一種具有協(xié)同抗腫瘤轉移活性的藥物組合物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種具有協(xié)同抗腫瘤轉移的藥物組合物，通過將具有強水溶性的二甲雙胍與高效低毒的抗腫瘤天然產(chǎn)物熊果酸及其衍生物進行聯(lián)合用藥，表明其聯(lián)合具有增效作用，可望獲得較為安全可靠新型防治腫瘤轉移的候選藥物。該藥物組合物，其特征在于包含如式I所示的化合物和二甲雙胍I；其中式I中的R為羥基或者乙酰氧基；其中式I所示的化合物與二甲雙胍的物質的量比為10:500-4000。
【專利說明】
一種具有協(xié)同抗腫瘤轉移活性的藥物組合物
技術領域
[0001] 本發(fā)明涉及一種具有協(xié)同抗腫瘤轉移的藥物組合物及其在制備抗腫瘤轉移藥物 中的應用，屬于抗腫瘤轉移藥物組合物領域。
【背景技術】
[0002] 癌癥(惡性腫瘤)是指由于調(diào)控細胞增殖機制的失常而引發(fā)的疾病。癌癥嚴重威脅 人類健康，是當今人類中最嚴重的疾病之一。癌癥的患病風險逐年增加，在中國每年超過 160萬人被診斷為癌癥，120萬人死于癌癥。癌癥已成為我國居民健康的主要慢性病之一，列 城市死因的第一位，農(nóng)村死因的第二位。到目前為止尚無徹底治療癌癥的辦法，約80%的腫 瘤患者主要的死亡原因是局部復發(fā)和遠處轉移近。腫瘤轉移的過程涉及到細胞從原發(fā)灶點 脫落、浸潤相鄰組織、降解細胞外基質、迀移運動以及新生血管生成等過程。從理論上來說， 只要能夠有效干預以上這些環(huán)節(jié)中的某個或某些過程，就有望對腫瘤轉移產(chǎn)生顯著的抑制 作用。隨著對腫瘤轉移過程的了解和深入，近年來人們一直致力于新型抗腫瘤藥物的研究， 其中有效抑制腫瘤細胞轉移的藥物是一個新的藥物開發(fā)方向。相對于傳統(tǒng)化學合成藥物， 開發(fā)天然藥物具有資金投入少、研究周期短、篩選效率高等優(yōu)點。因此越來越多的新的化學 實體和各種天然化合物被廣大科研工作者所發(fā)現(xiàn)，并應用到抑制腫瘤細胞轉移的發(fā)生發(fā)展 過程中。
[0003] MMPs是一類參與細胞外基質和基底膜降解的蛋白水解酶，目前發(fā)現(xiàn)的家族成員共 26個，其在乳腺癌、胃癌、宮頸癌、食管癌等多種實體瘤的腫瘤血管生成、腫瘤生長、浸潤轉 移等病理生理學過程中發(fā)揮了重要作用。研究證實，MMP-2和麗P-9在多種實體瘤中存在異 常高表達對腫瘤的侵襲和轉移具有明顯的促進作用；因此可以通過抑制MMP-2/9的表達進 而抑制腫瘤細胞的侵襲和迀移。
[0004] 聯(lián)合用藥(Drug combination)是指為了達到治療目的而采用的兩種或兩種以上 藥物同時或先后應用。聯(lián)合用藥往往會發(fā)生體內(nèi)或體外藥物的相互影響。對于某些藥物組 合，聯(lián)合治療還允許產(chǎn)生最佳組合劑量來使副作用最小化;兩種化合物的聯(lián)合治療可揭示 未預料到的協(xié)同作用和引發(fā)非由單一化合物誘導的效應。
