下結(jié)構(gòu)表示：
[0200]
[0201] 術(shù)語(yǔ)"CΜP激活的"唾液酸或唾液酸衍生物是指含有唾液酸部分和胞巧一憐酸 (CMP)的糖核巧酸。
[0202] 在本說(shuō)明書(shū)中，使用術(shù)語(yǔ)"甘氨酷基唾液酸胞巧一憐酸"描述GSC，并且該術(shù)語(yǔ)是相 同的CMP激活的甘氨酷基唾液酸的別名的同義詞。別名包括CMP-5 ' -甘氨酷基唾液酸、胞巧- 5/ -單憐酷-Ν-甘氨酷基神經(jīng)氨酸、胞巧-5/ -單憐酷-Ν-甘氨酷基唾液酸。
[0203] 術(shù)語(yǔ)"完整的糖基連接基團(tuán)"是指衍生自糖基部分的連接基團(tuán)，其中在多膚與皿Ρ 部分之間插入并與該多膚和皿Ρ部分共價(jià)連接的糖單體在綴合物形成過(guò)程中沒(méi)有被降解， 例如，沒(méi)有被例如偏高艦酸鋼氧化。通過(guò)添加糖基單元或從母體糖結(jié)構(gòu)中去除一個(gè)或多個(gè) 糖基單元，"完整的糖基連接基團(tuán)"可從天然存在的寡糖衍生。
[0204] 術(shù)語(yǔ)"去唾液酸糖蛋白"意在包括運(yùn)樣的糖蛋白：其中，例如通過(guò)唾液酸酶處理或 通過(guò)化學(xué)處理已去除一個(gè)或多個(gè)末端唾液酸殘基，從而使來(lái)自下"層"半乳糖或Ν-乙酷基半 乳糖胺的至少一個(gè)半乳糖或Ν-乙酷基半乳糖胺殘基暴露Γ暴露的半乳糖殘基"）。
[0205] 結(jié)構(gòu)式中的虛線表示打開(kāi)的價(jià)鍵(即，將該結(jié)構(gòu)與其他化學(xué)部分連接的鍵）。
[0206] 進(jìn)一步的實(shí)施方案
[0207] 在一個(gè)實(shí)施方案中，與肥Ρ綴合的FIX多膚是野生型FIX。
[0208] 在一個(gè)實(shí)施方案中，與肥P綴合的FIX多膚是野生型FlX(a)。
[0209] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，與皿P綴合的FIX多膚是與野生型FIX或FlX(a)具有>95% 的序列同一性的類(lèi)似物或變體。
[0210] 在一個(gè)實(shí)施方案中，該皿P-FIX多膚綴合物的FIX是突變的，使得它具有增強(qiáng)的蛋 白水解活性。
[0211] 在一個(gè)實(shí)施方案中，與FIX多膚綴合的肥P聚合物具有5至15kDa的分子量。
[0212] 在一個(gè)實(shí)施方案中，與FIX多膚綴合的肥P聚合物具有15至25kDa的分子量。
[0213] 在一個(gè)實(shí)施方案中，與FIX多膚綴合的肥P聚合物具有25至35kDa的分子量。
[0214] 在一個(gè)實(shí)施方案中，與FIX多膚綴合的肥P聚合物具有35至45kDa的分子量。
[0215] 在一個(gè)實(shí)施方案中，與FIX多膚綴合的肥P聚合物具有45至55kDa的分子量。
[0216] 在一個(gè)實(shí)施方案中，與FIX多膚綴合的肥P聚合物具有55至65kDa的分子量。
[0217] 在一個(gè)實(shí)施方案中，與FIX多膚綴合的肥P聚合物具有13至60kDa的分子量。
[0218] 在一個(gè)實(shí)施方案中，與FIX多膚綴合的肥P聚合物具有13至50kDa的分子量。
[0219] 在一個(gè)實(shí)施方案中，與FIX多膚綴合的肥P聚合物具有13至45kDa的分子量。
[0220] 在一個(gè)實(shí)施方案中，與FIX多膚綴合的肥P聚合物具有13至40kDa的分子量。
[0221] 在一個(gè)實(shí)施方案中，與FIX多膚綴合的肥P聚合物具有13至35kDa的分子量。
[0222] 在一個(gè)實(shí)施方案中，與FIX多膚綴合的肥P聚合物具有13至30kDa的分子量。
[0223] 在一個(gè)實(shí)施方案中，與FIX多膚綴合的肥P聚合物具有13至25kDa的分子量。
[0224] 在一個(gè)實(shí)施方案中，與FIX多膚綴合的肥P聚合物具有27至40kDa的分子量。
[0225] 在一個(gè)實(shí)施方案中，與FIX多膚綴合的肥P聚合物具有27至41kDa的分子量。
[0。6]在一個(gè)實(shí)施方案中，與FIX多膚綴合的肥P聚合物具有27至42kDa的分子量。
[0227]在一個(gè)實(shí)施方案中，與FIX多膚綴合的肥P聚合物具有27至43kDa的分子量。
[0。引在一個(gè)實(shí)施方案中，與FIX多膚綴合的肥P聚合物具有27至44kDa的分子量。
[0229] 在一個(gè)實(shí)施方案中，與FIX多膚綴合的肥P聚合物具有27至45kDa的分子量。
[0230] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述皿P聚合物具有約5、10、15、20、21、22、23、24、25、26、27、 28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、 53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、80、85、 90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、175、180、190 或 200kDa 的大小。
[0231] 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，與FIX多膚綴合的肥P聚合物具有40kDa+/-10 %的分子 量。
[0232] 在一個(gè)實(shí)施方案中，公開(kāi)了用于生產(chǎn)具有末端胺的肥P的高產(chǎn)率方法。
[0233] 在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了適合與感興趣的化合物綴合的用苯甲醒部分官能化的 GSC化合物。
[0234] 在一個(gè)實(shí)施方案中，苯甲醒部分附接至GSC化合物，從而產(chǎn)生適合與用胺基團(tuán)官能 化的肥P聚合物綴合的GSC-苯甲醒化合物(參見(jiàn)圖1)。
[0235] 在一個(gè)實(shí)施方案中，4-甲酯基苯甲酸與肥P聚合物化學(xué)偶合，隨后通過(guò)還原胺化與 GSC偶合(參見(jiàn)圖2)。
[0236] 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種基于GSC的試劑，其中4-甲基苯甲酯基亞 連接體連接肥P與GSC(參見(jiàn)圖4)。
[0237] 在一個(gè)實(shí)施方案中，使用基于4-甲基苯甲酯基-GSC的綴合將肥P聚合物與FIX多膚 綴合。
[0238] 在一個(gè)實(shí)施方案中，包含氨基的皿P聚合物部分與4-甲酯基苯甲酸反應(yīng)，隨后通過(guò) 還原胺化與GSC的甘氨酷基氨基基團(tuán)偶合。
[0239] 在一個(gè)實(shí)施方案中，包含反應(yīng)性胺的肥P聚合物與用苯甲醒部分官能化的GSC化合 物綴合，其中所述胺與所述苯甲醒部分反應(yīng)，W產(chǎn)生在皿P與GSC之間的包含4-甲基苯甲酯 基亞連接部分的連接體。
[0240] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，用反應(yīng)性苯甲醒官能化的皿P聚合物與GSC化合物的甘氨酷 基胺部分綴合，其中所述苯甲醒與胺反應(yīng)，W產(chǎn)生在皿P與GSC之間的包含4-甲基苯甲酯基 亞連接部分的連接體。
[0241] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述肥P-GSC綴合物進(jìn)一步綴合到FIX多膚上，W產(chǎn)生其中肥P 聚合物與所述FIX多膚經(jīng)由4-甲基苯甲酯基亞連接部分連接的綴合物。
[0242] 在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)W02007056191制備的GSC與包含苯甲醒部分的肥P聚合物 部分在還原條件下反應(yīng)。
[0243] 在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了適合與GSC偶合的各種肥P-苯甲醒化合物。
[0244] 在一個(gè)實(shí)施方案中，HEP與GSC之間的亞連接體不能形成立體異構(gòu)體或區(qū)域異構(gòu) 體。
[0245] 在一個(gè)實(shí)施方案中，HEP與GSC之間的亞連接體不能形成立體異構(gòu)體或區(qū)域異構(gòu) 體，因此具有較低的在人體中產(chǎn)生免疫應(yīng)答的潛力。
[0246] 在一個(gè)實(shí)施方案中，使用包含4-甲基苯甲酯基-GSC的化學(xué)連接體將皿P聚合物與 FIX多膚連接。
[0247] 在一個(gè)實(shí)施方案中，肥P-GSC用于制備FIX多膚N-聚糖肥P綴合物(參見(jiàn)圖5)。
[0248] 在一個(gè)實(shí)施方案中，肥P-GSC用于使用ST3Gaini制備FIX多膚N-聚糖肥P綴合物。
[0249] 在一個(gè)實(shí)施方案中，肥P-GSC用于使用ST3GalI制備FIX多膚0-聚糖肥P綴合物。
[0巧0] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述皿P聚合物連接至FIX激活膚上的N-聚糖，如SEQ ID NO: 1 的N157或N167。
[0251] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述皿P聚合物連接至FIX激活膚上的0-聚糖，如在SEQ ID N0:1的位置159、169或172上的0-聚糖。
[0252] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所選擇的肥P聚合物大小允許體內(nèi)有用的半衰期，而同時(shí)保持 適當(dāng)?shù)捏w內(nèi)激活為FIXa的能力，同時(shí)還在液體溶液中具有合適的粘度。
[0253] 在一個(gè)實(shí)施方案中，選擇73kDaW下的皿P聚合物大小W在液體制劑中達(dá)到合適的 粘度。
[0254]在一個(gè)實(shí)施方案中，選擇52kDaW下的HEP聚合物大小W在液體制劑中達(dá)到合適的 粘度。
[0255] 在一個(gè)實(shí)施方案中，選擇40kDa或更小的肥P聚合物大小W在液體制劑中達(dá)到合適 的粘度。
[0256] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明中使用的CMP激活的唾液酸衍生物由W下結(jié)構(gòu)表示：
[ο 巧 7]
[Ο 巧引 其中 R1 選自-COOH、-C0NH2、-COOMe、-COCffit、-COOPr，并且 R2、R3、R4、R5、R6 和 R7可 獨(dú)立地選自-Η、-畑2、-甜、-N3、-OH、-F或甘氨酷基氨基基團(tuán)如-畑C (0) C出畑2。
