去甲青藤堿在制備鎮(zhèn)痛藥物中的應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及去甲青藤堿在制備鎮(zhèn)痛藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明通過制備醋酸扭體模型、完全弗氏佐劑致后足炎癥疼痛模型以及切口術(shù)后疼痛模型，造模后給予去甲青藤堿進行治療，以腹腔注射方式使用，當(dāng)然也可以采用其它給藥方式，給藥用量為10～40mg/kg，證實去甲青藤堿對于化學(xué)刺激引發(fā)的疼痛、炎癥疼痛以及術(shù)后疼痛等都具有良好鎮(zhèn)痛作用，無鎮(zhèn)靜效應(yīng)，且長期給藥無耐受性、成癮性等不良反應(yīng)產(chǎn)生。和青藤堿相比，其具有更短的起效時間以及更強的鎮(zhèn)痛活性。提示其可以用于臨床上各種疼痛的藥物治療，尤其是炎癥疼痛以及術(shù)后疼痛。
【專利說明】
去甲青藤堿在制備鎮(zhèn)痛藥物中的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及去甲青藤堿在制備鎮(zhèn)痛藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 疼痛是臨床上最常見的癥狀，也是當(dāng)今困擾人類健康的嚴(yán)重問題之一。慢性疼痛 會給患者帶來持久、難W忍受的痛苦，是致病、致殘、致死的重要原因。疼痛的治療是目前一 個非?；钴S的研究領(lǐng)域，臨床上廣泛使用的鎮(zhèn)痛藥物常伴有嚴(yán)重的毒副作用。例如傳統(tǒng)的 非醬體類抗炎藥(NSAIDs)具有胃腸道損傷、肝腎功能損害等不良反應(yīng)。阿片類鎮(zhèn)痛藥如嗎 啡，美沙酬，芬太尼等長期使用會有呼吸抑制，依賴，成癒，耐受等副作用。雖然目前臨床上 可供治療疼痛藥物較多，但其療效的有限性和不良反應(yīng)令疼痛的治療并不樂觀(Gilron I， Jensen TS,Dickenson AH.Combination pharmacotherapy for management of chronic pain:f;rom bench to bedside[J].Lancet Neurol,2013,12(11):1084-1095.)。據(jù)報道，目 前所有的鎮(zhèn)痛治療措施僅能使約一半的的慢性疼痛患者降低30%左右的疼痛(Turk DC, Wilson HD,Cahana A.Treatment of chronic non-cancer pain[J]. Lancet,2011,377 (9784) :2226-2235.)。因此，尋找新型有效的、不良反應(yīng)小，無耐受性及成癒性的鎮(zhèn)痛藥物， 具有重要的社會和經(jīng)濟學(xué)意義。在鎮(zhèn)痛藥物的研發(fā)中，中草藥來源的天然物質(zhì)已經(jīng)顯示出 藥效良好、無成癒性、不良反應(yīng)少及資源豐富等優(yōu)勢，引起人們廣泛的重視。
[0003] 青藤堿(sinomenine)是防已科植物青風(fēng)藤的主要活性成分，結(jié)構(gòu)類似嗎啡，具有 抗炎、調(diào)節(jié)免疫、鎮(zhèn)痛、降壓、抗屯、律失常等藥理活性，臨床已有成品用于治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎 及屯、律失常等(朱±龍，陳迪創(chuàng)，李勇，等.青藤堿最新研究進展[J].吉首大學(xué)學(xué)報（自然科 學(xué)版），2011,32(05) :95-100.)。近年來，有學(xué)者報道青藤堿對炎癥性疼痛W及光化學(xué)性坐 骨神經(jīng)損傷導(dǎo)致的神經(jīng)病理性疼痛曬齒類動物模型均具有鎮(zhèn)痛效應(yīng)（Gao T，Hao J， WiesenfeId-Hall in Z,et al.Analgesic effect of sinomenine in rodents after inflammation and nerve injury[J] .Eur J Pharmacol ,2013,721(1-3) :5-ll.)。另夕恃 鵬和張美玉等亦證實青藤堿對部分坐骨神經(jīng)損傷(SSNI)模型大鼠神經(jīng)源性疼痛有鎮(zhèn)痛作 用(李鵬，張美玉，王丹巧，等.青藤堿對SSNI模型大鼠鎮(zhèn)痛效應(yīng)及腦內(nèi)興奮性氨基酸遞質(zhì)的 影響[J].中國藥理學(xué)通報，2012，28( 10): 1365-1369.張美玉，李鵬，王丹巧，等.青藤堿對 SSNI模型大鼠鎮(zhèn)痛效應(yīng)和紋狀體細胞外液單胺類遞質(zhì)的影響[J].中國中藥雜志，2013，38