[0005] 熊果酸即 3β_羥基-熊果-12_稀_28_酸（30-hydroxy-urs_l2-en_28-〇ic acid，簡 稱UA)，又名烏索酸、屬于a-香樹脂醇(a-amyrin)型五環(huán)三萜類化合物，結構如式Π所示，其 相對分子量為456.68，分子式為C3〇H48〇3，是自然界中分布較廣的天然活性化合物，主要以游 離或糖苷的形式存在其廣泛分布于枇杷葉、熊果、山楂、白花蛇舌草等多種天然植物中，也 是許多傳統(tǒng)中藥的主要活性成分之一，具有廣泛的藥理作用，如抗癌、保肝、抗炎、抗病毒、 抗氧化等其中以抗癌活性最為顯著，不僅對多種致癌物有抵抗作用，而且對多種腫瘤細胞 在體內(nèi)、外均有抑制作用。因其副作用小，毒性低，顯示出較大的臨床應用潛力。近年來國內(nèi) 外對UA的抗腫瘤研究日趨深入，并發(fā)現(xiàn)其在腫瘤預防、治療以及防止晚期復發(fā)轉移等方面 有著獨特的優(yōu)勢及潛在的應用前景。熊果酸及其衍生物的抗癌譜廣，專利N201510466210.4 首次公開了熊果酸衍生物ASP-UA對乳腺癌細胞的粘附、迀移、侵襲等具有顯著的抑制作用。 專利N201410189256.1首次公開了熊果酸衍生物US597能有效減少小鼠B16-F10黑色素瘤的 實驗性肺轉移，但目前將抗熊果酸及其衍生物和二甲雙胍聯(lián)合給藥用于抗癌轉移尚未見報 道。
[0006] UAl，結構如式m所示，該化合物可明顯改善UA的溶解度，理化性質更加穩(wěn)定;此外 跟UA對比，其對不同種類腫瘤細胞均具有更顯著的增殖抑制作用，且對正常細胞毒性較低， 提示其具有安全、高效和低毒的特點，可望將其應用于腫瘤轉移的早期預防和治療中。
[0007] 二甲雙胍(Metformin，簡稱Met)，其相對分子量為129.10，分子式為C4H11N 5，被認 為是胰島素增敏劑之一，結構如式IV所示。二甲雙胍作為治療2型糖尿病經(jīng)典而有效的藥 物，已有近50年的臨床應用歷史，還用于治療多囊卵巢綜合癥、假性黑棘病等。二甲雙胍為 強水溶性性藥物，口服后主要在小腸吸收，生物利用度為50-60%左右。目前二甲雙胍在各國 的糖尿病治療指南中均被推薦為首選用藥，且無禁忌癥，它的作用機理不同于其他類型的 口服抗血糖藥，它可減少肝糖的產(chǎn)生，降低小腸對糖的吸收，并且還可增加外周糖的攝取和 利用，從而提高胰島素的敏感性，它在糖尿病治療中的威望也與日倶增，成為全球抗擊糖尿 病的核心藥物。專利N201310069025.2首先公開了一種二甲雙胍的新用途，證明了二甲雙胍 能夠抑制子宮內(nèi)膜癌細胞的增殖。專利N201080048060.0也公開了二甲雙胍在癌癥治療和 預防中的用途。
[0008] 以HepG2、SCL-I、MCF-7和A549細胞作為研究對象，通過熊果酸及其衍生物和二甲 雙胍進行聯(lián)合用藥，對HepG2、SCL-I、MCF-7、A549細胞進行體外抗癌活性測試，結果表明，熊 果酸及其衍生物和二甲雙胍的聯(lián)合使用對癌細胞的增殖迀移、侵襲等具有顯著的抑制作 用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的目的就是提供一種具有協(xié)同抗腫瘤轉移的藥物組合物，通過將具有強水 溶性的二甲雙胍與高效低毒的抗腫瘤天然產(chǎn)物熊果酸及其衍生物進行聯(lián)合用藥，考察其聯(lián) 合增效作用，可望獲得較為安全可靠新型防治腫瘤轉移的候選藥物。
[0010] -種具有協(xié)同抗腫瘤轉移的藥物組合物及其在制備抗腫瘤轉移藥物中的應用，其 特征在于包含如式I所示的化合物和二甲雙胍
其中式I中的R為羥基或者乙酰氧基； 其中式I所示的化合物與二甲雙胍的物質的量比為1 〇: 500-4000。
【附圖說明】
