一種椎間盤纖維環(huán)組織工程支架的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種椎間盤纖維環(huán)組織工程支架的制備方法，屬于生物醫(yī)學(xué)材料技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]椎間盤退變性疾病是當(dāng)今社會(huì)中的一種常見疾病。在美國，僅次于上呼吸道感染而居第二位，是導(dǎo)致勞動(dòng)力喪失的主要原因之一;亞洲國家如中國因?yàn)轶w力勞動(dòng)者較多，發(fā)病率更高。隨著我國老齡化進(jìn)程的發(fā)展，椎間盤退變性疾病越來越成為嚴(yán)重影響人們工作生活的疾病。組織工程技術(shù)的出現(xiàn)為椎間盤疾病的治療提供了新的思路和方法，有望為椎間盤修復(fù)或置換提供永久替代產(chǎn)品。其中，纖維環(huán)的再生修復(fù)是椎間盤組織工程首先要解決的問題，只有纖維環(huán)得到修復(fù)才能讓髓核組織保持在椎間隙，進(jìn)而對退變髓核實(shí)施下一步治療。
[0003]近年來，用于構(gòu)建纖維環(huán)組織工程支架的材料和方法研究較多。如靜電紡絲納米支架，雖然孔隙率高，但其力學(xué)性能是各向同性的，與天然纖維環(huán)不符，且其生產(chǎn)效率太低；取向性藻酸鹽/殼聚糖復(fù)合支架，其力學(xué)性能與天然纖維環(huán)相差甚遠(yuǎn);聚己酸內(nèi)酯蘋果酸三醇/脫鈣骨基質(zhì)明膠雙相纖維環(huán)支架，雙相支架的內(nèi)外層結(jié)合不牢、容易脫落，且生物相容性差；國內(nèi)徐寶山等用豬的纖維環(huán)脫細(xì)胞基質(zhì)作為纖維環(huán)支架，存在的問題在于支架形狀、大小、降解速率無法隨意控制。因此，尋找新的纖維環(huán)組織工程支架材料和制備方法是椎間盤再生修復(fù)領(lǐng)域亟需解決的問題。
[0004]本發(fā)明所采用的材料配方為魔芋葡甘聚糖、明膠和納米羥基磷灰石，均無毒性且具有良好的生物相容性。魔芋葡甘聚糖力學(xué)性能好，降解速率偏慢；明膠力學(xué)性能差，降解速率偏快;通過改變二者的配比，可以按需控制支架的降解速率。納米羥基磷灰石在支架中起到增強(qiáng)相的作用。本發(fā)明采用卷膜法制備的纖維環(huán)支架，形狀、尺寸可調(diào)，并且具有各向異性的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和力學(xué)性能，能夠滿足纖維環(huán)抗一定張力的要求，在結(jié)構(gòu)上具有高仿真性。本發(fā)明制備的纖維環(huán)由薄膜圍繞特定的型芯卷制而成，孔隙率高，能夠滿足組織工程支架材料對孔徑和孔隙率的要求。該支架在椎間盤再生修復(fù)領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是現(xiàn)有纖維環(huán)支架結(jié)構(gòu)仿真度不高、降解速率不可控、力學(xué)性能不具備各向異性等問題。
[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種椎間盤纖維環(huán)組織工程支架的制備方法，具體包括以下步驟:
(I)原液的配制:將魔芋葡甘聚糖、明膠、納米羥基磷灰石溶于蒸餾水中制備得到原液，原液中魔芋葡甘聚糖濃度為10?50 g/L，明膠濃度為I?50 g/L，納米羥基磷灰石濃度為η，O<n<20 g/L ο
[0007](2)制膜:將原液倒在特定的模板上，原液在重力的作用下流淌并平鋪于模板上形成均勻薄層，薄層厚度為I?5 _，隨后，將薄膜進(jìn)行冷凍干燥或在溫度低于60°C的干燥箱中干燥。
[0008](3)膜的交聯(lián):將干燥的膜浸入交聯(lián)液中交聯(lián)6?24 ho
[0009](4)初生纖維環(huán)的制備:將半濕狀態(tài)下的膜切成條狀，寬度為5?20mm，然后繞柱狀型芯纏繞成環(huán)狀。
[0010](5)纖維環(huán)的交聯(lián):用保鮮膜將初生纖維環(huán)連同型芯一起包裹好，固定防止散開(例如在外面用繩或其它物品固定)；然后再次浸入交聯(lián)液中交聯(lián)6?24 h，保鮮膜上留有孔洞，以使初生纖維環(huán)能夠浸泡在交聯(lián)液中。