[0259] 在一個(gè)實(shí)施方案中，R1 為-C00H，R2 為H，R3 = R5 = R6 = R7 = -OH，并且 R4 為-NHC(O) C出N出，并且所述唾液酸衍生物是CMP激活的。
[0260] 在一個(gè)實(shí)施方案中，CMP激活的唾液酸為具有W下結(jié)構(gòu)的GSC:
[0261]
[0262]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述唾液酸衍生物在去除CMP基團(tuán)之后與FIX多膚聚糖連接并 具有W下結(jié)構(gòu)：
[0%3]
[0264]其中打開(kāi)的價(jià)鍵表示與FIX連接的鍵，并且
[02 化]其中 R1 選自-C00H、-C0NH2、-COOMe、-COCffit、-COOPr，并且 R2、R3、R4、R5、R6 和 R7 可 獨(dú)立地選自-H、-畑2、-甜、-N3、-OH、-F或甘氨酷基氨基基團(tuán)如-畑C (0) C出畑2。
[0266] 在一個(gè)實(shí)施方案中，肥P聚合物與所述唾液酸衍生物的甘氨酷基氨基基團(tuán)連接。
[0267] W下是本發(fā)明的方面的非限制性列表：
[0268] 1.-種連接具有反應(yīng)性胺的半衰期延長(zhǎng)部分與具有反應(yīng)性胺的GSC部分的方法， 其中首先使所述半衰期延長(zhǎng)部分上的反應(yīng)性胺與激活的4-甲酯基苯甲酸反應(yīng)W產(chǎn)生式A1 的化合物：
[0269]
[0270] 隨后使式A1的化合物與GSC部分在還原條件下反應(yīng)W產(chǎn)生根據(jù)式A2的化合物：
[0271]
[0272] 2.-種連接具有反應(yīng)性胺的半衰期延長(zhǎng)部分與具有反應(yīng)性胺的GSC部分的方法， 其中首先使所述GSC部分上的反應(yīng)性胺與激活的4-甲酯基苯甲酸反應(yīng)W產(chǎn)生根據(jù)式A3的化 合物：
[0273]
[0274] 隨后使式A3的化合物與所述半衰期延長(zhǎng)部分上的反應(yīng)性胺在還原條件下反應(yīng)W 產(chǎn)生根據(jù)式A4的化合物：
[0275]
[0276] 3.根據(jù)方面1至3中任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述半衰期延長(zhǎng)部分為肝素原聚合 物。
[0277] 4.根據(jù)方面1所述的方法，其中使經(jīng)4-甲酯基苯甲酯基修飾的肝素原聚合物 (AA1)：
[027引
[02巧]與GSC(BBl)在還原劑的存在下反應(yīng)，
[0283] 其中η為5至450的整數(shù)。
[0284] 5.根據(jù)方面1至4中任意一項(xiàng)所述的方法，進(jìn)一步包括后續(xù)步驟，其中將與GSC綴合 的半衰期延長(zhǎng)部分與因子IX多膚酶促綴合W產(chǎn)生綴合物，其中半衰期延長(zhǎng)部分經(jīng)由包含4- 甲基苯甲酯基亞連接體并缺乏GSC的胞巧一憐酸基團(tuán)的連接體附接至蛋白質(zhì)。
[0285] 6.可通過(guò)根據(jù)方面1至5中任意一項(xiàng)所述的方法獲得的產(chǎn)物。
[0286] 通過(guò)W下非限制性實(shí)施方案進(jìn)一步描述本發(fā)明：
[0287] 1.-種綴合物，其包含因子IX多膚、連接部分和肝素原聚合物，其中連接所述因子 IX多膚與所述肝素原聚合物的所述連接部分包含X，如下所示：
[0288] [肝素原聚合物]-[X]-[因子IX多膚]
[0289] 其中X包含將根據(jù)W下式Ε1的部分與所述因子IX多膚連接的唾液酸衍生物：
[0290]
[0291] 2.根據(jù)實(shí)施方案1所述的綴合物，其中所述唾液酸衍生物是根據(jù)W下式E2的唾液 酸衍生物：
[0292]
[0293] 其中在位置R1的基團(tuán)選自-C00H、-CON此、-COOMe、-COOEt、-COOPr，并且在位置R2、 R3、R4、R5、R6 和 R7 的基團(tuán)可獨(dú)立地選自-Η、-NH-、-畑2、-甜、-N3、-OH、-F 或-NHC (0)邸2畑-。
[0294] 3.根據(jù)實(shí)施方案2所述的綴合物，其中所述唾液酸衍生物是根據(jù)W下式E3的甘氨 酷基唾液酸：
[0295]
[0296] 并且其中式1的部分與式E3的末端-NH柄連接。
[0297] 4.根據(jù)實(shí)施方案1、2或3所述的綴合物，其中
[0298] 肝素原聚合物]-[X]-
[0299] 包含W下式E4所示的結(jié)構(gòu)片段：
[0300]
[0301] 其中η為5至450的整數(shù)。
[0302] 5.-種綴合物，其包含因子IX多膚和肝素原聚合物，其中所述肝素原聚合物具有 在5至lOOkDa范圍內(nèi)的分子量。
[0303] 6.根據(jù)實(shí)施方案5所述的綴合物，其中所述肝素原聚合物具有在13至60kDa范圍內(nèi) 的分子量。
[0304] 7.根據(jù)實(shí)施方案5所述的綴合物，其中所述肝素原聚合物具有在27至40kDa范圍內(nèi) 的分子量。
[0305] 8.根據(jù)實(shí)施方案5所述的綴合物，其中所述肝素原聚合物的分子量為40kDa+/- 10%。
[0306] 9. 一種藥物組合物，其包含根據(jù)實(shí)施方案1至8中任意一個(gè)所述的綴合物。
[0307] 10與因子IX多膚綴合的肝素原聚合物在aPTT試驗(yàn)中的用途，其中因子IX活性的恢 復(fù)率的變異性小于523個(gè)百分點(diǎn)。
[0308] 11.根據(jù)實(shí)施方案10所述的與因子IX多膚綴合的肝素原聚合物的用途，其中因子 IX活性的恢復(fù)率的變異性不大于115個(gè)百分點(diǎn)。
[0309] 12.根據(jù)實(shí)施方案1至8中任意一個(gè)所述的綴合物，其用作藥物。
[0310] 13.根據(jù)實(shí)施方案1至8中任意一個(gè)所述的綴合物，其用于凝血病的治療。
[0311] 14.根據(jù)實(shí)施方案1至8中任意一個(gè)所述的綴合物，其用于B型血友病的治療。
[0312] 15.根據(jù)實(shí)施方案1至8中任意一個(gè)所述的綴合物，其用于B型血友病的預(yù)防性治 療。
[0313] 16.-種將肝素原聚合物與因子IX多膚綴合的方法，其包括W下步驟：
[0314] a)使包含反應(yīng)性胺的肝素原聚合物陽(yáng)EP-NH]與激活的4-甲酯基苯甲酸反應(yīng)，W產(chǎn) 生W下式E5的化合物，
[0315]
[0316] 其中化EP-N扣表示用末端伯胺官能化的任意肥P聚合物，
[0317] b)使式5的化合物與CMP激活的唾液酸衍生物在還原條件下反應(yīng)，
[0318] C)將步驟b)中獲得的化合物與因子IX多膚上的聚糖綴合。
[0319] 17.根據(jù)實(shí)施方案16所述的方法，其中在步驟b)中使用的CMP激活的唾液酸衍生物 具有W下式E6:
[0320]
[0321] 其中在位置R1的基團(tuán)選自-C00H、-CON肥、-COOMe、-C00化、-COOPr，并且在位置R2、 R3、R4、R5、R6 和 R7 的基團(tuán)可獨(dú)立地選自-H、-NH-、-畑2、-甜、-N3、-OH、-F 或 NHC0CN 出。
[0322] 18.根據(jù)實(shí)施方案16或17所述的方法，其中R4為NHC0CN出。
[0323] 19.使用根據(jù)實(shí)施方案16、17或18所述的方法可獲得的綴合物。
[0324] 通過(guò)W下實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明，但運(yùn)些實(shí)施例不應(yīng)被理解為限制保護(hù)范圍。 在前述說(shuō)明書(shū)和W下實(shí)施例中公開(kāi)的特征單獨(dú)地W及W其任意組合可能對(duì)于實(shí)現(xiàn)不同形 式的本發(fā)明是重要的。
[0325] 實(shí)施例
[03%]實(shí)施例中使用的縮寫(xiě)：
[0327] AUS:產(chǎn)脈節(jié)桿菌(Art虹obacter ureafaciens)唾液酸酶
[0328] CMP:胞巧一憐酸 [03巧]邸TA:乙二胺四乙酸
[0330] Gla: 丫-簇基谷氨酸
[0331] GlcUA:葡糖醒酸
[0332] GlcNAc:N-乙酷基葡萄糖胺
[0333] Grx2:谷氧還蛋白II
[0334] GSC:甘氨酷基唾液酸胞巧一憐酸
[03巧]GSC-SH:[(4-琉基下酷基)甘氨酷基]唾液酸胞巧一憐酸
[0336] GSH:谷脫甘膚
[0337] GSSG:谷脫甘膚二硫化物
[0338] 肥P:肝素原
[0339] 肥P-FIX:與因子IX多膚綴合的肝素原(可與FIX-肥P互換使用）
[0340] 肥P-[C]-FIX化162C):經(jīng)由半脫氨酸與FIX化162C)綴合的肝素原
[0；341] 肥P-[N]-FIX:經(jīng)由N-聚糖與FIX綴合的肝素原
[ο%2] 肥P-GSC:GSC官能化的肝素原聚合物 [0；3創(chuàng)肥P-N出:胺官能化的肝素原聚合物
[0344] HEPES:2-[4-(2-徑乙基)贓嗦-1-基化橫酸
[0345] His:組氨酸
[0；346] IV:靜脈內(nèi) [0：347] K0:敲除
[0%引 MRT:平均停留時(shí)間 [0349] PABA:對(duì)氨基苯甲脈
[03加 ]PmHSl:多殺己斯德氏菌(Pasteurella mutocida)肝素原合酶I
[0巧1] pNA:對(duì)硝基苯胺 惦52] SXa-11:因子X(jué)a顯色底物
[0353] UDP:尿巧二憐酸
[0354] 實(shí)施例1:定量方法
[0355] 通過(guò)HPLC分析本發(fā)明的綴合物的純度。冊(cè)LC還用于綴合物定量。定量基于使用 280nm波長(zhǎng)吸收譜的曲線下面積積分。使用由Wyeth F*ha;rmaceuticals Inc .生產(chǎn)的 BeneFIXK 重組凝血因子 IX 作為參考。使用Zorbax 300SB-C3柱（4.6x50mm;3.5ym Agilent,目錄號(hào):865973-909)。在配備有巧光檢測(cè)器巧X 280nm，血：M8nm)的Agilent 1100 Series冊(cè)LC上操作該柱。柱溫為30°C，樣品注射量為化g且流速為1.5ml/min。采用含有 0.1%Ξ氣乙酸的水(A)-乙臘(B)溶劑體系洗脫柱。梯度程序如下:0min(25%B);4min(25% B); 14min(46%B) ;35min(52%B) ;40min(90%B) ;40. lmin(25%B)。
[0356] 實(shí)施例 2:SDS-PAGE 分析
[Ο%7] 使用全部來(lái)自Invihogen的預(yù)制N叫age 7%1:;ris-乙酸鹽凝膠、Nu化ge tris-乙 酸鹽SDS電泳緩沖液和N證age LDS樣品緩沖液進(jìn)行SDS PAGE分析。在分析之前使樣品變性 (70°C，10min)。使用HiMark HMW(Invitrogen)作為標(biāo)準(zhǔn)。電泳在150V、120mA下在具有發(fā)電 站的XCe 11 Sure lock Complete (Invitrogen)中運(yùn)行80min。使用來(lái)自 Invitrogen的 SimplyBlue SafeSl:ain將凝膠染色。