[4] :597-604.)。本發(fā)明人所在的課題組亦報道了青藤堿對慢性坐骨神經(jīng)壓迫性損傷神經(jīng) 痛模型具有鎮(zhèn)痛效應(yīng)（Zhu Q,Sun Y,Zhu J,et al.Antinociceptive effects of sinomenine in a rat model of neuropathic pain[J].Sci Rep,2014,4:7270)。
[0004]但是青藤堿生物半衰期短，臨床上其用藥劑量偏大，有過敏性副作用，因此本領(lǐng)域 科研人員也嘗試對青藤堿的A、B、C和D四個環(huán)上各活性位點進行結(jié)構(gòu)修飾，在已合成的眾多 青藤堿衍生物中，部分衍生物的生物活性優(yōu)于青藤堿(湯建，趙焊，李慶慶，陳婷，青藤堿衍 生物的研究進展[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，201UB12) :209-213)。例如楊建等發(fā)現(xiàn)W青藤 堿為先導(dǎo)化合物，在其A環(huán)4位酪徑基引入親脂性基團時有利于增強其鎮(zhèn)痛活性(楊健，羅 烈，趙巍，等.青藤堿衍生物的合成及其鎮(zhèn)痛抗炎作用定量構(gòu)效關(guān)系[J].武漢大學(xué)學(xué)報(醫(yī) 學(xué)版），2〇〇9,3〇(1):29-32)。葉仙蓉等^青藤堿為先導(dǎo)物，對(：環(huán)進行結(jié)構(gòu)改造，發(fā)現(xiàn)70-甲 氧基二氨青藤堿鎮(zhèn)痛作用較強(葉仙蓉，顏克序，吳克美，等.青藤堿衍生物的合成及其抗炎 鎮(zhèn)痛活性[J].藥學(xué)學(xué)報，2004,39(3): 180-183)。
[0005] 去甲青藤堿(N-demethylsinomenine)，化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下式（I)所示：
[0006]
[0007]經(jīng)文獻檢索得知，此化合物亦可由青風(fēng)藤的莖葉中分離而得，并且對過氧化氨導(dǎo) 致的細胞損傷具有保護作用，說明其具有抗氧化作用（Bao GH，Qin GW，Wang R，et al.Morphinane alkaloids with cell protective effects from Sinomenium acutum [J] .J化t Prod ,2005,68(7): 1128-30.)。另有文獻報道此化合物可由青藤堿在大鼠 W及 人體內(nèi)代謝而成（Cheng WM,Qiu F,Yao XS.Three major urinaiT metabolites of sinomenine in rats[J].J Asian 化t Prod Res,2007,9(1):13-18.Yao YM'Cao W'Cao YJ.Effect of sinomenine on human cytochrome P450 activity[J].Clin Chim Acta.2007，379(1-2):113-8.)。
[000引但是目前沒有任何文獻資料W及相關(guān)專利表明去甲青藤堿具有鎮(zhèn)痛活性，可用于 疼痛的藥物治療。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 為了解決目前治療疼痛藥物的有效性低、不良反應(yīng)大或有耐受性及成癒性的問 題，在青藤堿的鎮(zhèn)痛活性基礎(chǔ)上，獲得更好的藥效學(xué)特征的青藤堿衍生物，本發(fā)明的目的在 于提供青藤堿衍生物一去甲青藤堿在制備治療疼痛藥物中的應(yīng)用。
[0010] 為了獲得更好的藥效學(xué)特征，例如更強的鎮(zhèn)痛活性、更快的起效時間或者更長的 維持時間，本發(fā)明人所在的課題組W青藤堿為母核，合成了 17-N-去甲基青藤堿[7,8-二去 氨-4-徑基-3，7-二甲氧基-(9α，13α，14α)-17-嗎啡喃-6-酬]，分子式為Cl姐2iN〇4,其命名為 去甲青藤堿(N-demethylsinomenine)，化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下式（I)所示：
[0011]