[0011](6)纖維環(huán)支架的形成:將交聯(lián)好的纖維環(huán)用蒸餾水反復(fù)浸泡、清洗，除去交聯(lián)劑；然后將纖維環(huán)在-18?-40 °C的條件下冷凍24 h以上，之后對樣品進(jìn)行冷凍干燥直至樣品水分完全揮發(fā)，得到干燥的椎間盤纖維環(huán)組織工程支架。
[0012]優(yōu)選的，本發(fā)明所述原液的配制，具體包括以下步驟:將明膠加入蒸餾水中靜置2?12h，然后水浴加熱至40?70°C，充分?jǐn)嚢柚撩髂z完全溶解;然后加入納米羥基磷灰石粉體，繼續(xù)攪拌直至羥基磷灰石粉體在溶液中形成均勻懸浮狀態(tài)，加入魔芋葡甘聚糖攪拌至魔芋葡甘聚糖與懸浮液充分混合，然后置于700W功率的微波爐中加熱20?30s，加熱完成后取出冷卻至室溫得到原液。
[0013]本發(fā)明所述交聯(lián)劑可以是1%?28%質(zhì)量濃度的氨水或0.1%?10%質(zhì)量濃度的戊二醛。
[0014]本發(fā)明所述柱狀型芯的橫截面可以是任意所需的形狀。
[0015]本發(fā)明制備的椎間盤纖維環(huán)組織工程支架橫切面為同心環(huán)狀，類似于自然纖維環(huán)，如圖6所示。
[0016]本發(fā)明所述魔芋葡甘聚糖和明膠均屬于天然高分子材料，無細(xì)胞毒性，具有良好的生物相容性，且來源廣泛，價(jià)格低廉。魔芋葡甘聚糖力學(xué)性能好，降解速率偏慢；明膠力學(xué)性能差，降解速率偏快;通過改變二者的配比，可以按需控制支架的降解速率;適量添加的納米羥基磷灰石在支架中起到增強(qiáng)相的作用；先將魔芋葡甘聚糖、明膠和納米羥基磷灰石材料制備成薄膜。為了使薄膜具有一定的力學(xué)強(qiáng)度，首先要將其浸入交聯(lián)液中進(jìn)行交聯(lián)。然后再將其切成長條狀并繞任意橫截面形狀的柱狀型芯纏繞成同心環(huán)狀。由于層與層之間的結(jié)合力不強(qiáng)，初生纖維環(huán)需要再次浸入交聯(lián)液進(jìn)行后期的交聯(lián)。魔芋葡甘聚糖在堿性溶液環(huán)境中可以發(fā)生脫乙?；饔?，從而產(chǎn)生交聯(lián)，并且這種交聯(lián)是熱不可逆的，非常穩(wěn)定；明膠在戊二醛溶液中會(huì)產(chǎn)生化學(xué)交聯(lián)，交聯(lián)點(diǎn)為化學(xué)鍵，性質(zhì)穩(wěn)定。利用魔芋葡甘聚糖和明膠的這一特性，交聯(lián)劑選用堿液或戊二醛溶液。
[0017]本發(fā)明的有益效果:
(I)本發(fā)明所用原料魔芋葡甘聚糖、明膠和納米羥基磷灰石均無細(xì)胞毒性，具有良好的生物相容性，并且通過改變魔芋葡甘聚糖和明膠的配比，使支架的降解速率可調(diào)。
[0018](2)本發(fā)明所述方法制備得到的椎間盤纖維環(huán)支架層厚可調(diào)，通過改變薄膜的厚度即可實(shí)現(xiàn)。
[0019](3)本發(fā)明所述方法制備得到的椎間盤纖維環(huán)支架形狀可任意設(shè)計(jì)，通過改變型芯的形狀即可實(shí)現(xiàn)。
[0020](4)本發(fā)明制備的纖維環(huán)支架是對天然椎間盤纖維環(huán)的高度仿真，具有各向異性的結(jié)構(gòu)和力學(xué)特征，能夠承受一定的壓力和張力；另外，纖維環(huán)由多孔的薄膜卷制而成，因而具備較高的孔隙率，有利于細(xì)胞的黏附生長。
【附圖說明】
[0021 ]圖1為該椎間盤纖維環(huán)組織工程支架的制備工藝流程圖。
[0022]圖2為實(shí)施例1、2和3得到的纖維環(huán)支架的紅外光譜圖。
[0023]圖3為實(shí)施例1、2和3得到的纖維環(huán)支架的粉末X射線衍射圖。
[0024]圖4為實(shí)施例2得到的纖維環(huán)支架的掃描電子顯微鏡照片。
[0025]圖5為實(shí)施例3得到的纖維環(huán)支架的掃描電子顯微鏡照片。
[0026]圖6椎間盤纖維環(huán)組織工程支架橫切面圖。
【具體實(shí)施方式】
[0027]下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不限于所述內(nèi)容。