[0358] 實(shí)施例3:FIX化162C)的選擇性還原
[0359] W與US20090041744中針對(duì)FVIIa407C描述的方式類(lèi)似的方式，使用基于谷脫甘膚 的氧化還原緩沖液體系還原FIX化162C)。將未還原的FIX化162〇(10.5111旨）在含有0.51111 65山154]?6556、2.5111]\1對(duì)氨基苯甲脈和24]\16'義2的總體積為5.251111的50111]\1胎963，100111]\1 化CiaOmM CaCl2(pH 7.0)中，在室溫下溫育23小時(shí)。隨后用50mM胎pesaOOmM化C1將反 應(yīng)混合物稀釋至44ml，在冰上冷卻，并添加至4ml lOOmM抓TA溶液中，同時(shí)保持pH為7.0。隨 后將全部?jī)?nèi)含物加載到W緩沖液A(50mM HepesaOOmM化Cl，pH 7.0)平衡的2x5ml HiTrap Q FF柱(Amersham BiosCiences，GE Healthcare)上，W捕獲FIX(E162C)。用緩沖液A洗涂 W 去除未結(jié)合的Grx2之后，用緩沖液B(50mM胎pes，lM化CiaOmM CaCl2，pH 7.0)-步洗脫 FIX化162C)。通過(guò)冊(cè)LC測(cè)定洗脫物中FIX化162C)的濃度。隨后添加對(duì)氨基苯甲脈（2化1的 0.5M水溶液)至最終濃度為2mM。在5ml的50mM Hepes，lM化CiaOmM CaCl2,2mM對(duì)氨基苯甲 脈(pH 7.0)中分離出7.95mg的單一半脫氨酸還原的FIX化162C)。
[0360] 實(shí)施例4:60kDa 肥P-[C]-FIX化 162C)的合成
[03W]向單一半脫氨酸還原的FIX化 162C)(7.95mg)在50mM Hepes，lM 化CiaOmM CaCl2,2mM PABA(pH 7.0)(5ml)中的溶液中添加溶解于 50mM Hepes，100mM 化 CiaOmM CaCb(pH 7.0) (2.95ml)中的60kDa皿P-馬來(lái)酷亞胺(55.3mg)。將澄清溶液置于滾軸混合 器上，并在室溫下輕輕旋轉(zhuǎn)22小時(shí)。隨后將反應(yīng)混合物加載到經(jīng)Gla-結(jié)構(gòu)域特異性抗體修 飾的FIX特異性親和柱(CV = 66ml，總結(jié)合容量為13.3mg FIX)上，并首先用2個(gè)柱體積的緩 沖液A(50mM胎pesaOOmM化CiaOmM CaCl2，pH 7.4)然后用兩個(gè)柱體積的緩沖液8(5〇111]\1 Hepes，100mM化Cl，10mM邸TA，pH7.4)分步洗脫。收集含有FIX和60kDa肥P-FIX綴合物的 級(jí)分，并將該級(jí)分直接加載到用10mMHis，100mM化Cl(pH7.5)預(yù)平衡的2x5mlHiTrapQ FF離子交換柱（Amersham Biosciences，GE 胎althcare)上。用4個(gè)柱體積的lOmM His, lOOmM化Cl(pH 7.5)洗柱W去除未結(jié)合的物質(zhì)。隨后將洗脫液更換為緩沖液A(l〇mM化s， lOOmM NaCiaOmM CaCl2，pH=6.0)。用5個(gè)柱體積的20%緩沖液B(l〇mM HisaOOmM NaCl， lOmM CaCl2，pH = 6.0)洗脫未修飾的FIX化162C)，隨后用5個(gè)柱體積的40%緩沖液B洗脫 60kDa皿P-FIX。將含有綴合物的級(jí)分合并，并采用lOkDa的截?cái)嘀凳褂肧lide-A-Lyzer盒 (Thermo Scientific)針對(duì)lOmM His, lOOmM NaCl，10mM 化〔12(抑=6.0)進(jìn)行透析。通過(guò)添 加 lOmM HisaOOmM化CiaOmM CaCl2(pH = 6.0)將最終體積調(diào)整至0.3mg/ml。如實(shí)施例2所 述W SDS-PAGE分析綴合物的純度。如通過(guò)針對(duì)FIX標(biāo)準(zhǔn)的HPLC定量所測(cè)定的，綴合物的產(chǎn)量 為 3.75mg(47%)。
[0362] 實(shí)施例5:38.840曰肥口-[口斗《化1620的合成
[0363] 使用如實(shí)施例1所述制備的單一半脫氨酸還原的FIX化1620(6.30mg)和38.8kDa 肥P-馬來(lái)酷亞胺（18.9mg)，如實(shí)施例4所述制備該綴合物。在6.3ml lOmM His，150mM NaCl， 5mMCaCl2,0.005%吐溫80(pH6.4)中分離出2.8mg(44%)38.8kDa皿P-[C]-FIX化162C) (祉M;0.45mg/ml)。
[0364] 實(shí)施例6:27kDa 肥P-[C]-FIX化 162C)的合成
[0365] 使用如實(shí)施例1所述制備的單一半脫氨酸還原的FIX化162C)(6.32mg)和27kDa 皿P-馬來(lái)酷亞胺（10.2mg)，如實(shí)施例4所述制備該綴合物。在8.84mll0mMHis，150mM 化Cl，5mMCaCl2,0.005%吐溫80(pH6.4)中分離出3.96mg(62%)2化DaHEP-[C]-FIX (E162C)(8yM;0.45mg/ml)。
[0366] 實(shí)施例7:13kDa 肥P-[C]-FIX化 162C)的合成
[0367] 使用如實(shí)施例1所述制備的單一半脫氨酸還原的FIX化1620(10.0 mg)和13kDa 皿口-馬來(lái)酷亞胺（10.〇111旨），與實(shí)施例4類(lèi)似地制備該綴合物。在5.1〇11111〇11^化3，15〇1111 NaCl，5mMCaCl2,0.005%吐溫80(pH6.4)中分離出2.3mg(23%)13kDaHEP-[C]-FIX (E162C)(8yM;0.45mg/ml)。
[036引實(shí)施例8: FIX的去唾液酸化
[0369] 室溫下，使FIX(20.4mg)與唾液酸酶（產(chǎn)脈節(jié)桿菌，140μ1，0.3mg/ml，200U/ml)在 1.7ml的10mM組氨酸、3mMCaCl2、150mMNaCl(抑6.2)中反應(yīng)l小時(shí)。隨后用50mM胎pes， lOOmM化Cl (pH 7.0) (20ml)稀釋反應(yīng)混合物，并將反應(yīng)混合物在冰上冷卻。W小份添加 lOOmM邸TA溶液(3ml)。在每次添加后測(cè)量抑。將抑維持在5.5-9.0內(nèi)。用Mi 11 iQ水將反應(yīng)混 合物稀釋至40mlW降低電導(dǎo)率，并施加至用緩沖液A(50mM HepesaOOmM化Cl，pH 7.0)平 衡的2x5ml HiTrap Q FF離子交換柱（Amersham Biosciences，GE Healthcare)上。用緩沖 液B(50mM胎pes，lM化CiaOmM CaCl2,抑7.0)-步洗脫去唾液酸FIX。通過(guò)HPLC測(cè)定洗脫 物中去唾液酸FIX的濃度。在6ml 50mM Hepes，lM化CiaOmM CaCl2(pH 7.0)中分離出 17.2mg去唾液酸FIX( 2.86mg/ml)。
[0370] 實(shí)施例9: [(4-琉基下酷基)甘氨酷基]唾液酸胞巧一憐酸(GSC-SH)的合成
[0371]
[0372] 將甘氨酷基唾液酸胞巧一憐酸(200mg;0.318mmol)溶解在水(2ml)中，并添加硫代 下內(nèi)醋（325111旨；3.18111111〇1)。在室溫下將兩相溶液輕輕混合2化。隨后將反應(yīng)混合物用水 (10ml)稀釋?zhuān)⑹┘又练聪郒PLC柱（C18,50mm X 200mm)上。采用水(A)、乙臘(B)和250mM碳 酸氨錠(C)的如下梯度體系W50ml/min的流速洗脫柱:0min(A:90%，B:0%，C:10%);12min (A:90%，B:0%，C: 10% ) ;48min(A:70%，B:20%，C: 10% )。收集級(jí)分(20ml大小)并通過(guò)LC- MS對(duì)其進(jìn)行分析。將純級(jí)分合并，并使其緩慢通過(guò)鋼形式的Dowex 50W X 2(100-200目）樹(shù) 脂的短墊，之后凍干成干燥粉末。隨后使用260皿處的吸光度并且W甘氨酷基唾液酸胞巧一 憐酸作為參考物質(zhì)，通過(guò)HPLC測(cè)定冷凍干燥的粉末中標(biāo)題物質(zhì)的含量。對(duì)于HPLC分析，使用 了Waters X-Bridge苯基柱(5ym4.6mm X 250mm)和水乙臘體系（30min內(nèi)0-85%乙臘的線性 梯度，含有0.1 %憐酸）。產(chǎn)量：61.6mg(26% ) dLCMS:732.18(MH+);427.14(MH+-CMP)。當(dāng)在-80 °C下儲(chǔ)存時(shí)，化合物在延長(zhǎng)的時(shí)間段(> 12個(gè)月）內(nèi)穩(wěn)定。
[0373] 實(shí)施例10:具有末端氨基乙基柄的肝素原聚合物的合成
[0374] 步驟l:(2-Fmoc-氨基）乙基2,3,4-Ξ-0-乙酷基-β-D-葡糖醒酸甲基醋的合成
[0375]
[0376] 將粉末化的分子篩（1.18g，4 Α)在安裝有磁力攬拌棒的50ml圓底燒瓶中在110°C 下加熱過(guò)夜，用氣氣沖洗，并使其冷卻至室溫。在氣氣下添加900mg(2.19mmol)乙酷-漠-β- D-葡糖醒酸甲醋和748.5mg (2.64mmo 1，1.2當(dāng)量)2- (Fmoo-氨基）乙醇，然后添加28ml二氯甲 燒。將懸浮液在室溫下攬拌15分鐘，隨后在冰/化C1漿體上冷卻30分鐘。在冷卻過(guò)程中形成 白色沉淀物。在約5分鐘的時(shí)間內(nèi)分3份添加676.3mg(2.63mmo 1，1.2當(dāng)量）Ξ氣甲橫酸銀 (Ag0Tf)"20分鐘后去除冰浴。先前注意到的白色沉淀物開(kāi)始溶解，同時(shí)開(kāi)始形成灰色沉淀 物。將反應(yīng)在室溫下攬拌過(guò)夜，隨后通過(guò)添加19化LS乙胺(2.63mmol，1.2當(dāng)量)巧滅。在通 過(guò)薄Celite 521墊（約0.1-0.2cm深)過(guò)濾并隨后用20ml二氯甲燒洗涂濾餅之后，用二氯甲 燒將合并的濾液稀釋至150ml。將有機(jī)相用5 %化肥化（1巧OmL)和水（1巧OmL)洗涂，隨后經(jīng) 硫酸儀干燥并過(guò)濾。將濾液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(《40°C水浴)上真空濃縮至干，隨后再溶解于2mL 二氯甲燒中。將溶液注射到VersaPak硅膠快速柱(23xll0mm，23g)上，并用在己燒中的50% 乙酸乙醋洗脫產(chǎn)物。通過(guò)化C(乙酸乙醋：己燒，1:1)鑒定含有產(chǎn)物的級(jí)分，并將該級(jí)分在旋 轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（《40°C水浴)上真空濃縮至干。將得到的殘余物用約lOmL二乙酸研磨，產(chǎn)生呈白 色結(jié)晶泡沫的標(biāo)題物質(zhì)。產(chǎn)量:293mg(0.49mmol，22.4% )。
