膜增殖。在第10天，處死所有實(shí) 驗(yàn)動(dòng)物以摘除子宮，并取出結(jié)扎中心分節(jié)，置于10%中性緩沖福爾馬林中，以便進(jìn)行組織學(xué) 處理。使用顯微鏡觀察染有蘇木精和苦辛的5微米切片，以確定子宮內(nèi)膜腺的增殖程度。計(jì) 算每只實(shí)驗(yàn)兔的子宮內(nèi)膜增殖抑制百分比，并對(duì)5只動(dòng)物一組的記錄值進(jìn)行平均。在抗-〇]^1^6找測(cè)試中，對(duì)未成熟雌兔連續(xù)6天每日皮下注射5以克雌二酮(含10%乙醇/芝麻油）。 從第7天開(kāi)始，連續(xù)5天對(duì)動(dòng)物皮下注射孕酮（160μ克/天），并通過(guò)皮下注射或以適合的媒介 物口服試驗(yàn)化合物。一組實(shí)驗(yàn)兔僅使用孕酮。使用最后一劑藥物后24小時(shí)，處死所有實(shí)驗(yàn)動(dòng) 物以摘除子宮，去除所有脂肪和連接組織后，確保重量接近〇. 2毫克，并將子宮放入10%中 性緩沖福爾馬林中，以進(jìn)行后續(xù)組織學(xué)處理。使用顯微鏡觀察染有蘇木精和曙紅的5微米切 片，以確定子宮內(nèi)膜腺的增殖程度。通過(guò)單獨(dú)對(duì)比孕酮刺激動(dòng)物，取得測(cè)試化合物各種劑量 水平的子宮內(nèi)膜增殖抑制百分比。表1中顯示的數(shù)據(jù)(兔生物活性)反映出通過(guò)與CDB-2914 有關(guān)的抗-McG i n ty和抗-C1 aub er g分析得出的每種化合物的平均結(jié)果。
[0150] 如表1所列，根據(jù)用于兔PR與兔GR的每種化合物的選擇性，對(duì)受測(cè)抗孕激素進(jìn)行分 級(jí)。同時(shí)，根據(jù)兔子宮內(nèi)的生物活性，對(duì)抗孕激素進(jìn)行分級(jí)。表1中顯示的數(shù)據(jù)，表明用于孕 酮受體的導(dǎo)聯(lián)化合物的親和性，比用于糖皮質(zhì)激素受體的親和性，至少大1.5倍。
[0151] 此類研究的結(jié)果同時(shí)表明，與RU 486和CDB-2914相比，兩種導(dǎo)聯(lián)化合物CDB-4124 和CDB-4059在兔子宮內(nèi)具備較強(qiáng)的抗孕激素活性。兩種化合物均缺少雌激素、雄激素、抗雌 激素和抗雄激素活性。兩種化合物均具備最小的抗糖皮質(zhì)激素受體活性，此特征有別于在 糖皮質(zhì)激素受體結(jié)合中具備中度活性的RU 486和CDB-2914。在此類試驗(yàn)中，CDB-4124的效 用略優(yōu)于CDB-4059。
[0152] 表U-SPRM的受體結(jié)合及生物活性
[0153]
[0154] 范例3。測(cè)量皮質(zhì)醇。
[0155] 多個(gè)不同實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)支持RU 486增加皮質(zhì)醇的結(jié)論，因?yàn)镽U 486在人類和靈長(zhǎng)類動(dòng) 物體內(nèi)具備較強(qiáng)的抗糖皮質(zhì)激素特性。
[0156]但是，如圖1所示，使用RU 486,以10毫克/公斤的劑量進(jìn)行治療的實(shí)驗(yàn)鼠，皮質(zhì)醇 水平未出現(xiàn)顯著差異。相反，使用CDB-4124或CDB-4059，以相同劑量進(jìn)行治療的實(shí)驗(yàn)鼠，較 之對(duì)照組的實(shí)驗(yàn)鼠，具備更高的血清皮質(zhì)醇水平。