[0028]實(shí)施例1
(I)原液的配制:將明膠加入蒸餾水中靜置2h，然后水浴加熱至50°C，充分?jǐn)嚢柚撩髂z完全溶解;然后加入納米羥基磷灰石粉體，繼續(xù)攪拌直至納米羥基磷灰石粉體在溶液中形成均勻懸浮狀態(tài);加入魔芋葡甘聚糖攪拌至魔芋葡甘聚糖與懸浮液充分混合，攪拌速度為1300 r/min，時(shí)間為30min;然后置于700W功率的微波爐中加熱20s，加熱完成后取出冷卻至室溫得到原液;原液中魔芋葡甘聚糖濃度為30g/L，明膠濃度為25g/L，納米羥基磷灰石濃度為15g/L。
[0029](2)制膜:將原液倒在特定的模板上，原液在重力的作用下流淌并平鋪于模板上形成均勻薄層，薄層厚度為1_，隨后，將薄膜在-30 °C的冰箱中冷凍4h，然后進(jìn)行冷凍干燥。
[0030](3 )膜的交聯(lián):將干燥的膜浸入交聯(lián)液中交聯(lián)12h，交聯(lián)液為濃度為25%的氨水。
[0031](4)初生纖維環(huán)的制備:將半濕狀態(tài)下的膜切成條狀，寬度為10mm，然后繞一型芯纏繞成環(huán)狀;型芯形狀為圓柱形，直徑為8mm。
[0032](5)纖維環(huán)的交聯(lián):用保鮮膜將初生纖維環(huán)連同型芯一起包裹好，并在外面用繩捆綁固定，防止散開，然后再次浸入交聯(lián)液中交聯(lián)12h，保鮮膜上留有孔洞，以使初生纖維環(huán)能夠浸泡在交聯(lián)液中。
[0033](6)纖維環(huán)支架的形成:將交聯(lián)好的纖維環(huán)用蒸餾水反復(fù)浸泡、清洗，除去交聯(lián)劑，然后將纖維環(huán)在-30°C的條件下冷凍25h，之后對樣品進(jìn)行冷凍干燥直至樣品水分完全揮發(fā)，得到干燥的椎間盤纖維環(huán)組織工程支架。
[0034]本實(shí)施例制備得到的椎間盤纖維環(huán)組織工程支架的紅外光譜圖如圖2所示，由圖可以看出，樣品在波數(shù)為1042 cm_1,605 cm—1和564 cm—1處出現(xiàn)的吸收峰對應(yīng)于P043—中P_0鍵的非對稱伸縮振動(dòng)峰，說明材料中存在羥基磷灰石相。樣品在波數(shù)為805 cm—1和878 cm—1處出現(xiàn)的吸收峰對應(yīng)于甘露糖的特征吸收峰，說明樣品中KGM的一級形態(tài)保持完整。樣品在1650 cm—1和1550 cm—1處附近均出現(xiàn)了酰胺Π鍵的吸收峰，說明樣品中膠原分子的一級結(jié)構(gòu)保持完整。
[0035]本實(shí)施例制備得到的椎間盤纖維環(huán)組織工程支架的X射線衍射圖如圖3所示，由圖可以看出，樣品在20 = 31.77°，29 = 32.20° , 2Θ = 32.90°，2Θ = 35.48°對應(yīng)的是羥基磷灰石的(211)，( 112)，(300)，(301)晶面的衍射峰。
[0036]實(shí)施例2
(I)原液的配制:將明膠加入蒸餾水中靜置5h，然后水浴加熱至60°C，充分?jǐn)嚢柚撩髂z完全溶解;然后加入納米羥基磷灰石粉體，繼續(xù)攪拌直至納米羥基磷灰石粉體在溶液中形成均勻懸浮狀態(tài);加入魔芋葡甘聚糖攪拌至魔芋葡甘聚糖與懸浮液充分混合，攪拌速度為1400r/min，時(shí)間為40min;然后置于700W功率的微波爐中加熱22s，加熱完成后取出冷卻至室溫得到原液;原液中魔芋葡甘聚糖濃度為25g/L，明膠濃度為30g/L，納米羥基磷灰石濃度為20g/L。
[0037](2)制膜:將原液倒在特定的模板上，原液在重力的作用下流淌并平鋪于模板上形成均勻薄層，薄層厚度為3_，隨后，將薄膜在50 0C的干燥箱中干燥。
[0038](3)膜的交聯(lián):將干燥的膜浸入交聯(lián)液中交聯(lián)6h，交聯(lián)液為濃度為10%的戊二醛。
[0039](4)初生纖維環(huán)的制備:將半濕狀態(tài)下的膜切成條狀，寬度為12mm，然后繞一型芯纏繞成環(huán)狀;型芯形狀為圓柱形，直徑為9mm。
[0040](5)纖維環(huán)的交聯(lián):用保鮮膜將初生纖維環(huán)連同型芯一起包裹好，并在外面用繩捆綁固定，防止散開。然后再次浸入交聯(lián)液中交聯(lián)8h。保鮮膜上留有孔洞，以使初生纖維環(huán)能