[0377]步驟2: (2-Fmoc-氨基）乙基β-D-葡糖醒酸鋼鹽的合成 [037引
[0379] 將步驟1中獲得的490mg(0.817mmol，1當(dāng)量）的（2-Fmoc-氨基）乙基2，3，4-Ξ-0-乙 酷基-β-D-葡糖醒酸甲醋溶解于47.5mL甲醇中，并在攬拌下緩慢添加2.5mL( 2.45mmol，3當(dāng) 量）的1M化OH溶液。使用1 -下醇：乙酸：水=1:1:1作為洗脫液，通過(guò)化C監(jiān)測(cè)反應(yīng)。在化C顯 示該甲醋完全消耗后，通過(guò)添加1N HC1將反應(yīng)混合物的pH降至pH 8-9。然后添加204mg (2.45mmol，3當(dāng)量）固體化HC03，接著添加241.7mg(0.899mmol，1.1當(dāng)量）化〇。-氯化物。當(dāng) TLC分析顯示反應(yīng)完全時(shí)，將反應(yīng)混合物用約150mL水稀釋?zhuān)靡宜嵋掖?2x30mL)萃取兩次， 隨后在40°C水浴上真空濃縮至約20mLW去除任何殘余的有機(jī)溶劑。通過(guò)添加乙酸至約5% (V: V)的含量將溶液酸化，并使溶液通過(guò)5克Strata C-18E S陽(yáng)管(在甲醇中預(yù)濕，并根據(jù)制 造商的說(shuō)明在5%乙酸中平衡）。用5%乙酸洗涂樹(shù)脂，并用90%甲醇與10%Tris.HCl，pH 7.2(v:v)的混合物洗脫產(chǎn)物。真空濃縮(《40°C水浴)至干后，將殘余物再溶解并用氨氧化 鋼將pH調(diào)節(jié)至抑7.2。將該溶液直接作為儲(chǔ)備溶液用于W下(2-Fmoc-氨基）乙基4-0-(2-脫 氧-2-乙酷氨基-a-D-化喃葡萄糖基)-β-0-葡糖醒酸的合成，而無(wú)需進(jìn)一步純化。
[0380] 步驟3:(2-Fmoc-氨基）乙基4-0-(2-脫氧-2-乙酷氨基-a-D-化喃葡萄糖基）-β-0- 葡糖醒酸鋼鹽的合成
[0381]
[0382] 向步驟2中獲得的380mg(2斗moc-氨基）乙基β-D-葡糖醒酸（0.83mmol，l當(dāng)量）在 lOO.SmL水中的溶液中添加5.6mL 1M Tris.HCKpH 7.2)、5.6mL lOOmM MnCb和 1.8g UDP-GlcNAc(2.79mmo 1,3.4當(dāng)量）。在約 Imin內(nèi)緩慢添加5. ImL MBP-PmHS 1 酶（15.47mg/mL 78.9mg)后，使反應(yīng)在室溫下緩慢攬拌直到化C分析（1-下醇：乙酸:水=2:1:1)顯示起始材 料幾乎完全轉(zhuǎn)化。通過(guò)添加2.8mL乙酸將溶液酸化W沉淀用過(guò)的MBP-PmHSl，并轉(zhuǎn)移至50mL 離屯、瓶中。隨后將溶液在JM-12旋轉(zhuǎn)器(約16,000x g)中在室溫下ΚΙΟ,ΟΟΟ巧m離屯、30min。 傾出上清液并添加160血甲醇。用4x 25血水：甲醇：乙酸=45:50:5(V: V: V)的溶液萃取沉淀 物。使合并的上清液和萃取物通過(guò)2g S化ata-SAX管(在水：甲醇：乙酸= 45:50:5(v:v:v)中 平衡）W去除任何UDP&UDP-GlcNAc(完全去除需要28克樹(shù)脂）。在運(yùn)些條件下祀分子沒(méi)有被 保留并通過(guò)樹(shù)脂；而帶更高電荷的UDP&UDP-GlcNAc被保留。將合并的洗脫物真空濃縮（水 浴;《40°C)，再溶解于水中，并使用氨氧化鋼將抑調(diào)節(jié)至抑7.2。該溶液直接在下一步中使 用而無(wú)需進(jìn)一步純化。
[0383] 步驟4:(2-Fmoc-氨基）乙基4-0-(2-脫氧-2-乙酷氨基-4-0-(β-0-化喃葡萄糖基糖 醒酸)-a-D-化喃葡萄糖基)-β-0-葡糖醒酸二鋼鹽的合成
[0384]
[03化]將含有9mM(2-Fmoc-氨基）乙基4-0-(2-脫氧-2-乙酷氨基-a-D-化喃葡萄糖基)-β- D-葡糖醒酸、30mM UDP-GlcUA、50mM Tris.HQ和5mM MnCl2的水溶液（38ml)置于旋轉(zhuǎn)瓶中。 在約Imin的時(shí)間內(nèi)，在緩慢攬拌下逐滴添加9.5mL MBP-PmHSl。將反應(yīng)混合物攬拌過(guò)夜，之 后TLC分析(洗脫液:n-BuOH: AcOH:此0 = 4:1:1 (V: V: V))顯示起始材料完全轉(zhuǎn)化。使反應(yīng)混 合物通過(guò)1皿玻璃纖維注射器式濾器過(guò)濾，并通過(guò)5克C18-E S陽(yáng)管(根據(jù)制造商的說(shuō)明在水 中平衡）。用水洗涂樹(shù)脂，然后用90 %MeOH水溶液，ImM化i S.肥1 (pH 7.2)的混合物洗脫祀 分子。將洗脫物真空濃縮(水浴《40°(：)，隨后再溶解于25血1〇1111化13.肥1(抑7.2)中，并 通過(guò)0.2μπι SFCA注射器式濾器進(jìn)行過(guò)濾。通過(guò)陰離子交換色譜法進(jìn)一步純化含有祀分子的 濾液。使用配備有2.6χ 13cm Q Sepharose HP柱并用Unicorn 5.11軟件操作的441日 Explorer 100。使用兩個(gè)緩沖液體系（緩沖液A:10mM Tris.HCl，pH 7.2，和緩沖液8:1〇1111 Tris.HCl，pH 7.2，1M化Cl)進(jìn)行洗脫。使用在175min內(nèi)0-20%B的梯度WlOml/min的流速 洗脫祀分子。收集10ml級(jí)分。將含有產(chǎn)物的級(jí)分合并，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上真空濃縮(水浴<40 °C)至干，并在下一步中使用而無(wú)需進(jìn)一步純化。
[03化]步驟5 :(2-氨基乙基）4-0-(2-脫氧-2-乙酷氨基-4-0-(β-0-化喃葡萄糖基糖醒 酸)-a-D-化喃葡萄糖基)-β-0-葡糖醒酸二鋼鹽的合成
[0387]
[0388] 將如步驟4所述獲得的（2-Fmoc-氨基）乙基4-0-(2-脫氧-2-乙酷氨基-4-0-(β-0- 化喃葡萄糖基糖醒酸)-a-D-化喃葡萄糖基)-β-0-葡糖醒酸二鋼鹽溶解在4mL水中并在冰浴 上冷卻。在攬拌下添加體積為4mL的純嗎嘟并去除冰浴。在室溫下繼續(xù)攬拌，直到使用UV 254nm檢測(cè)的TLC分析(n-BuOH: AcOH:此0 = 3:1:1 (V: V: V))顯示起始材料完全消耗。反應(yīng)在 不到1.化r內(nèi)完成。將反應(yīng)混合物用約50mL水稀釋?zhuān)⒂?0mL化OAc萃取Ξ次。將含有祀分 子的水相在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上真空濃縮(水浴<4(TC)并與水共蒸發(fā)Ξ次。將殘余物再溶解于 lOmL水中并通過(guò)在水中預(yù)平衡的1克SDB-L SPE柱。通過(guò)柱的祀分子沒(méi)有被保留。用lOmL水 洗涂該柱，并將含有祀分子的合并級(jí)分真空濃縮至干(水浴;《40°〇。將獲得的剩余物溶解 在1.5mL 1M化OAc，抑7.5中，通過(guò)0.2皿旋轉(zhuǎn)過(guò)濾器過(guò)濾，并^水作為洗脫液在5邱4曰(16義 G-10柱（2^5cm，235mL)上通過(guò)大小排阻色譜法脫鹽。通過(guò)MALDI-TOF MS(基質(zhì)：5mg/mL ATT;50%乙臘/0.05%Ξ氣乙酸)確認(rèn)標(biāo)題物質(zhì)的結(jié)構(gòu)：636.83曲+化+]。凍干之后，將標(biāo)題 物質(zhì)溶解在水中，通過(guò)添加氨氧化鋼將獲得的溶液的抑調(diào)節(jié)至抑7.0-7.5，并通過(guò)巧挫試 驗(yàn)來(lái)測(cè)定Ξ糖含量(BitterT，MuirHM.AnalBiocheml962年10月；4:330-4)。將獲得的儲(chǔ) 備溶液進(jìn)行等分并在-80°C下儲(chǔ)存在密封的容器中直到需要使用。
[0389] 從(2-Fmoc-氨基）乙基β-D-葡糖醒酸開(kāi)始的（2-氨基乙基)4-0-(2-脫氧-2-乙酷氨 基-4-0-(β-0-化喃葡萄糖基糖醒酸)-a-D-化喃葡萄糖基)-β-0-葡糖醒酸的總分離產(chǎn)量為 210mg(0.34mmol，41%)。
[0390] 步驟6:具有胺末端的肝素原多糖的產(chǎn)生
[0391]
[0392] 為了獲得具有游離胺基團(tuán)的肝素原聚合物衍生物化EP-NH2)，在體外W平行方式 使用多殺己斯德氏菌（Pasteurella multocida)肝素原合酶1 (P恤S1 ;DeAngelis&White， 2002J Biol化em)化學(xué)酶促合成聚合物鏈（Sisme廠Ragatz等人，2007 J Biol畑em和 US8088604)。使用大腸桿菌麥芽糖結(jié)合蛋白與PmHSl的融合體作為催化劑，W使用如 US2010036001中所述的UDP-GlcNAc和UDP-GlcUA前體W及MnCh催化，使步驟5中獲得的（2- 氨基乙基）4-0-(2-脫氧-2-乙酷氨基-4-0-(β-0-化喃葡萄糖基糖醒酸）-a-D-化喃葡萄糖 基)-β-D-葡糖醒酸化EP3-N也)延長(zhǎng)為更長(zhǎng)的聚合物鏈。
[0393] 步驟7:具有末端苯甲醒官能團(tuán)的肝素原多糖的產(chǎn)生
[0394] 為了獲得肝素原聚合物衍生物W供經(jīng)由還原胺化等與祀藥物化合物上的可接近 的氨基官能團(tuán)偶合，將肝素原-N也與N-班巧酷亞胺基-4-甲酯基苯甲酸偶合W形成苯甲醒 修飾的肝素原聚合物?；旧?，在一個(gè)實(shí)例中，將溶解在二甲基亞諷中的N-班巧酷亞胺基- 4-甲酯基苯甲酸（Qiem-Impex，Inc)(在205mL中11.94mg)緩慢添加至62.7g 43.8kDa肝素原 聚合物-N也溶解在380mL 1M憐酸鋼(pH 7.0)、2180ml水和1040mL二甲基亞諷中的攬拌溶液 中。將反應(yīng)混合物在室溫下攬拌過(guò)夜，然后在環(huán)境溫度下進(jìn)行醇沉淀。將含有產(chǎn)物的沉淀物 溶解在化的500mM乙酸鋼(pH 6.8)中，進(jìn)一步純化，隨后通過(guò)錯(cuò)流過(guò)濾進(jìn)行濃縮。
[0%日]實(shí)施例11:肥P-馬來(lái)酷亞胺和肥P-苯甲醒聚合物的合成
[0396] 使用兩種糖核巧酸UDP-GlcNAc和UDP-GlcUA，通過(guò)酶促(PmHSl)聚合反應(yīng)制備規(guī)定 大小的馬來(lái)酷亞胺和醒官能化的皿P聚合物。使用引發(fā)Ξ糖(GlcUA-GlcNAc-GlcUA)N也啟動(dòng) 反應(yīng)，并且運(yùn)行聚合反應(yīng)直到糖核巧酸結(jié)構(gòu)單元耗盡。隨后用合適的反應(yīng)性基團(tuán)將末端胺 (源于引物)官能化，在運(yùn)種情況下該反應(yīng)性基團(tuán)為設(shè)計(jì)用于與游離半脫氨酸和硫代GSC衍 生物綴合的馬來(lái)酷亞胺官能團(tuán)，或設(shè)計(jì)用于與GSC發(fā)生還原胺化化學(xué)反應(yīng)的苯甲醒官能團(tuán)。 可W通過(guò)糖核巧酸：引物化學(xué)計(jì)量的變化來(lái)預(yù)先確定肥P聚合物的大小。該技術(shù)在US2010/ 0036001中詳細(xì)描述。