[0011]圖1.熊果酸和二甲雙胍單獨使用及聯(lián)合使用24 h對SCL-I細胞增殖的抑制結果； 圖2.熊果酸和二甲雙胍單獨使用及聯(lián)合使用24 h對MCF-7細胞增殖的抑制結果； 圖3.熊果酸和二甲雙胍單獨使用及聯(lián)合使用24 h對HepG2細胞增殖的抑制結果； 圖4.熊果酸和二甲雙胍單獨使用及聯(lián)合使用24 h對A549細胞增殖的抑制結果； 圖5.UAl和二甲雙胍單獨使用及聯(lián)合使用24 h對SCL-I細胞增殖的抑制結果； 圖6.UAl和二甲雙胍單獨使用及聯(lián)合使用24 h對MCF-7細胞增殖的抑制結果； 圖7. UAl和二甲雙胍單獨使用及聯(lián)合使用24 h對HepG2細胞增殖的抑制結果； 圖8.UAl和二甲雙胍單獨使用及聯(lián)合使用24 h對A549細胞增殖的抑制結果； 圖9.UAl和二甲雙胍單獨使用及聯(lián)合使用24 h后對SCL-I迀移能力的抑制結果； 圖10. UAl和二甲雙胍單獨使用及聯(lián)合使用24 h后對SCL-I迀移能力的抑制率； 圖11.熊果酸和二甲雙胍單獨使用及聯(lián)合使用24、48、72 h后對SCL-I細胞迀移能力的 抑制結果； 圖12.熊果酸和二甲雙胍聯(lián)合使用作用24 h對SCL-I細胞迀移的抑制率； 圖13.熊果酸和二甲雙胍聯(lián)合使用作用48 h對SCL-I細胞迀移的抑制率； 圖14.熊果酸和二甲雙胍聯(lián)合使用作用72 h對SCL-I細胞迀移的抑制率； 圖15.熊果酸和二甲雙胍單獨使用及聯(lián)合使用后對MMP-2蛋白表達水平的影響； 圖16.熊果酸和二甲雙胍單獨使用及聯(lián)合使用后對MMP-9蛋白表達水平的影響。
【具體實施方式】
[0012]為了使本發(fā)明所述的內(nèi)容更加便于理解，下面結合【具體實施方式】對本發(fā)明所述的 技術方案做進一步的說明，但是本發(fā)明不僅限于此。
[0013] 實施例1 UAl的合成 ① 250 mL圓底燒瓶，加入二氯甲烷20 ml，吡啶20 ml，熊果酸I g，醋酸酐3.5 mL。加少 量DMP，室溫磁力攪拌過夜； ② 向①瓶中補充加入100 ml二氯甲烷，分別用100 mL I N HCl溶液萃取②得到的有 機層2次，收集有機層； ③ 與②步驟相同，分別用飽和NaHCO3溶液萃?、诘玫降挠袡C層2次，每次用量100 mL， 最后分出有機層； ④ 向③中得到的有機層中加入無水硫酸鈉充分攪拌干燥(約4勺），過濾； ⑤ 旋轉蒸發(fā)儀蒸除溶劑，得粗品； ⑥ 柱層析純化得純白色UAl; 實施例2 熊果酸和二甲雙胍單獨使用及聯(lián)合使用24 h對SCL-l、MCF-7、HepG2及A549細胞的增殖 抑制作用：采用標準MTT比色法測定了熊果酸和二甲雙胍不同聯(lián)合比例對SCL-I、MCF-7、 HepG2及A549細胞的增殖抑制活性，結果如圖1-4所示。
[0014] 如圖1-4所示，當熊果酸α〇μΜ)和二甲雙胍（1-4 mM)在低濃度范圍內(nèi)聯(lián)合用藥24 h后，其對癌細胞無明顯增殖抑制作用。因此后續(xù)我們選擇將安全有效的低劑量濃度(無明 顯細胞殺傷作用）的熊果酸和二甲雙胍聯(lián)用，繼續(xù)研究其對癌細胞侵襲及轉移的抑制能力， 以探索其在抗腫瘤轉移領域應用的潛力。
[0015] 實施例3 UAl和二甲雙胍單獨使用及聯(lián)合使用24 h對SCL-l、MCF-7、HepG2及A549細胞的增殖抑 制作用:采用標準MTT比色法測定了UAl和二甲雙胍不同聯(lián)合比例對SCL-l、MCF-7、!fepG2及 A549細胞的增殖抑制活性，結果如圖5-8所示。