[0012] 本發(fā)明采用醋酸腹腔注射導(dǎo)致內(nèi)臟疼痛扭體模型、完全弗氏佐劑(CFA)后足注射 致炎癥疼痛模型W及切口手術(shù)后疼痛模型，將去甲青藤堿和青藤堿進行平行試驗，意外地 發(fā)現(xiàn)去甲青藤堿具有良好的廣泛鎮(zhèn)痛效應(yīng)，和青藤堿相比，具有更短的起效時間W及更強 的鎮(zhèn)痛活性，且無明顯鎮(zhèn)靜副作用W及耐受性產(chǎn)生，本發(fā)明提示去甲青藤堿可W用于臨床 上各種疼痛的藥物治療，尤其是炎癥疼痛W及術(shù)后疼痛。
[0013] 本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
[0014] 本發(fā)明提供了去甲青藤堿在制備鎮(zhèn)痛藥物中的應(yīng)用。
[0015] 本發(fā)明所述的去甲青藤堿具有W上式(I)結(jié)構(gòu)的化合物，或其藥學(xué)上可接受的鹽。
[0016] 所述的藥學(xué)上可接受的鹽，為鹽酸鹽、硫酸鹽、憐酸鹽，或醋酸鹽等。
[0017]所述的藥物中，去甲青藤堿的含量為0. l-99wt %。
[0018] 所述的藥物W去甲青藤堿作為唯一活性成份。
[0019] 本發(fā)明所述的去甲青藤堿的合成方法可參考文獻(楊帆，管忠俊，柴曉云，等.青藤 堿N-取代衍生物的合成及抑制NF-KB轉(zhuǎn)錄活性作用[J].第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2015,35(4): 413-417.)中報道的第一步反應(yīng)，合成路線（即反應(yīng)流程式)如下：
[0020]
[0021] 合成步驟包括：
[0022] (1)將漠化氯4.24g(0.04mol)溶于盛有200血經(jīng)無水處理的氯仿的Ξ頸瓶中，磁力 攬拌下滴入含量為0.2mol/L的青藤堿(化合物1)氯仿溶液lOOmL，40min內(nèi)滴完，加熱回流反 應(yīng)地。用5%的肥1調(diào)節(jié)抑為5,水洗3次，無水硫酸鋼干燥，過濾，濃縮得類白色固體，即為17- 脫甲基-17-氯基青藤堿(化合物2)。
[00剖 （2)將上述未經(jīng)純化的化合物2在25 %硫酸溶液70mL中加熱回流化，反應(yīng)完畢，飽 和碳酸鋼水溶液中和并調(diào)節(jié)pH為9，氯仿300mL萃取3次，合并氯仿層，無水硫酸鋼干燥，過 濾，蒸除溶劑，硅膠柱層析即得棟色粉末(化合物3)，經(jīng)質(zhì)譜與核磁共振(ih-nmr、i3c-nmr)證 實其結(jié)構(gòu)為17-N-去甲基青藤堿。然后經(jīng)高效液相色譜法化PLC)進行制備，得到純度為98% 的目標(biāo)產(chǎn)物。
[0024] 本發(fā)明提供了去甲青藤堿在制備治療疼痛藥物中的應(yīng)用，尤其可適用于炎癥性疼 痛W及術(shù)后疼痛，當(dāng)然也可適用臨床上其他類型的疼痛。
[0025] 本發(fā)明所述的小鼠醋酸扭體模型目前被普遍用于鎮(zhèn)痛活性藥物的初步篩選（高 華.藥理學(xué)實驗方法[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2012:217.)。
[0026] 本發(fā)明所述的"炎癥性疼痛"，是指由于創(chuàng)傷、細菌或病毒性感染W(wǎng)及外科手術(shù)引 起外周組織損傷導(dǎo)致炎癥時所發(fā)生的疼痛。CFA致炎癥模型是代表性的佐劑關(guān)節(jié)炎癥性疼 痛模型，可模擬臨床上的自身免疫性炎癥疾病如風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的疼痛（汪偉，王文，武勝昔， 等.炎癥性痛和神經(jīng)病理性痛模型[J].神經(jīng)解剖學(xué)雜志，2007，23( 1): 93-98.)。
[0027] 本發(fā)明所述的"術(shù)后疼痛"，是機體對疾病本身及手術(shù)造成的組織損傷的一種復(fù)雜 的病理生理反應(yīng)，表現(xiàn)為屯、理和行為上一系列反應(yīng)W及情感上一種不愉快的經(jīng)歷(張傳漢. 臨床疼痛治療指南[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2008:502.)。
[0028] 本發(fā)明所述的"術(shù)后疼痛"，包括手術(shù)后切口疼痛、原發(fā)疾病部位疼痛等。本發(fā)明所 述的小鼠后足切口術(shù)后疼痛動物模型已被國際上普遍接受為代表性的術(shù)后疼痛的模型 (Pogatzki EM,Raja SN.A mouse model of incisional pain[J].Anesthesiology,2003, 99(4):1023-27.)〇
[0029] 所述的藥物，還包含去甲青藤堿的藥物組合物。