[0397] 可W通過(guò)在中性水溶液中使胺官能化的皿P聚合物與過(guò)量的N-班巧酷亞胺基-4- 甲酯基苯甲酸(化no 16的6'3(2007)7(8)，口口.2207-2210)反應(yīng)來(lái)制備皿口-苯甲醒?？蒦通 過(guò)離子交換色譜法、大小排阻色譜法或HPLC來(lái)分離苯甲醒官能化的聚合物。
[0398] 可通過(guò)使胺官能化的皿P聚合物與過(guò)量的N-馬來(lái)酷亞胺基下酷基-氧基班巧酷亞 胺酯（GMBS;Fujiwara，K等人（1988)J Immunol Meth 112,77-83)反應(yīng)來(lái)制備皿P-馬來(lái)酷亞 胺。
[0399] 可W通過(guò)離子交換色譜法、大小排阻色譜法或HPLC分離苯甲醒或馬來(lái)酷亞胺官能 化的聚合物。本實(shí)施例中可W使用任何用末端伯胺官能化的肥P聚合物化EP-N此）。^下示 出了兩個(gè)選項(xiàng)：
[0400]
[0402] 此外，多糖的非還原端上的末端糖殘基可W是N-乙酷基葡萄糖胺或葡糖醒酸 上描繪了葡糖醒酸）。通常，如果在聚合反應(yīng)中已經(jīng)使用了等摩爾量的UDP-GlcNAc和UDP- GlcUA，則可W預(yù)期兩者的混合物。
[0403] 實(shí)施例12:具有班巧酷亞胺亞連接的38.8kDa肥P-GSC試劑的合成
[0404]
[040引實(shí)施例12(續(xù)）
[0406]如下所述通過(guò)將GSC-細(xì)（[(4-琉基下酷基)甘氨酷基]唾液酸胞巧一憐酸）與皿P- 馬來(lái)酷亞胺Wl:l摩爾比偶合來(lái)制備皿P試劑：向溶解在50mM HepesaOOmM化Cl，pH 7.0 (50μ1)中的GSC-甜(0.50mg)中添加溶解在50mM HepesaOOmM NaCl，pH 7.0(1350μ1)中的 26.38mg 38.8kDa皿Ρ-馬來(lái)酷亞胺。使澄清溶液在25°C下靜置2小時(shí)。采用lOkDa的截?cái)嘀?使用Slide-A-Lyzer盒（Thermo Scientific)通過(guò)透析去除過(guò)量的GSC-細(xì)。透析緩沖液為 50mMHepes，100mMNaCl，10mMCaCl2，pH7.0。將反應(yīng)混合物在2.5小時(shí)內(nèi)透析兩次。回收 的物質(zhì)原樣在實(shí)施例14中使用，假設(shè)GSC-SH與皿P-馬來(lái)酷亞胺之間定量反應(yīng)。通過(guò)該程序 制成的肥P-GSC試劑將含有經(jīng)由班巧酷亞胺連接附接至唾液酸胞巧一憐酸的肥P聚合物。
[0407] 實(shí)施例13:具有班巧酷亞胺亞連接的60kDa肥P-GSC的合成
[040引按照與W上針對(duì)38.8kDa皿P-GSC描述的類(lèi)似的方式，使用60kDa肥P-馬來(lái)酷亞 胺和[(4-琉基下酷基)甘氨酷基]唾液酸胞巧一憐酸制備該分子。
[0409] 實(shí)施例14:具有班巧酷亞胺亞連接的38.8kDa肥P-[N]-FIX的合成
[0410] 如下所述合成38.8kDa 皿P-[N]-FIX:向在50mM Hepes，lM 化CiaOmM CaCl2，pH 7.0(6ml)中的去唾液酸 FIX(17.2mg)中添加在 50mM HepesaOOmM NaCiaOmM CaCl2，pH 7.0(1.5ml)中的38.8kDa 皿P-GSC(26.38mg，來(lái)自實(shí)施例 11)，然后添加在20mM Hepes， 120mM NaCl，50%甘油，pH 7.0(6ml)中的大鼠 ST3GalIII酶（3.3mg; 1.1 單位/mg)。將反應(yīng)混 合物在32°C下溫育17.5小時(shí)。然后添加157mMN-乙酷基神經(jīng)氨酸胞巧一憐酸在50mM Hepes，150mM化CiaOmM CaCl2，pH 7.0(0.21111)中的溶液，并將反應(yīng)在32°(：下另外溫育一 小時(shí)。然后，基本上如實(shí)施例4所述通過(guò)親和和陰離子交換色譜法的組合分離38.8kDa肥P- [N]-FIX。將分離的化合物透析至lOmM His，150mM 化Cl，5mM CaCl2,0.005%吐溫80(pH 6.4)中。如實(shí)施例2所述WSDS-PAGE分析綴合物的純度。在6.2mll0mMHis，150mMNaCl， 5mMCaCl2,0.005%吐溫80(pH6.4)中分離出2.76mg(16%)的38.8kDaHEP-[N]-FIX (0.45mg/ml)。
[0411] 實(shí)施例15:具有班巧酷亞胺亞連接的60kDa肥P-[N]-FIX的合成
[0412] 使用如實(shí)施例8所述制備的去唾液酸FIX(8.5mg)和如實(shí)施例13中制備的60kDa 肥P-GSC(30.0mg)，與實(shí)施例14類(lèi)似地制備該綴合物。在1.5ml lOmM His，150mM化Cl，5mM CaCl2，0.005%吐溫80(pH 6.4)中分離出0.69mg(8% )60kDa 肥P-陽(yáng)]-FIX(0.45mg/ml)。
[0413] 實(shí)施例16:具有4-甲基苯甲酯基亞連接的41.5kDa肥P-GSC試劑的合成
[0414]
[041引實(shí)施例16(續(xù)）
[0416] 將在5.0ml的50mMHepes，100mM化Cl，10mMCaCl2緩沖液(pH7.0)中的甘氨酷基 唾液酸胞巧一憐酸(GSC) (20mg; 32皿〇1)直接添加至干燥的41.5kDa肥P-苯甲醒(99.7mg; 2.5μπιο1，氮定量）中。輕輕旋轉(zhuǎn)混合物直到所有肥P-苯甲醒均溶解。在接下來(lái)的2小時(shí)內(nèi)，分 批(5巧化1)添加氯基棚氨化鋼在Mi 11 iQ水中的1Μ溶液，W達(dá)到48mM的最終濃度。隨后如下 通過(guò)透析去除過(guò)量的GSC:將總反應(yīng)體積(5250μ1)轉(zhuǎn)移至透析盒(Slide-A-Lyzer Dialysis 化ssette，Thermo Scientific P;rod#66810，截?cái)嘀祃OkDa，容量：3-12ml)中。將溶液針對(duì) 2000ml的25mM Hepes緩沖液(pH 7.2)透析2小時(shí)，并再一次針對(duì)2000ml的25mM Hepes緩沖 液(pH7.2)透析17h。使用GSC作為參考，在WatersX-化idge苯基柱（4.6mmx 250mm，5皿） 上使用水乙臘體系（在30min內(nèi)0-85 %乙臘的線性梯度，含有0.1 %憐酸），通過(guò)HPLC驗(yàn)證過(guò) 量GSC從內(nèi)室中的完全去除。收集內(nèi)室物質(zhì)并冷凍干燥，W得到呈白色粉末的83% (氮定量） 41.5kDa肥P-GSC。通過(guò)該程序制成的肥P-GSC試劑含有經(jīng)由4-甲基苯甲酯基連接附接至唾 液酸胞巧一憐酸的肥P聚合物。
[0417] 實(shí)施例17:具有4-甲基苯甲酯基亞連接的21kDa肥P-GSC試劑的合成
[0418] 按照與W上針對(duì)41.5kDa皿P-GSC描述的類(lèi)似的方式，使用21kDa肥P-苯甲醒和 甘氨酷基唾液酸胞巧一憐酸(GSC)制備該分子。冷凍干燥之后產(chǎn)率為78%。
[0419] 實(shí)施例18:具有4-甲基苯甲酯基連接的41.5kDa肥P-[N]-FIX的合成
[0420] 向在1ml的lOmM組氨酸，150mM化Cl，3mM CaCl2，pH 6.0(反應(yīng)緩沖液）中的FIX (12.3mg)中添加16.7μ1在反應(yīng)緩沖液中1:2000稀釋的化S-唾液酸酶(AUS)(在稀釋之前為 1.33mg/ml，8抓/mg)，ST3Galin(在20mM 胎pes，120mM NaCl，50%甘油，pH 7.0中為 1.4mg/ ml)至24化g/ml反應(yīng)混合物的最終濃度，99.化1的41.5kDa肥P-GSC(凍干的化合物在反應(yīng) 緩沖液中重建為lOOmg/ml的濃度）。用1祉1 0.25M肥1將反應(yīng)混合物的抑調(diào)節(jié)至6.0。將反 應(yīng)混合物在25°C下溫育18小時(shí)。在用lOmM組氨酸緩沖液，5mM化Cl2，150mM NaCl pH 6.0平 衡的Source 30Q柱上W流通模式從41.5kDa肥P-[N]-FIX中分離未綴合的FIX、St3Gaim 和唾液酸酶。采用洗脫緩沖液（lOmM組氨酸，5mM CaCl2，lM化Cl，pH 6.0)的0-100%梯度經(jīng) 20個(gè)柱體積洗脫41.5kDa肥P-陽(yáng)]-FIX。將N-乙酷基神經(jīng)氨酸胞巧一憐酸和St3Gaini添加 至洗脫出的合并物中至最終濃度分別為〇.8mg/m巧日化g/ml，并將反應(yīng)混合物在25°C下溫育 3小時(shí)。然后，除使用不同的緩沖液W外，基本上如實(shí)施例4所述，通過(guò)親和色譜法純化 41.化Da肥P-[N]-FIX。使用W下緩沖液:緩沖液A:50mM組氨酸aOOmM化CiaOmM CaCl2， pH6.2;緩沖液B:50mM組氨酸，100mMNaCl，20mM抓TA，pH6.2。將分離的化合物透析至 10mMHis，150mMNaCl，5mMCaCl2,0.005%吐溫80，pH6.4中。在6.0ml的10mMHis，150mM 化Cl，5mMCaCl2,0.005%吐溫80，pH6.4中分離出0.926mg(7.5%)的41.5kDa皿P-[N]- FIX(0.15mg/ml)。
[0421] 實(shí)施例19:具有4-甲基苯甲酯基連接的21kDa肥P-[N]-FIX的合成
[0422] 使用去唾液酸FIX和來(lái)自實(shí)施例16的21kDa肥P-GSC，W與實(shí)施例18中描述的類(lèi)似 的方式合成該化合物。最終的綴合物含有經(jīng)由4-甲基苯甲酯基連接附接至FIX的皿P聚合 物。
[0423] 實(shí)施例20:具有4-甲基苯甲酯基連接的基于神經(jīng)氨酸胞巧一憐酸的41.5kDa皿P 綴合物的合成
[0424]
[04巧]如Eur J 0巧化em.2000,1467-1482中所述產(chǎn)生神經(jīng)氨酸胞巧一憐酸。如實(shí)施例 16所述，將GSC替換成神經(jīng)氨酸胞巧一憐酸，進(jìn)行與皿P-醒的反應(yīng)。將神經(jīng)氨酸胞巧一憐酸 (32皿〇1)溶解在50mM HepesaOOmM NaCiaOmM CaCb緩沖液，pH 7.0緩沖液中，并直接添 加至干燥的41.5kDa皿P-苯甲醒(2.5皿〇1)中。輕輕旋轉(zhuǎn)混合物直到所有肥P-苯甲醒均溶 解。在接下來(lái)的2小時(shí)內(nèi)，分批添加氯基棚氨化鋼在Mi 11 iQ水中的1M溶液，W達(dá)到48mM的最 終濃度。隨后如實(shí)施例16所述通過(guò)透析去除過(guò)量的神經(jīng)氨酸胞巧一憐酸。使用神經(jīng)氨酸胞 巧一憐酸作為參考，在WatersX-化idge苯基柱（4.6mmx 250mm，5皿)上使用水乙臘體系 (在30min內(nèi)0-85%乙臘的線性梯度，含有0.1 %憐酸），通過(guò)HPLC驗(yàn)證神經(jīng)氨酸胞巧一憐酸 從內(nèi)室中的完全去除。隨后收集內(nèi)室物質(zhì)并將其冷凍干燥。通過(guò)該程序制成的試劑含有經(jīng) 由4-甲基苯甲酯基連接附接至唾液酸胞巧一憐酸的肥P聚合物。