[0157] 最高水平在3-4微克/分升(30-40毫微克/毫升）范圍內(nèi)。作用依據(jù)劑量而定，增加 ⑶B-4124的劑量將導(dǎo)致皮質(zhì)醇增加（圖2)。
[0158] RU 486與CDB-4124或CDB-4059對(duì)皮質(zhì)醇水平的作用各有不同，并可通過(guò)下述方法 進(jìn)行說(shuō)明，即假定慢性用藥21天后，較之兩種⑶B化合物，RU 486能夠更好地被鼠肝臟所代 謝。
[0159] 范例4。測(cè)量皮質(zhì)甾酮。
[0160] 皮質(zhì)甾酮是鼠中數(shù)量最多的糖皮質(zhì)激素 。S P RM對(duì)圖1和2中的皮質(zhì)醇的作用，可能 次于對(duì)皮質(zhì)留酮的強(qiáng)烈作用。為更好地解釋這一現(xiàn)象，應(yīng)分組測(cè)量皮質(zhì)留酮水平，并以皮質(zhì) 醇水平顯示最強(qiáng)的變化，如使用CDB-4124,以20毫克/公斤或10毫克/公斤的劑量進(jìn)行治療。 為進(jìn)行比較，可同時(shí)測(cè)試以下分組:一組使用20毫克/公斤⑶B-4124外加10毫克/公斤孕酮， 一組使用10毫克/公斤⑶B-4124外加10毫克/公斤孕酮，一組使用10毫克/公斤RU 486,一組 單獨(dú)使用10毫克/公斤孕酮，一個(gè)對(duì)照組。皮質(zhì)甾酮水平比皮質(zhì)醇水平高出10-40倍。但是， 觀察平均皮質(zhì)留酮水平時(shí)，各組之間幾乎無(wú)差別。治療前化=〇.43，1(^181?11-1 &1118檢驗(yàn)）， 治療21天后化=0.57，&1181?11-1311丨8檢驗(yàn)），或治療28天后并處死(？ = 0.061，&1181?11-Wallis檢驗(yàn)）。
[0161] 為評(píng)估外源性孕酮對(duì)血清皮質(zhì)留酮的作用，可對(duì)比3個(gè)配對(duì)組(它們之間的差別在 于是否使用外源性孕酮）的皮質(zhì)留酮水平（如對(duì)比對(duì)照物和孕酮，或按20毫克/公斤使用 CDB-4124與按20毫克/公斤使用CDB-4124外加孕酮，或按10毫克/公斤使用CDB-4124與按10 毫克/公斤使用CDB-4124外加孕酮）。經(jīng)統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)存在明顯差異：使用孕酮進(jìn)行治療的動(dòng) 物，在治療21天后化=0.029，]\&11111-￥11；[1：1167￥;[10(?011檢驗(yàn)，雙尾），皮質(zhì)留酮水平較低。此 作用未在處死時(shí)取得的血清中加以驗(yàn)實(shí)。孕酮和⑶B-4124組之間，孕酮和RU-486組之間，或 RU-486組和CDB-4124組之間，血清皮質(zhì)留酮并無(wú)差別。
[0162] 同時(shí)將檢查每組中的血清皮質(zhì)醇和血清皮質(zhì)留酮之間的關(guān)系。按20毫克/公斤使 用CDB-4124(r2 = 0.78)，按 10毫克/公斤使用CDB-4124(r2 = 0.82)，及使用RU 486(r2 = 0.85)，兩者之間具備較強(qiáng)的正線性關(guān)聯(lián)。向開(kāi)頭兩個(gè)CDB-4124組添加孕酮，將顯著減弱兩 組之間的關(guān)系(分別為，第10組r2 = 0.34及第11組r2 = 0.37)。孕酮本身并不具備此類正關(guān)系 (￥ = 4.0)。對(duì)照組顯示兩種糖皮質(zhì)激素之間并無(wú)關(guān)系(r2 = 0.064)。因此，使用⑶B-4124的 組中皮質(zhì)醇水平出現(xiàn)增加，與皮質(zhì)留酮水平有關(guān)，原因可能是皮質(zhì)留酮在轉(zhuǎn)化時(shí)得到某種 程度的加強(qiáng)。這與上述CDB-4124的作用相一致:作用于負(fù)責(zé)孕酮和皮質(zhì)醇水平的代謝酶類。