[0030] 所述的藥物組合物，可W采用本領(lǐng)域常規(guī)制備方法制備成醫(yī)學(xué)藥劑學(xué)上常用的藥 物制劑。
[0031] 所述的藥物制劑可W為顆粒劑、片劑、丸劑或者液體制劑等。
[0032] 所述的藥物制劑中還加入了藥學(xué)上可接受的載體、輔料。
[0033] 本發(fā)明的藥物制劑通常W腹腔注射方式使用，當(dāng)然也可W采用其它給藥方式。
[0034] 較優(yōu)的，去甲青藤堿急性(單次)給藥一般用量為10~40mg/kg，慢性(反復(fù)多次)給 藥用量為40mg/kg。
[0035] 本發(fā)明的藥物制劑去甲青藤堿單次急性給藥能夠有效減少醋酸注射后小鼠扭體 次數(shù)，減輕CFA注射后的大鼠炎癥性疼痛W及小鼠切口手術(shù)后疼痛，長期慢性給藥亦能緩解 切口術(shù)后的疼痛，無鎮(zhèn)靜副作用、而且沒有觀察到耐受性W及成癒性產(chǎn)生。和青藤堿相比， 去甲青藤堿具有更短的起效時間和更強的鎮(zhèn)痛活性。
[0036] 本發(fā)明首次報道了去甲青藤堿具有鎮(zhèn)痛活性。本發(fā)明也為臨床治療疼痛，包括炎 癥性疼痛、術(shù)后疼痛、W及臨床上其他類型的疼痛，尋找到更強的鎮(zhèn)痛活性、更快的起效時 間的新的藥物。
【附圖說明】
[0037] 圖1是去甲青藤堿與青藤堿對醋酸扭體行為作用的藥效學(xué)特征比較。圖1A為去甲 青藤堿與青藤堿(40mg/kg)在不同預(yù)處理時間下的鎮(zhèn)痛活性，代表其藥效經(jīng)時過程；圖1B為 去甲青藤堿與青藤堿不同劑量下（10-40mg/kg)的鎮(zhèn)痛活性，代表其量效關(guān)系。數(shù)據(jù)W平均 值(mean) ±標(biāo)準(zhǔn)誤（S.E.M)表示；黑色實屯、填充點表示其與相對應(yīng)的賦形劑組數(shù)據(jù)相比具 有統(tǒng)計學(xué)差異(P<〇.〇5)。與40mg/kg劑量青藤堿組比較，午<0.05。
[0038] 圖2是去甲青藤堿對CFA炎癥疼痛的鎮(zhèn)痛效應(yīng)。去甲青藤堿10~40mg/kg單次給藥 對足底注射CFA疼痛模型大鼠機械性痛闊值的影響，數(shù)據(jù)W平均值(mean) ±標(biāo)準(zhǔn)誤(S.E.M) 表示;黑色實屯、填充點表示其與相對應(yīng)的賦形劑組數(shù)據(jù)相比具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<〇. 05)。
[0039] 圖3是去甲青藤堿單次給藥對切口手術(shù)后疼痛的鎮(zhèn)痛效應(yīng)。去甲青藤堿10~40mg/ kg單次給藥對切口術(shù)后疼痛模型小鼠機械性痛闊值的影響;數(shù)據(jù)W平均值(mean) ±標(biāo)準(zhǔn)誤 (S.E.M)表示；黑色實屯、填充點表示其與相對應(yīng)的賦形劑組數(shù)據(jù)相比具有統(tǒng)計學(xué)差異(P< 0.05)。
[0040] 圖4是去甲青藤堿重復(fù)給藥對切口手術(shù)后疼痛的鎮(zhèn)痛效應(yīng)。去甲青藤堿40mg/kg慢 性給藥對對切口術(shù)后疼痛模型小鼠機械性痛闊值的影響；數(shù)據(jù)W平均值(mean) ±標(biāo)準(zhǔn)誤 (S.E.M)表示；黑色實屯、填充點表示其與相對應(yīng)的賦形劑組數(shù)據(jù)相比具有統(tǒng)計學(xué)差異(P< 0.05)。
[0041] 圖5是去甲青藤堿對正常小鼠自主活動的影響。
【具體實施方式】
[0042] 下面結(jié)合本發(fā)明的實施例和附圖對本發(fā)明的實施作詳細說明，W下實施例是在W 本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式，但本發(fā)明的保護范圍不限于 下述的實施例。
[0043] W下實施例所用的去甲青藤堿為本實驗合成所得，其結(jié)構(gòu)經(jīng)質(zhì)譜(MS)、核磁共振 (匪R)鑒定為17-N-去甲基青藤堿，純度經(jīng)HPLC證實為98%。青藤堿，購自阿拉下公司 (Aladdin Industrial Inc.)，實驗室用，也可市購。
[0044] 實施例1:去甲青藤堿與青藤堿對小鼠醋酸扭體模型鎮(zhèn)痛效應(yīng)的藥效學(xué)特征比較
[0045] 一、去甲青藤堿與青藤堿(40mg/kg)鎮(zhèn)痛效應(yīng)經(jīng)時過程
[0046] 1.動物分組與實驗設(shè)計：