[0426] 實(shí)施例21:具有4-甲基苯甲酯基連接的基于9-氨基-9-脫氧-N-乙酷基神經(jīng)氨酸胞 巧一憐酸的肥P綴合物的合成
[0427]
[0428] 如化r J Biochem 168,594-602(1987)中所述產(chǎn)生9-脫氧-氨基-N-乙酷基神經(jīng)氨 酸胞巧一憐酸。如實(shí)施例15所述，將GSC替換成9-氨基-9-脫氧-N-乙酷基神經(jīng)氨酸胞巧一憐 酸，進(jìn)行與肥P-醒的反應(yīng)。將9-氨基-9-脫氧-N-乙酷基神經(jīng)氨酸胞巧一憐酸（32μπιο1)溶解 在50mM胎pesaOOmM NaCiaOmM GaGb緩沖液，pH 7.0緩沖液中，并直接添加至干燥的 41.5kDa肥P-苯甲醒(2.5μπιο 1)中。輕輕旋轉(zhuǎn)混合物直到所有皿P-苯甲醒均溶解。在接下來(lái) 的2小時(shí)內(nèi)，分批添加氯基棚氨化鋼在Mi 11 iQ水中的1Μ溶液，W達(dá)到48mM的最終濃度。隨后 如實(shí)施例16所述通過(guò)透析去除過(guò)量的9-氨基-9-脫氧-N-乙酷基神經(jīng)氨酸胞巧一憐酸。使用 9-氨基-9-脫氧-N-乙酷基神經(jīng)氨酸胞巧一憐酸作為參考，在Waters X-化idge苯基柱 (4.6mm X 250mm，5皿)上使用水乙臘體系(在30min內(nèi)0-85%乙臘的線性梯度，含有0.1%憐 酸），通過(guò)HP1X驗(yàn)證9-氨基-9-脫氧-N-乙酷基神經(jīng)氨酸胞巧一憐酸從內(nèi)室中的完全去除。收 集內(nèi)室物質(zhì)并將其冷凍干燥。通過(guò)該程序制成的試劑含有經(jīng)由4-甲基苯甲酯基連接附接至 唾液酸胞巧一憐酸的肥P聚合物，并適合與去唾液酸FIX糖蛋白的糖綴合。
[0429] 實(shí)施例22:具有4-甲基苯甲酯基連接的基于2-酬基-3-脫氧-壬酬糖酸胞巧一憐酸 的HEP綴合物的合成
[0430]
[0431] 可W采用與實(shí)施例20和21中所示的方式類(lèi)似的方式，從唾液酸KDN開(kāi)始，制備肥P- 唾液酸胞巧一憐酸試劑。如Eur J化g化em 2000,1467-1482中所述進(jìn)行9-位的初始氨基 衍生化。如實(shí)施例16所述，將GSC替換成9-氨基-9-脫氧-2-酬基-3-脫氧-壬酬糖酸胞巧一憐 酸，進(jìn)行與皿P-醒的反應(yīng)。將9-氨基-9-脫氧-2-酬基-3-脫氧-壬酬糖酸胞巧一憐酸（3化 mol)溶解在50mM胎pesaOOmM化CiaOmM CaCb緩沖液，pH 7.0緩沖液中，并直接添加至 干燥的41.5kDa肥P-苯甲醒(2.5μπιο1)中。輕輕旋轉(zhuǎn)混合物直到所有肥P-苯甲醒均溶解。在 接下來(lái)的2小時(shí)內(nèi)，分批添加氯基棚氨化鋼在Mi 11 iQ水中的1Μ溶液，W達(dá)到48mM的最終濃 度。隨后如實(shí)施例15所述通過(guò)透析去除過(guò)量的9-氨基-9-脫氧-2-酬基-3-脫氧-壬酬糖酸胞 巧一憐酸。使用9-氨基-9-脫氧-2-酬基-3-脫氧-壬酬糖酸胞巧一憐酸作為參考，在Waters X-化idge苯基柱(4.6mm X 250mm，5皿)上使用水乙臘體系(在30min內(nèi)0-85%乙臘的線性梯 度，含有0.1 %憐酸），通過(guò)HPLC驗(yàn)證9-氨基-9-脫氧-N-乙酷基神經(jīng)氨酸胞巧一憐酸從內(nèi)室 中的完全去除。收集內(nèi)室物質(zhì)并將其冷凍干燥。通過(guò)該程序制成的試劑含有經(jīng)由4-甲基苯 甲酯基連接附接至唾液酸胞巧一憐酸的皿P聚合物，并適合與去唾液酸FIX糖蛋白的糖綴 厶 1=1 〇
[0432] 實(shí)施例23:在FIX缺乏的小鼠中靜脈內(nèi)給藥的60kDa皿P-[C]-FIX化162C)與rFIX 和40kDa陽(yáng)G-[N]-FIX相比的藥代動(dòng)力學(xué)
[0433] 在靜脈內(nèi)給予27nmol/kg(等于 1.5mg FIX/kg)的rFIX(BeneFIXK )、4〇kDa 陽(yáng)G- [N]-FIX或60kDa皿P-[C]-FIX化162C)后，在45只FIX缺乏的小鼠 F9(因子9)敲除化0)小鼠 (最初從D. W. S化f ford(北卡羅來(lái)納大學(xué))獲得的皿小鼠（B6.129P2-ratmlDws))中進(jìn)行藥代 動(dòng)力學(xué)研究。在尾靜脈中W5ml/kg施用劑量，并按稀疏采樣設(shè)計(jì)經(jīng)由毛細(xì)玻璃管從眶竇收 集血液，得到每只小鼠3個(gè)血液樣品，在給藥后0.08、0.25、0.5、1、4、7、17、24、30、42、48、54、 72、78、96小時(shí)的每個(gè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)Ξ只小鼠采樣。在將血漿送去分析之前，將血液用巧樣酸鹽 穩(wěn)定化，并用pH 7.4的化pes和BSA緩沖液1:4稀釋?zhuān)⒃?000RPM下離屯、5分鐘。
[0434] 采用抗原試驗(yàn)化0CI)、顯色活性試驗(yàn)W及通過(guò)凝固試驗(yàn)來(lái)測(cè)定FIX的血漿濃度，結(jié) 果示于圖6中并且藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)示于表2中。
[0435] 基本上按照P〇ulsen，F(xiàn)&Jensen KB，J Biomol Screen 2007; 12(2) :240-7描述的 人膜島素 LOCI建立hFIX的LOCI試驗(yàn)。簡(jiǎn)而言之，該試驗(yàn)為基于珠子的夾屯、式免疫測(cè)定，它具 有用于定量人血漿中的hFIX的寬分析范圍。進(jìn)行兩步反應(yīng)，將樣品與生物素化的抗FIX抗體 和用抗FIX抗體共價(jià)包被的珠子的混合物一起溫育。此后與用鏈霉親和素共價(jià)包被的珠子 一起溫育30min。對(duì)由珠子內(nèi)的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)生成的光進(jìn)行定量。FIX LOCI試驗(yàn)中使用的抗 體為內(nèi)部生產(chǎn)的Novo Nordisk單克隆抗FIX抗體和來(lái)自LifeSpan BioSciences，Inc.的多 克隆山羊抗hFIX抗體化S-B7226)。
[0436] 商業(yè)顯色測(cè)定試劑盒來(lái)自Hypen Biophen(Hy地en Biomed(#221805))。簡(jiǎn)而言之， 通過(guò)添加激活的因子X(jué)I(FXIa)、Ca2\憐脂和激活的因子II(FIIa)將來(lái)自樣品的FIX激活為 FIXa。隨后在化的存在下FIXa與提供的因子VIII(FVIII)和憐脂復(fù)合。Tenase復(fù)合物將因 子X(jué)(FX)激活成因子X(jué)a(FXa)。形成的FXa與SXa-11反應(yīng)并釋放pNAdpNA吸收405nm的光。除了 FIXW外，所有試劑均過(guò)量添加。因此，樣品中FIX越多，形成的FXa越多，并且釋放的pNA越 多。
[0437] 使用0stergaard等人Blood，2011; 118:2333-41描述的一期FIX凝固試驗(yàn)估計(jì)血 漿樣品中的凝結(jié)劑活性。該試驗(yàn)測(cè)量了依賴(lài)FIX活性的纖維蛋白凝塊形成時(shí)間。簡(jiǎn)而言之， 使用等量的測(cè)試樣品、人FIX缺乏的血漿、APTT試劑(Synthafax)和CaCl2(0.02M)。將血漿樣 品在含BSA的肥PES緩沖液中稀釋10或20倍。在血漿樣品（稀釋10倍）中定量的下限為約70U/ L。儀器和試劑來(lái)自 Inst;rumen1:ation Laboratories。
[0438] 表2-FIX變體在向F9-K0小鼠靜脈內(nèi)施用后的平均藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)
[0439]
[0441] 基于稀疏采樣，W非房室分析計(jì)算所述參數(shù)，n = 3Xmax:最大濃度，AUCo-?:曲線下 面積，Vz:分布體積，α:清除率，MRT:平均停留時(shí)間。
[0442] 在FIX缺乏的小鼠中，60kDa肥P-[C]-FIX巧162C)與40kDa陽(yáng)G-[N]-FIX的平均血 漿分布W及藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)是相當(dāng)?shù)模▓D6和表2)。根據(jù)該試驗(yàn)和終末消除階段高于定量下 限化L0Q)的數(shù)據(jù)點(diǎn)的數(shù)目，60W)a肥P-[C]-FIX化162C)的半衰期是rFIX的半衰期的約2至 10倍。與rFIX的清除率相比，60kDa肥P-[C]-FIX巧162C)和40kDa陽(yáng)G-[N]-FIX的清除率大 約降低了 20倍。
[0443] 圖6顯示了F9-K0小鼠中相對(duì)于時(shí)間的血漿rFIX和FIX綴合物濃度。通過(guò)基于抗原 的試驗(yàn)(a) W及分別基于凝固活性和顯色活性的試驗(yàn)(b)和(C)，隨時(shí)間測(cè)量該濃度。結(jié)果為 半對(duì)數(shù)圖中的平均值± SD，η = 3。
[0444] 實(shí)施例24:在FIX缺乏的小鼠中靜脈內(nèi)給予13kDa-、21kDa-、27kDa-和40kDa皿Ρ- FIX的藥代動(dòng)力學(xué)
[0445] 在靜脈內(nèi)給予27nmol/kg(等于 1.5mg FIX/kg)的 13kDa 皿P-[C]-FIX化 162C)、 21kDa 肥P-[N]-FIX、27kDa 肥P-[C]-FIX(E162C)、40kDa 皿P-[N]-FIX和40kDa 皿P-[C]- FIX化162C)后，在75只FIX缺乏的小鼠（F9-K0小鼠）中進(jìn)行藥代動(dòng)力學(xué)研究。該研究如實(shí)施 例23所述進(jìn)行。采用抗原試驗(yàn)化OClKa)和顯色活性試驗(yàn)(b)分析血漿，結(jié)果示于圖7中，并 且藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)示于表3(還包含來(lái)自實(shí)施例23的關(guān)于rFIX和60kDa HEP-[C]-FIX 化162C)的數(shù)據(jù)(斜體供比較）中。結(jié)果為半對(duì)數(shù)圖中的平均值±50，11 = 3。