[0163] 雖然未發(fā)現(xiàn)⑶B-4124對(duì)實(shí)驗(yàn)鼠的主要糖皮質(zhì)激素有較強(qiáng)影響，但是，出于安全原 因，應(yīng)對(duì)在第一臨床實(shí)驗(yàn)階段使用CDB-4124或CDB-4059的病人進(jìn)行監(jiān)控，觀察病人可能出 現(xiàn)的抗糖皮質(zhì)激素反應(yīng)，包括皮質(zhì)醇、皮質(zhì)甾酮或ACTH可能增加的情況。
[0164] 范例5。測(cè)試SPRM在子宮細(xì)胞內(nèi)的抗增殖作用。
[0165] 任何子宮細(xì)胞系均能使用。在96微孔滴定板中測(cè)量增殖。向每個(gè)微孔加入5X103細(xì) 胞。使用Perkin Elmer Cetus PR0/TOTTE，向微孔中添加培養(yǎng)基和藥料溶液。培養(yǎng)基為 MEM，并添加5 %胎牛血清。8種藥物濃縮物接受測(cè)試，一式兩份，從0.078微摩爾至10微摩 爾。測(cè)試實(shí)例包括單獨(dú)測(cè)試三苯氧胺，及測(cè)試本規(guī)格中的每種化合物連同三苯氧胺。
[0166] 經(jīng)過(guò)4天的培育后，用含藥物的介質(zhì)替換原有介質(zhì)，經(jīng)過(guò)總共7天的培育后，用三氯 乙酸凝固細(xì)胞單層，并用磺酰羅丹明染料進(jìn)行染色。使用Titertek Multiscan微孔板讀取 器測(cè)量浸出染液的吸收度(492nm)。繪制劑量反應(yīng)曲線（對(duì)照物吸收度與藥片濃度的百分 比），以便評(píng)估用于抑制50%增殖，并作為藥片濃度(微摩爾級(jí))進(jìn)行定義的IC 5Q值。IC5Q值與 用于抑制細(xì)胞增殖的受測(cè)藥物的效價(jià)強(qiáng)度有關(guān)，并可提供用于確認(rèn)化合物是否適于抑制子 宮細(xì)胞過(guò)量增殖所需的信息。
[0167] 范例6。⑶B-4124降低食蟹猴中的黃體期孕酮
[0168] 使用⑶B-4124或RU-486,按1.0毫克/公斤/天或配合安慰劑（對(duì)照物），對(duì)食蟹猴 (Macaca fascicularis) (n= 14)實(shí)施為期36周的口服治療，另一組(n= 14)每月一次使用 Lupran?(利普安）IM。在研究中間階段的一個(gè)月（第14-17周），及研究的最后一個(gè)月（第 33-36周），測(cè)量每只動(dòng)物的泌尿孕酮水平。結(jié)果如下所示：
[0169]
[0170]范例7。⑶B-4124未降低食蟹猴體內(nèi)的卵泡期雌激素。
[0171] 在研究中間階段的一個(gè)月（第14-17周），及研究的最后一個(gè)月（第33-36周），測(cè)量 范例6的每只動(dòng)物的泌尿雌激素水平。卵泡期結(jié)果基于35基線排卵周期。結(jié)果如下所示：
[0172]
[0173] 范例8。⑶B-4124和LllprOTVSK利普安），而非RU 486,可抑制食蟹猴子宮內(nèi)膜上 皮細(xì)胞增殖。