[0047] ICR小鼠88只（由南通大學(xué)實驗動物中屯、提供），分為11組，每組8只。其中一組i . P. 生理鹽水(賦形劑組），其余組選擇去甲青藤堿W及青藤堿有效劑量(40mg/kg)，分別在醋酸 處理之前不同的預(yù)處理時間（5，30，60，90，ISOmin)腹腔注射，然后i . P. 0.6%醋酸，觀察各 組給予醋酸后0-20min內(nèi)的扭體次數(shù)。扭體反應(yīng)定義為小鼠腹部收縮內(nèi)凹、身體與后肢伸 張、臀部翅起及蠕行。
[004引2.實驗結(jié)果：
[0049] 統(tǒng)計采用單因素方差分析，組間比較采用Bonferroni post hoc分析(Dunn,Olive Jean.Multiple Comparisons Amon邑 Means[J].Journal of the American Statistical Association , 1961,56(293): 52-64.)。結(jié)果如圖lA所示，與賦形劑組相比，去甲青藤堿 40mg/kg給藥后，5min即產(chǎn)生明顯的鎮(zhèn)痛效應(yīng)，顯著減少小鼠醋酸扭體的次數(shù)，效應(yīng)最顯著 時間為30min，維持時間為55min(鎮(zhèn)痛作用時間段5111111-6〇111111，？<0.05)，當(dāng)給藥后9〇111111或 大于90min時，效應(yīng)消失。而青藤堿在30min起效，且最為顯著，維持時間為60min(鎮(zhèn)痛作用 時間段30min-90min，P<0.05)，當(dāng)給藥后ISOmin時，效應(yīng)消失。
[0050] 實驗結(jié)果說明，與青藤堿相比，去甲青藤堿起效時間明顯增快，藥效維持時間相 近。
[0051] 二、去甲青藤堿與青藤堿的鎮(zhèn)痛效應(yīng)量效關(guān)系
[0化2] 1.動物分組與實驗設(shè)計：
[0053] ICR小鼠（由南通大學(xué)實驗動物中屯、提供)56只，分為7組，每組8只。其中一組i.p. 生理鹽水(賦形劑組），其余組分別應(yīng)用去甲青藤堿W及青藤堿不同劑量（10,20,40mg/kg)， 醋酸處理之前30min腹腔注射，然后i . P. 0.6%醋酸，觀察各組給予醋酸后0-20min內(nèi)的扭體 次數(shù)。
[0化4] 2.實驗結(jié)果：
[0055] 統(tǒng)計方法同上。結(jié)果如圖1B所示，與賦形劑組比較，去甲青藤堿與青藤堿（10- 40mg/k)均能劑量依賴性減少小鼠醋酸扭體的次數(shù)(P<0.05)。且去甲青藤堿40mg/kg與青藤 堿40mg/kg相比，有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。
[0056] 藥物對小鼠扭體抑制率可用下列公式表示：
[0057] 抑制率（％ )=(賦形劑組扭體次數(shù)平均值-給藥組扭體次數(shù)平均值)/賦形劑組扭 體次數(shù)平均值XI00 %
[0058] 實驗結(jié)果如表1所示，青藤堿10,20,40mk/kg對小鼠醋酸扭體次數(shù)的抑制率分別為 62.9%，66.8 %和74.3 %。而去甲青藤堿10，20，40mk/kg對小鼠醋酸扭體次數(shù)的抑制率分別 為 63.5%，88.9% 和 93.1%。
[0059] 表1是去甲青藤堿與青藤堿對小鼠醋酸扭體的抑制率的比較
[0060]
[0061] 實驗結(jié)果說明去甲青藤堿鎮(zhèn)痛活性比青藤堿更強。
[0062] 實施例2:去甲青藤堿對大鼠 CFA致炎癥模型的鎮(zhèn)痛效應(yīng)
[0063] 1. CFA致炎癥模型的制備方法：
[0064] 大鼠用異氣燒短暫麻醉后，右足底用酒精消毒片消毒，然后50微升CFA注射入足底 皮下。注射結(jié)束后2小時W及隨后每隔24h測定機械痛闊值(PWT)。機械痛闊值測定方法參照 具體為：使用Von-化ey纖維絲測量套裝（Stoelting有限責(zé)任公司，美國），測量手術(shù)側(cè)（右 偵U)后爪在一系列Von-Frey纖維絲刺激下的縮爪闊值作為其機械性痛闊值，觀察各組大鼠 不同時間點機械性觸誘發(fā)痛的變化。使用巧巾強度的Von-Fr巧細絲進行測定，按照大約對數(shù) 型增加彎曲力度(等效于2,4,6,8，10，15,26邑），測量時，大鼠單獨放在置于金屬篩網(wǎng)上的有 機玻璃格子內(nèi)，適應(yīng)環(huán)境至少15分鐘，Von-Fr巧細絲從2g開始，垂直刺激大鼠右后肢的爪底 (WVon-Frey細絲稍彎曲作為完全受力的標(biāo)準(zhǔn)），持續(xù)時間《4s，觀察大鼠的反應(yīng)，若出現(xiàn)縮 爪視為陽性反應(yīng)，否則為陰性。每個強度的纖維細絲均連續(xù)測定3次，3次中若有2次或2次W 上的反應(yīng)則視為PWT。若無至少2次的陽性反應(yīng)出現(xiàn)則用相鄰的大一級力度刺激。最大力度 為26g，大于此值時仍記為26g。最小的力度記為2g，PWT越低說明機械痛敏越嚴(yán)重。