[0446] FIX變體的清除率似乎隨著綴合的肥P聚合物的大小而降低。如在抗原試驗(yàn)中測(cè)得 的（參見(jiàn)表3)，與大小為13至60kDa的皿P聚合物綴合使半衰期與rFIX相比增加到32至40小 時(shí)。
[0447] 表3-與13、20、27、40和60403皿口聚合物綴合的。1乂在向。9-1(0小鼠靜脈內(nèi)施用后 的平均藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù) [044引
[0450]基于稀疏采樣，W非房室分析計(jì)算所述參數(shù)，n = 3Xmax:最大濃度，AUCo-w曲線下 面積，Vz:分布體積，α:清除率，MRT:平均停留時(shí)間。
[0451 ] 實(shí)施例25:60kDa肥P-[C]-FIX化162C)在F9-K0小鼠中的劑量響應(yīng)
[0452] 在F9-K0(因子IX敲除）小鼠（最初從D.W. Stafford(北卡羅來(lái)納大學(xué)）獲得的皿小 鼠（B6.129P2-F9tml Dws))的尾靜脈橫切(TVT)模型中比較60kDa皿P-[C]-FIX化162C)和 FIX(Novo Nordisk A/S)的作用。簡(jiǎn)而言之，向F9-K0小鼠給予劑量逐漸增加的60kDa肥P- [C]-FIX化162C)、rFIX或載體（5ml/kg;20mMHepes，150mMNaCl，0.5%BSApH7.4)，并在 10分鐘后通過(guò)在尾直徑2.5mm處進(jìn)行模板引導(dǎo)的左側(cè)尾靜脈橫切而引起出血。將尾部浸入 溫鹽水(37°C)中，W允許視覺(jué)記錄出血60min，之后通過(guò)分光光度法測(cè)量損失的血紅蛋白的 量來(lái)測(cè)定失血量。從而，通過(guò)W4000xg離屯、5min分離紅細(xì)胞。棄去上清液，并用血紅蛋白試 劑（ABX Lysebio;ABX Diagnostics no.906012，T;riolab A/S，B;roen化y，Denmark)裂解細(xì) 胞。通過(guò)W4000xg離屯、5min去除細(xì)胞碎片。在55化m下讀取樣品，并由標(biāo)準(zhǔn)曲線化emo化e校 準(zhǔn)物707037，HemoQie，Ve化aek，Denmark)確定血紅蛋白的總量。
[0453] 60kDa皿P-[C]-FIX化162C)顯著地且劑量依賴(lài)性地減少了失血，在O.lmg/kg下達(dá) 到歸一化（口<0.001;11 = 8)。運(yùn)與評(píng)1乂的效果相當(dāng)。因此，6040曰皿？-[(：]斗1乂化162〇和 rFIX的效力分別與0.012和0.03mg/kg60kDa肥P-[C]-FIX巧162C)和rFIX的估算的邸50相當(dāng) (p = 0.38;圖8;表4)。圖8顯示了60kDa 肥P-[C]-FIX E162C(FIX-肥P)和rFIX如何劑量依賴(lài) 性地且顯著地減少F9-K0小鼠在尾靜脈橫切后的失血，它們具有相當(dāng)?shù)男ЯΑｎ?lèi)似地，60W)a 肥P-[C]-FIX化162C)和巧IX對(duì)出血時(shí)間的影響是相當(dāng)?shù)?，顯著且劑量依賴(lài)性地縮短了出血 時(shí)間，而兩種化合物的抓5〇(分別為0.009和0.024mg/kg;p = 0.18;圖9;表4)沒(méi)有顯著性差 異。圖9顯示了60kDa皿P-[C]-FIX E162C(FIX-肥P)和rFIX如何劑量依賴(lài)性地且顯著地縮 短F9-K0小鼠在尾靜脈橫切后的出血時(shí)間，它們具有相當(dāng)?shù)男Я?。F9-K0小鼠在誘導(dǎo)出血前 lOmin 給藥。FIX-肥 P 和 rFIX 的邸日日分別為 0.009mg/kg 和0.024111旨/1^(9 = 0.18)。*、**和***分 別表示與接受載體的血友病對(duì)照相比在P<0.05、p<0.01和p<0.001下的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差 異。數(shù)據(jù)為平均值±561式9-1(0小鼠在誘導(dǎo)出血前l(fā)Omin給藥。FIX-HEP和rFIX的抓50分別為 0.012mg/kg和0.030mg/kg(p = 0.38)。*和***分別表示與接受載體的血友病對(duì)照組相比在P <0.05和p<0.001下的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異。數(shù)據(jù)為平均值±861。
[0454] 表4-在F9-K0小鼠中60kDa肥P-[C]-FIX E162C(FIX-肥P)和rFIX劑量依賴(lài)性地減 少了失血和出血時(shí)間。
[0455]
[0456] 60kDa皿P-[C]-FIX E162(X皿P-FIX)和rFIX劑量依賴(lài)性地且顯著地減少了F9-K0 小鼠在尾靜脈橫切之后的失血和出血時(shí)間。F9-K0小鼠在誘導(dǎo)出血前l(fā)Omin給藥。*、**和*** 分別表示與接受載體的血友病對(duì)照組相比在P<0.05、p<0.01和p<0.001下的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著 性差異。'化em'表示用對(duì)照載體處理的F9-K0小鼠。C57/化表示用對(duì)照載體處理的野生型小 鼠。
[0457] 實(shí)施例26:40W)a肥P-[N]-FIX在F9-K0小鼠中的劑量響應(yīng)
[045引在F9-K0(因子IX敲除）小鼠（最初從D.W.S化fford(北卡羅來(lái)納大學(xué))獲得的B型血 友病小鼠（B6.129P2-F9tmlDws))的尾靜脈橫切（TVT)模型中比較40kDa皿P-[N]-FIX和 rFIX(Novo Nordisk A/S)的作用。簡(jiǎn)而言之，向F9-K0小鼠給予劑量逐漸增加的40kDa肥P- [N]-FIX、rFIX或載體（5ml/kg; lOmM組氨酸，150mM 化C1，5mM CaCb，0.005 % 吐溫80，pH 6.4)，并在10分鐘后通過(guò)在尾直徑2.5mm處進(jìn)行模板引導(dǎo)的左側(cè)尾靜脈橫切而引起出血。將 尾部浸入溫鹽水(37°C)中，W允許視覺(jué)記錄出血60min，之后通過(guò)分光光度法測(cè)量損失的血 紅蛋白的量來(lái)測(cè)定失血量。從而，通過(guò)W4000xg離屯、5min分離紅細(xì)胞。棄去上清液，并用血 紅蛋白試劑（ABX Lysebio;ABX Dia即ostics no.906012，T;riolab A/S，B;roendby， Denmark)裂解細(xì)胞。通過(guò)W4000xg離屯、5min去除細(xì)胞碎片。在550nm下讀取樣品，并由標(biāo)準(zhǔn) 曲線巧emo化e校準(zhǔn)物707037，Hemo化e，Ve化aek，Denmark)確定血紅蛋白的總量。
[0459] 40kDa肥P-[N]-FIX和rFIX均顯著且劑量依賴(lài)性地減少了失血，在0.2mg/kg時(shí)達(dá) 到完全響應(yīng)。通過(guò)雙因素 AN0VA分析，沒(méi)有觀察到在所述化合物的作用之間有顯著性差異(P =0.1924)，但檢測(cè)到顯著的。<0.0001)劑量效應(yīng)。因此，4040曰肥?-^]斗凹和巧^的效 力是相當(dāng)?shù)模曳謩e在估算的抓50值〇.〇32mg/kg與0.027mg/kg之間沒(méi)有顯著性差異（p = 0.69;圖10,表5)。
[0460] 圖10顯示了40kDa皿P-[N]-FIX和rFIX如何劑量依賴(lài)性地且顯著地減少F9-K0小 鼠在尾靜脈橫切后的失血，它們具有相當(dāng)?shù)男ЯΑ?br>[0461 ] F9-K0小鼠在誘導(dǎo)出血前l(fā)Omin給藥。40kDa HEP-[N]-FIX和rFIX的抓50分別為 0.032mg/kg和0.027mg/kg(p = 0.67)。*林和*林*分別表示與接受載體的血友病對(duì)照相比在 p<0.001和p<0.0001下的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異。數(shù)據(jù)為平均值± SEM。
[0462] 類(lèi)似地，40kDa HEP-[N]-FIX和rFIX對(duì)出血時(shí)間的影響是相當(dāng)?shù)模和ㄟ^(guò)雙因素 AN0VA，沒(méi)有觀察到在所述化合物的作用之間有顯著性差異(P = 0.82)，但檢測(cè)到顯著的（P <0.0001)劑量效應(yīng)。因此，觀察到40403肥?-^]斗^和評(píng)^顯著地且劑量依賴(lài)性地縮短 了出血時(shí)間，其中估算的邸5誠(chéng)有顯著性差異(分別為0.028和0.034mg/kg;p = 0.57;表5)。
[0463] 表5-在F9-K0小鼠中40kDa皿P-[N]-FIX和rFIX劑量依賴(lài)性地減少了失血和出血 時(shí)間
[0464]
[04化]**、***和*林*分別表示與接受載體的血友病對(duì)照組相比在ρ<0.01、ρ<0.0(Π 和P <0.001下的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異。'化em'表示用對(duì)照載體處理的F9-K0小鼠。
[0466] 實(shí)施例27:肥P-因子IX綴合物在一期凝固試驗(yàn)中的性能
[0467] 根據(jù)使用的aPTT試劑，蛋白質(zhì)的聚乙二醇化可能影響在一期凝固試驗(yàn)中的凝固時(shí) 間化eong等人J Thromb Haemost 2011;9(增刊2):379(P-TU-223))，并且對(duì)于N9-GP (nonacog beta pegol;糖基聚乙二醇化重組FIX),聚乙二醇化可能導(dǎo)致此類(lèi)試驗(yàn)中大的變 異性。
[0468] 如下所述在五個(gè)不同的一期凝固試驗(yàn)和一個(gè)兩期顯色試驗(yàn)中評(píng)估肥P-FIX綴合物 相對(duì)于Benenxi"和N9-GP的性能。將Ξ種濃度（分別為5、15和45nM)的W下FIX化合物滲 加到人 FIX 耗盡的血漿（Affinity Biologicals)中：2化Da 皿 P-[C]-FIX 化 162C)、40kDa 肥P-[N]-FIX、40kDa HEP-[C]-FIX化 162C)、60kDa 肥？-[(：]斗1乂化162〇、腳-6口和 BeneFIX'-'。根據(jù)制造商的說(shuō)明（Hyphen Biomed)，使用兩期顯色試驗(yàn)，Biophen因子IX，測(cè) 量滲加的樣品的FIX活性。將該結(jié)果定義為100%活性，因?yàn)樵擄@色試驗(yàn)對(duì)于聚合物附接是 無(wú)色的（neutral)。