[0016] 如圖5-8所示，當UAUlO μΜ)和二甲雙胍（1-4 mM)在低濃度范圍內(nèi)聯(lián)合用藥24 h 后，其對癌細胞無明顯增殖抑制作用。因此后續(xù)我們選擇將安全有效的低劑量濃度(無明顯 細胞殺傷作用）的UAl和二甲雙胍聯(lián)用，繼續(xù)研究其對癌細胞侵襲及轉移的抑制能力，以探 索其在抗腫瘤轉移領域應用的潛力。
[0017] 實施例4 UAl和二甲雙胍單獨使用以及聯(lián)合使用對非小細胞肺癌SCL-I侵襲能力的影響。
[0018] A549細胞先加無血清無酚紅培養(yǎng)基饑餓過夜，消化、離心收集的細胞用空白培養(yǎng) 基懸浮。取12孔板，在小室的上室中加入500 yL用空白的培養(yǎng)基配制好的不同濃度樣品的 細胞懸浮液（約5X IO5/孔），下室加500 yL含10%小牛血清的培養(yǎng)基，藥物作用24 h后，取 出小室，用4%的多聚甲醛固定20 min，用棉簽擦掉上層未迀移細胞，用PBS洗3次，用0.1 %結 晶紫染色30 min，用PBS洗三次，將小室的底膜取下，用甘油封片保存，倒置顯微鏡下隨機5 個視野下拍照，結果見下圖9、10。
[0019] 結果如圖9、10所示，0 h的時候給藥干預組與空白對照組對比迀移距離無明顯影 響，經(jīng)給藥24 h后，空白對照組細胞發(fā)生了很明顯的迀移，劃痕寬帶變窄；當UAl濃度為10 μ M的時候，細胞也明顯的發(fā)生了迀移；二甲雙胍在10 mM的條件下，細胞也明顯的發(fā)生了迀 移，劃痕寬帶變窄;但當兩者聯(lián)合使用后，在二甲雙胍在I mM)的情況下，細胞的迀移能力明 顯的受到了抑制。劃痕寬度與空白對照組相比差異明顯且具有統(tǒng)計學意義(P〈〇.01)。
[0020] 實施例5 熊果酸和二甲雙胍單獨使用以及聯(lián)合使用對SCL-I細胞株迀移能力的影響 取對數(shù)生長期的細胞(約3 X IO6/孔)接種于該板中，置于37°C，5% CO2的培養(yǎng)箱中培 養(yǎng)24 h，待細胞接近融合后，用白色槍頭在孔板的1/4、1/2、3/4處垂直的劃三條平行線，用 PBS清洗細胞3次，在熒光顯微鏡下拍劃痕寬度，記錄下所拍圖片的坐標軸。加入含不同藥物 濃度的培養(yǎng)基，置于37°C，5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24、48、72 h，在同一部位再次拍照，測定 迀移距離，對比各組兩次拍照的迀移距離，結果如圖11-14所示。
[0021] 實驗結果如圖11-14所示，熊果酸和二甲雙胍單獨使用以及聯(lián)合使用24、48、72 h 后對SCL-I細胞株細胞迀移抑制率檢測，結果表明：在0 h，給藥干預組與空白對照組對比迀 移距離無明顯影響，經(jīng)給藥24 h后，空白對照組細胞發(fā)生了很明顯的迀移，劃痕寬帶變窄； 當UA濃度為10 μΜ的時候，細胞也明顯的發(fā)生了迀移;二甲雙胍在20 mM的條件下，細胞的迀 移能力受到了抑制，劃痕愈合速度減慢;但當兩者聯(lián)合使用后，在二甲雙胍在I mM)的情況 下，就能明顯的抑制細胞的迀移能力，且呈濃度依賴性的抑制細胞的迀移能力。經(jīng)給藥48 h 后，空白對照組細胞的劃痕已經(jīng)閉合；當UA濃度為10 μΜ的時候，細胞很明顯的發(fā)生了迀移， 劃痕寬帶變小;二甲雙胍在高濃度20 mM的條件下才能明顯的抑制細胞的迀移能力;但當兩 者聯(lián)合使用后，在二甲雙胍在較低濃度I mM)的情況下，就能較明顯的抑制細胞的迀移能 力，隨著二甲雙胍藥物濃度的增大，細胞的迀移能力也會變小。