[00化]2.動物分組與實驗設(shè)計：
[0066] SD大鼠32只（由南通大學(xué)實驗動物中屯、提供），分成4組，每組8只；即賦形劑組（陰 性對照，給予生理鹽水），去甲青藤堿10，20，40mg/kgS個劑量組;采用腹腔注射給藥5ml/ kg，去甲青藤堿由生理鹽水配置。各組大鼠全部給予CFA造模，24后先測試各組PWT的基線值 (此時尚未給藥），待基礎(chǔ)闊值測試結(jié)束，如出現(xiàn)痛闊值明顯降低，則立即腹腔注射給藥，并 于給藥后每間隔30min現(xiàn)聯(lián)一次PWT，直到痛闊值恢復(fù)給予CFA后的基線值。現(xiàn)憶疼痛闊值方 法同前述。
[0067] 3.實驗結(jié)果：
[0068] 如圖2所示，CFA致炎后2地，在給藥之前測定機械性痛闊基線值化表示），然后 分別于給藥后〇.5、1、1.5、2、2.5、化測定其機械性痛闊值。￥1')。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，去甲青藤堿能劑 量依賴性地增加 CFA致炎癥痛模型大鼠的PWT。賦形劑組(CFA致炎癥后24h，腹腔注射生理鹽 水)在測試期間的3h內(nèi)，重復(fù)測量的疼痛闊值都保持在最低水平（圖2中圓圈表示）。雙因素 重復(fù)測量方差分析顯示藥物因素、時間因素 W及藥物X時間相互作用都有顯著性統(tǒng)計學(xué)意 義。組間比較采用Bonferroni post hoc分析，表明去甲青藤堿40mg/kg給藥組大鼠 PWT在給 藥后隨著時間逐漸升高，在0 .化時起效，化時達到最大值，隨后逐漸降低，在0.5-1.化時間 段均有明顯鎮(zhèn)痛效應(yīng)(P<〇. 05)，在給藥化后痛闊值恢復(fù)到CFA致炎癥模型的基礎(chǔ)值水平。 20mg/kg去甲青藤堿在化時，顯示有明顯鎮(zhèn)痛效應(yīng)(P<0.05)。lOmg/kg組青藤堿與賦形劑組 比較，沒有統(tǒng)計學(xué)差異(P〉〇.05)。圖2中，凡W黑色填充的數(shù)據(jù)點均表示，與賦形劑組相比較 具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<〇. 05)。
[0069] 實驗結(jié)果表明，急性給藥去甲青藤堿20,40mg/kg可W有效改善CFA致炎癥疼痛的 機械性痛覺過敏。
[0070] 實施例3:去甲青藤堿急性給藥對小鼠切口術(shù)后疼痛模型的鎮(zhèn)痛效應(yīng)
[0071] 1.小鼠切口疼痛模型的建立：
[0072] 具體建立方法:使用麻醉機，小鼠用3 %異氣燒誘導(dǎo)麻醉后，然后W1.5 %異氣燒維 持麻醉，仰邸固定，小鼠右后足從接近腳后跟0.2cm處向腳趾方向，用11號手術(shù)刀片劃開皮 膚，作0.5cm長的縱向切口，將筋膜挑出，并在筋膜中央縱向劃開。輕壓止血后，用單根6號尼 龍線在切口中點部位縫合一針，然后將動物放回籠中，待其蘇醒后進行機械痛闊值測定。機 械痛闊值測定方法參考文獻(Pogatzki EM,Raja SN.A mouse model of incisional pain [J] .Anesthesiology ,2003，99(4) :1023-27.)，具體為：使用 Von-化巧纖維絲測量套裝 (Stoelting有限責(zé)任公司，美國），測量手術(shù)側(cè)(右側(cè))后爪在一系列Von-Fr巧纖維絲刺激下 的縮爪闊值作為其機械性痛闊值，觀察各組小鼠不同時間點機械性觸誘發(fā)痛的變化。使用7 種強度的Von-Frey細絲進行測定，按照大約對數(shù)型增加彎曲力度(等效于0.07,0.16,0.4， 0.6,1.0,1.4,2.Og)，測量時，小鼠單獨放在置于金屬篩網(wǎng)上的有機玻璃格子內(nèi)，適應(yīng)環(huán)境 至少15分鐘，Von-Fr巧細絲從0.07g開始，垂直刺激小鼠右后肢的爪底（WVon-Fr巧細絲稍 彎曲作為完全受力的標(biāo)準(zhǔn)），持續(xù)時間《4s，觀察小鼠的反應(yīng)，若出現(xiàn)縮爪視為陽性反應(yīng)，否 則為陰性。每個強度的纖維細絲均連續(xù)測定3次，3次中若有2次或2次W上的反應(yīng)則視為 PWT。若無至少2次的陽性反應(yīng)出現(xiàn)則用相鄰的大一級力度刺激。最大力度為2g，大于此值時 仍記為2g。最小的力度記為0.07g，PWT越低說明機械痛敏越嚴(yán)重。