[0469] 使用W下aPTT試劑在一期凝固試驗(yàn)中測(cè)量相同樣品的凝固活性:DadeA地n?FS (Siemens)、STAPTT面（Stago)、APTT SP(ILS)、Syn化afax'gi(ILS)、Synthasii昏（ILS)。簡(jiǎn) 而言之，使用等量的測(cè)試樣品、人FIX缺乏的血漿、APTT試劑和化Ch(〇.〇2M)。該試驗(yàn)測(cè)量了 在來(lái)自ILS的血凝分析儀上測(cè)得的依賴(lài)FIX活性的纖維蛋白凝塊形成時(shí)間。使用已針對(duì)國(guó)際 血漿標(biāo)準(zhǔn)(NIBSC)校準(zhǔn)的一組正常人血漿（ILS)作為校準(zhǔn)物。將測(cè)得的活性與顯色試驗(yàn)中測(cè) 得的活性進(jìn)行比較并W顯色活性的百分比給出結(jié)果。
[0470] 結(jié)果:如通過(guò)顯色方法所確定的，通過(guò)計(jì)算在滲加的人樣品中FIX活性的恢復(fù)率來(lái) 評(píng)估HEP-FIX綴合物在一期凝固試驗(yàn)中的性能。結(jié)果列于表6中并在圖11中示出。 BeneFIX"的性能正如預(yù)期;觀察到一些變化，但采用全部五種aPTT試劑的FIX活性的恢復(fù) 率均為89-122% (即33個(gè)百分點(diǎn)）。另一方面，在使用五種aPTT試劑的情況下，N9-GP活性的 恢復(fù)率顯示大的變異性和30 %至553 %的恢復(fù)率范圍（即523個(gè)百分點(diǎn)）。肥P-FIX綴合物活 性的恢復(fù)率在32-147%范圍內(nèi)（即115個(gè)百分點(diǎn)），并且對(duì)于運(yùn)五種aPTT試劑，肥P-FIX綴合 物的試驗(yàn)性能與N9-GP的試驗(yàn)性能相比因此得到改善。皿P聚合物的長(zhǎng)度和FIX上的聚合物 附接點(diǎn)均不會(huì)很大地影響試驗(yàn)性能。表6和圖11顯示了在滲加的人FIX缺乏的血漿中的FIX 活性相對(duì)于顯色活性的恢復(fù)率。將Ξ種濃度(分別為5、15和45nM)的化合物滲加到人FIX耗 盡的血漿中，并使用Biophen Hypen顯色試驗(yàn)和在一期凝固試驗(yàn)中的五種指定的aPTT試劑 進(jìn)行分析。結(jié)果W凝固活性占顯色活性的百分比給出，并且為平均值+/-SD，n = 3。在所有試 驗(yàn)中針對(duì)正常人血漿校準(zhǔn)物(ILS)測(cè)量活性。
[0471 ]表6-在滲加的人FIX缺乏的血漿中的FIX活性相對(duì)于顯色活性的恢復(fù)率。
[0472]
[0474] 實(shí)施例28:40W)a肥P-[N]-FIX在F9-K0小鼠中的作用持續(xù)時(shí)間
[0475] 在F9-K0(因子IX敲除）小鼠（最初從D.W.S化fford(北卡羅來(lái)納大學(xué))獲得的B型血 友病小鼠（B6.129P2-F9tmlDws))的尾靜脈橫切（TVT)模型中比較40kDa皿P-[N]-FIX和 rFIX(Novo Nordisk A/S)的作用持續(xù)時(shí)間。簡(jiǎn)而言之，向F9-K0小鼠給予0.4mg/kg(約80IU/ kg)的40kDa肥P-陽(yáng)]-FIX，等效劑量的rFIX或載體（5ml/kg; lOmM組氨酸，150mM化C1，5mM CaCl2，0.005 %吐溫80，pH 6.4)。在給藥后0、48、72、120或168小時(shí)通過(guò)在尾直徑2.5mm處進(jìn) 行模板引導(dǎo)的左側(cè)尾靜脈橫切來(lái)引起出血。將尾部浸入溫鹽水(37°C)中，W允許視覺(jué)記錄 出血60min，之后通過(guò)分光光度法測(cè)量損失的血紅蛋白的量來(lái)測(cè)定失血量。從而，通過(guò)W 4000xg離屯、5min分離紅細(xì)胞。棄去上清液，并用血紅蛋白試劑（ABX Lysebio;ABX Dia即osticsno.906012，T;riolabA/S，B;roen化y，Denmark)裂解細(xì)胞。通過(guò)?4000xg離屯、 5min去除細(xì)胞碎片。在550nm下讀取樣品，并由標(biāo)準(zhǔn)曲線化emoCue校準(zhǔn)物707037，HemoCue， Ve化aek，Denmark)確定血紅蛋白的總量。
[0476] 觀察對(duì)失血的時(shí)間依賴(lài)的效應(yīng)（圖12);通過(guò)用于多重比較的采用Bonferroni校正 的單因素 AN0VA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析(表7)。與載體組相比，在給藥后0小時(shí)，40W)a肥P-陽(yáng)]-FIX和 rFIX均顯著(P<0.0001)減少了在急性情況下的失血。在給藥后48小時(shí)(P = 0.0012)和72小 時(shí)(P = 0.0028)，用40k-HEP-[N]-FIX處理的動(dòng)物的出血也顯著少于載體處理的動(dòng)物，而用 rFIX處理的動(dòng)物卻不是運(yùn)樣。在注射后72小時(shí)，出血響應(yīng)在所述化合物之間顯著不同（P = 0.020)。在給藥后168小時(shí)，不再能檢測(cè)到運(yùn)兩種化合物的作用。
[0477] 類(lèi)似地，觀察40kDa肥P-[N]-FIX和巧IX對(duì)出血時(shí)間的影響（表7)。與載體組相比， 在給藥后0小時(shí)，40kDa肥P-[N]-FIX和rFIX均顯著(P<0.0001)縮短了出血時(shí)間，并且在給 藥后48小時(shí)（P = 0.0060)和72小時(shí)(P = 0.0041)，40kDa-皿P-[N]-FIX縮短了出血時(shí)間，而 rFIX卻不能。在注射后72小時(shí)，出血時(shí)間在所述化合物之間顯著不同（P = 0.022)。在給藥后 168小時(shí)，不再能檢測(cè)到運(yùn)兩種化合物的作用。
[0478] 因此，40kDa-HEP-[N]-FIX和rFIX在給藥后立即表現(xiàn)出相當(dāng)?shù)闹寡饔?，然?40kDa-HEP-[N]-FIX的作用比相當(dāng)劑量的rFIX持續(xù)顯著更長(zhǎng)的時(shí)間。
[0479] 雖然本文已說(shuō)明并描述了本發(fā)明的某些特征，但本領(lǐng)域普通技術(shù)人員現(xiàn)將想到許 多修改、替換、變化和等同項(xiàng)。因此，應(yīng)當(dāng)理解，所附權(quán)利要求旨在涵蓋落入本發(fā)明的真正范 圍之內(nèi)的所有運(yùn)樣的修改和變化。
[0480] 表7-0.4mg/kg劑量的40kDa肥P-[N]-FIX對(duì)失血和出血時(shí)間的作用比相當(dāng)劑量的 rFIX具有顯著更長(zhǎng)的持續(xù)時(shí)間
[0481]
[0482] 等效劑量(0.4mg/kg或約80IU/kg)的40kDa肥P-[N]-FIX或rFIXW時(shí)間依賴(lài)的方 式減少了F9-K0小鼠在尾靜脈橫切后的失血和出血時(shí)間。**、***和****分別表示與接受載 體的血友病對(duì)照組相比在p<〇. 01、p<〇 .001和p<〇 .0001下的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異。'化em' 表示用對(duì)照載體處理的F9-K0小鼠 。NT =未測(cè)試。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種綴合物，其包含因子IX多肽、連接部分和肝素原聚合物，其中連接所述因子IX多 肽與所述肝素原聚合物的所述連接部分包含X，如下所示： [肝素原聚合物]-[X]-[因子IX多肽] 其中X包含將根據(jù)以下式1的部分與所述因子IX多肽連接的唾液酸衍生物：2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的綴合物，其中所述唾液酸衍生物為根據(jù)以下式2的甘氨?；?液酸：并且其中式1的部分與式2的末端-NH柄連接。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的綴合物，其中所述 [肝素原聚合物]-[X]- 包含以下式3所示的結(jié)構(gòu)片段：其中η為5到450的整數(shù)。4. 一種綴合物，其包含因子IX多肽和肝素原聚合物，其中所述肝素原聚合物具有在5至 IOOkDa范圍內(nèi)的分子量。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的綴合物，其中所述肝素原聚合物具有在13至60kDa范圍內(nèi)的分 子量。6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的綴合物，其中所述肝素原聚合物具有在27至40kDa范圍內(nèi)的分 子量。7. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的綴合物，其中所述肝素原聚合物的分子量為40kDa+/-10%。8. -種藥物組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述的綴合物。9. 與因子IX多肽綴合的肝素原聚合物在aPTT試驗(yàn)中的用途，其中因子IX活性的恢復(fù)率 的試驗(yàn)間變異性小于523個(gè)百分點(diǎn)。10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的與因子IX多肽綴合的肝素原聚合物的用途，其中因子IX活性 的恢復(fù)率的試驗(yàn)間變異性不大于115個(gè)百分點(diǎn)。11. 根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述的綴合物，其用作藥物。12. 根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述的綴合物，其用于B型血友病的治療。13. 根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述的綴合物，其用于B型血友病的預(yù)防性治療。14. 一種將肝素原聚合物與因子IX多肽綴合的方法，其包括以下步驟： a) 使包含反應(yīng)性胺的肝素原聚合物[HEP-NH]與激活的4-甲?；郊姿岱磻?yīng)，以產(chǎn)生以 下式4的化合物，其中所述[HEP-NH]為用末端伯胺官能化的HEP聚合物， b) 使式4的化合物與CMP激活的唾液酸衍生物在還原條件下反應(yīng)，以及 c) 將步驟b)中獲得的化合物與所述因子IX多肽上的聚糖綴合。15. 使用根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法能夠獲得的綴合物。
【文檔編號(hào)】A61P7/02GK106029106SQ201580008256
【公開(kāi)日】2016年10月12日
【申請(qǐng)日】2015年2月12日
【發(fā)明人】C.貝倫斯, P.迪安格里斯, F.M.哈爾勒
【申請(qǐng)人】諾和諾德保健股份有限公司