經(jīng)給藥72 h后，空白對照組 細胞的劃痕已經(jīng)閉合；當UA濃度為10 μΜ的時候，細胞的劃痕也已經(jīng)閉合;二甲雙胍在20 mM 的條件下能夠明顯的抑制細胞的迀移能力；但當兩者聯(lián)合使用后，在二甲雙胍在I mM的情 況下，就能較明顯的抑制細胞的迀移能力。因此兩者聯(lián)合用藥，能呈濃度依賴性和時間依賴 性的抑制細胞的迀移能力，劃痕寬度與空白對照組相比差異明顯且具有統(tǒng)計學意義（P〈 0·01)〇
[0022] 實施例6 熊果酸和二甲雙胍單獨使用以及聯(lián)合使用對MMP-2/9蛋白表達水平的影響 將細胞接種至6孔板，待細胞達80 %以上加不同藥物干預細胞24 h后，棄去培養(yǎng)液，用 預冷的PBS漂洗細胞2次，向6孔板中的每孔加入新鮮配制的細胞裂解液RIPA (radioimmunopre-cipitation assay)200 yL[l mL RIPA中加入 10 yL蛋白酶抑制劑、10 μ L磷酸酶抑制劑和5yL苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyIf Iuoride，PMSF)]，冰上放置 30 min，每5 min搖晃一次，12000Xg 4°C離心15 min，取上清液，制備總蛋白；采用二喹啉 甲酸(bicincho-ninic acid，BCA)蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度，以β-actin水平作為 等量蛋白質上樣，取20 yg蛋白質進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)電 泳，然后將分離后的蛋白轉移至聚偏二氟乙稀(polyvinylidene ,PVDF)膜上，室溫下用含 5%脫脂奶粉的TBST封閉I h，加入一抗4°C反應過夜，次日用TBST室溫下洗膜3次（10 min/ 次），再加入HRP標記的二抗（1:5000稀釋)在室溫下孵育I h，用TBST在室溫下再次洗膜3次 (10 min次），最后電化學發(fā)光顯影。采用圖像分析軟件Image J對條帶進行灰度值分析，結 果如圖15、16所示。
[0023] 實驗結果如圖15、16所示，空白對照組不影響MMP2/9蛋白水平的表達；當UA濃度為 10 μΜ的時，對MMP-2/9蛋白表達水平的影響不大；當Met在20 mM條件下，可以抑制MMP-2/9 蛋白表達水平;但當兩者聯(lián)合用藥的時候（10 μΜ UA和I mM Met聯(lián)用）能夠起到聯(lián)合增效的 作用，顯著的抑制MMP-2/9蛋白表達水平。
【主權項】
1. 一種具有協(xié)同抗腫瘤轉移的藥物組合物，其特征在于包含如式I所示的化合物和二 甲雙脈其中式I中的R為徑基或者乙酷氧基； 其中式I所示的化合物與二甲雙脈的物質的量比為10:500-4000。2. 如權利要求1所述的藥物組合物在制備抗腫瘤轉移藥物中的應用。
【文檔編號】A61P35/04GK105963306SQ201610520699
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年7月5日
【發(fā)明人】邵敬偉, 鄭桂容
【申請人】福州大學