[0073] 2.動物分組：
[0074] ICR小鼠（購買于南通大學(xué)動物實驗中屯、）50只，分成5組，每組10只；即賦形劑組 (陰性對照，給予生理鹽水），去甲青藤堿10，20，40mg/kgS個劑量組，青藤堿40mg/kg組（陽 性對照）；采用腹腔注射給藥，去甲青藤堿與青藤堿均由生理鹽水配制。
[0075] 3.實驗設(shè)計：
[0076] 各組小鼠全部進行切口手術(shù)，手術(shù)方法同前述，術(shù)后24h先測試各組機械性痛闊值 (PWT)的基線值(此時尚未給藥），待基礎(chǔ)闊值測試結(jié)束，如出現(xiàn)痛闊值明顯降低，則立即腹 腔注射給藥，并于給藥后每間隔30min測試一次PWT，直到痛闊值恢復(fù)術(shù)后的基線值。測定疼 痛闊值方法同前述。
[0077] 4.實驗結(jié)果：
[0078] 如圖3所示，手術(shù)后2地，在給藥之前測定機械性痛闊基線值化表示），然后分別 于給藥后〇.5、1、1.5、2、2.5、化測定其機械性痛闊值。￥1')。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，去甲青藤堿能劑量依 賴性地增加手術(shù)后小鼠的PWT。
[0079] 給藥后痛闊提高百分率=(給藥后PWT-給藥前PWT)/(術(shù)前基礎(chǔ)PWT-給藥前PWT) X 100%。
[0080] 賦形劑組(手術(shù)后腹腔注射生理鹽水)在測試期間的化內(nèi)，重復(fù)測量的疼痛闊值都 保持在最低水平（圖3中圓圈）。雙因素重復(fù)測量方差分析顯示藥物因素、時間因素 W及藥物 X時間相互作用都有顯著性統(tǒng)計學(xué)意義。組間比較采用Bonf err on i po S t ho C分析，表明去 甲青藤堿40mg/kg給藥組小鼠 PWT在給藥后隨著時間逐漸升高，在0.化時起效，化時達到最 大值(痛闊提高百分率平均值為63.6%)，隨后逐漸降低，在0.5-1.化時間段均有明顯鎮(zhèn)痛 效應(yīng)(P<0.05)，在給藥化后痛闊值恢復(fù)到手術(shù)前的水平。lOmg/kg與20mg/kg去甲青藤堿雖 然顯示出一定緩解疼痛的作用，但是沒有統(tǒng)計學(xué)差異(P〉〇.05)。青藤堿40mg/kg給藥組小鼠 PWT在給藥后隨著時間逐漸升高，在化時起效，1.5h時達到最大值(痛闊提高百分率平均值 為55.5%)，隨后逐漸降低，在1-化時間段均有明顯鎮(zhèn)痛效應(yīng)(P<0.05)，在給藥2.化后痛闊 值恢復(fù)到手術(shù)前的水平。
[0081] 圖3中，凡W黑色填充的數(shù)據(jù)點均表示，與賦形劑組相比較具有統(tǒng)計學(xué)意義（P< 0.05)。
[0082] 實驗結(jié)果表明，急性給藥去甲青藤堿40mg/kg可W有效改善術(shù)后疼痛的機械性痛 覺過敏。與青藤堿相比，去甲青藤堿起效時間短，維持時間相近，鎮(zhèn)痛效應(yīng)要強。
[0083] 實施例4:去甲青藤堿40mg/kg慢性給藥對切口疼痛模型小鼠機械性痛闊值的影響
[0084] 我們選擇具有明顯鎮(zhèn)痛效應(yīng)的40mg/kg劑量去甲青藤堿，研究其重復(fù)給藥對小鼠 切口痛的作用。
[00化]1.動物分組與設(shè)計：
[0086] ICR小鼠 20只，分成2組；即賦形劑組（給予生理鹽水）10只；去甲青藤堿40mg/kg組 10只（注:采用腹腔注射給藥，去甲青藤堿由生理鹽水配置）。各組小鼠全部進行切口手術(shù)， 手術(shù)方法同前述。于術(shù)后化測定疼痛闊值，然后于術(shù)后24h給藥，每天給藥一次，連續(xù)給藥6 天。于每天給藥后化測定疼痛闊值，測定疼痛闊值方法同前。
[0087] 2.實驗結(jié)果：
[0088] 結(jié)果如圖4所示，每天給予去甲青藤堿40mg/kg能有效地改善切口手術(shù)導(dǎo)致的機械 痛覺過敏。組間比較采用t檢驗，40mg/kg的去甲青藤堿在手術(shù)后1-3天都能明顯地減少小鼠 的機械痛覺過敏(P<〇.05)。圖4中，凡W黑色填充的數(shù)據(jù)點均表示，與賦形劑組相比較具有 統(tǒng)計學(xué)意義(P<〇.〇5)。運表明每天給藥去甲青藤堿40mg/kg治療，可W有效地緩解本模型中 的機械性痛覺過敏，而未產(chǎn)生耐受性。在長期給藥實驗完畢后進行突然停藥，連續(xù)3天未觀 察到小鼠有任何異常的停藥反應(yīng)，說明其無成癒性。
[0089] 實施例5:去甲青藤堿對正常小鼠的鎮(zhèn)靜實驗：
[0090] 1.自主活動巧聯(lián)方法具體為：
[0091] 使用大小鼠自主活動的測試儀(YLS-1B，濟南延益科技有限公司，中國），儀器包含 一個控制部件和4個圓柱形黑色塑料暗箱（直徑30cm，高度30cm)，將小鼠放進黑色塑料暗 內(nèi)，光傳感器位于箱蓋子的中央處，用于記錄小鼠自主活動次數(shù)。記錄60min內(nèi)小鼠自主活 動次數(shù)。
[0092] 2.動物分組與給藥：
[00W] 雄性ICR小鼠40只；分成4組，即正常對照組和去甲青藤堿10，20，40mg/kg^個劑量 組，每組10只。正常對照組給予生理鹽水，其余組分別腹腔注射去甲青藤堿10,20,40mg/kg (用生理鹽水配制，給藥容積為lOml/kg)后，按照前述測定方法觀察其30min內(nèi)自主活動。 [0094] 3.實驗結(jié)果：
[00巧]統(tǒng)計方法采用單因素方差分析，組間比較采用Bonferroni post hoc分析，顯示去 甲青藤堿10-40mg/kg與正常對照組相比沒有明顯差異，說明所使用的劑量的去甲青藤堿對 小鼠自主活動無影響，沒有鎮(zhèn)靜作用(如圖5)。
[0096]上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式不受上述實施例的限 審IJ。其他任何不脫離本發(fā)明之精神和原理下所作的變形，均應(yīng)認為是本發(fā)明的保護范圍。
【主權(quán)項】
1. 去甲青藤堿在制備鎮(zhèn)痛藥物中的應(yīng)用，所述的去甲青藤堿的結(jié)構(gòu)如式(I)所示。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的去甲青藤堿在制備鎮(zhèn)痛藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述的去 甲青藤堿還包括其藥學(xué)上可接受的鹽。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的去甲青藤堿在制備鎮(zhèn)痛藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述的藥 學(xué)上可接受的鹽為鹽酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽，或醋酸鹽。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的去甲青藤堿在制備鎮(zhèn)痛藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述的藥 物中去甲青藤堿的含量為O. l-99wt %。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的去甲青藤堿在制備鎮(zhèn)痛藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述的藥 物以去甲青藤堿作為唯一活性成份。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的去甲青藤堿在制備鎮(zhèn)痛藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述的疼 痛為炎癥性疼痛、術(shù)后疼痛，以及臨床上其他類型的疼痛。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的去甲青藤堿在制備鎮(zhèn)痛藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述的藥 物為以去甲青藤堿作為活性成份采用本領(lǐng)域常規(guī)制備方法制備成藥物制劑。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的去甲青藤堿在制備鎮(zhèn)痛藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述的藥 物制劑為顆粒劑、片劑、丸劑或者液體制劑。9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的去甲青藤堿在制備鎮(zhèn)痛藥物中的應(yīng)用，其特征在于，急性給藥 用量為10~40mg/kg，慢性給藥用量為40mg/kg。
【文檔編號】A61K31/485GK105998023SQ201610331233
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年5月17日
【發(fā)明人】李俊旭, 朱清, 歐云淘, 蘇漫, 趙穎
【申請人】南通大學(xué)