[0174] 在第36周，將范例6每組3只動(dòng)物處死后，于24小時(shí)內(nèi)注射胸腺嘧啶類似物溴脫氧 尿嘧啶核苷(BrdU)，一種增殖細(xì)胞及其后代的標(biāo)識(shí)物，以評(píng)估組織增殖。用顯微鏡觀察經(jīng)過(guò) 染色的全厚度子宮切片，查找就使用階仙的％細(xì)胞陽(yáng)性而言的增殖證據(jù)：
[0175]
[0176] 范例9。⑶B-4124和RU 486而非Luprotl? (利普安）可增強(qiáng)食蟹猴子宮內(nèi)膜上皮 細(xì)胞的細(xì)胞凋亡
[0177] 通過(guò)脫氧核糖核酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記(TUNEL)技術(shù)，在同一只動(dòng)物 的組織載玻片上評(píng)估細(xì)胞凋亡。凋亡細(xì)胞百分比如下所示：
[0178]
[0179] 范例10。從女性月經(jīng)周期的黃體期開(kāi)始的用藥期間，低濃度⑶B-4124可增加子宮 內(nèi)膜厚度。
[0180] 39位患有子宮內(nèi)膜異位癥的絕經(jīng)前成年女性，作為受試者參加為期6個(gè)月的 Pr〇ellex?(CDB-4124)子宮內(nèi)膜異位癥治療研究。此項(xiàng)研究包括3種劑量水平的CDB-4124以 及陽(yáng)性對(duì)照小組。陽(yáng)性對(duì)照物為L(zhǎng)ucHn? (亮丙瑞林），一種GnRH興奮劑，通常用于治療子 宮內(nèi)膜異位癥(又稱Lupron? (利普安））。CDB-4124作為每日口服膠囊，按12.5毫克/天(η =2)、25毫克/天(η = 3)及50毫克/天(η = 3)的劑量，從女性月經(jīng)周期第5天開(kāi)始，使用雙盲 法用藥。另一組(η=4)每月注射一次Lucrm? (亮丙瑞林)緩釋劑以作為陽(yáng)性對(duì)照。
[0181] 所有⑶B-4124劑量，及Lucntv? (亮丙瑞林)劑量，均可在為期6個(gè)月的用藥期間， 緩解與疼痛有關(guān)的病癥，50毫克CDB-4124劑量，比起12.5毫克或25毫克劑量，能夠更有效地 縮短疼痛的持續(xù)時(shí)間并降低強(qiáng)度，并且，在研究過(guò)程中，能夠比Lucrin? (亮丙瑞林)更有 效地(p = 〇.〇〇12)減少疼痛天數(shù)。相比使用活性對(duì)照物L(fēng)ucrin·(亮丙瑞林），能夠更快速 地緩解疼痛。在本研究中，疼痛治療反應(yīng)以兩種方式進(jìn)行分析。參加研究的病人，堅(jiān)持每天 寫(xiě)疼痛日記，以記錄疼痛的嚴(yán)重性及發(fā)生頻率。此外，每次就診時(shí)，病人將填寫(xiě)子宮內(nèi)膜異 位癥狀調(diào)查表，包括用于評(píng)估發(fā)病時(shí)疼痛強(qiáng)度的問(wèn)卷，并通過(guò)0-10分進(jìn)行評(píng)分，其中10分表 示最強(qiáng)烈的疼痛。每日疼痛日記表明，在治療的前3個(gè)月內(nèi)，使用Lucrm? (亮丙瑞林)的女 性，平均有19.4天感到疼痛。使用50毫克CDB-4124的女性，在相同周期內(nèi)疼痛天數(shù)減少1天。 使用25毫克及12.5毫克0^-4124的女性，比起使用最高劑量0^-4124或]111如!1酸（亮丙瑞 林)的女性，疼痛天數(shù)更多。這表明劑量依賴性對(duì)緩解疼痛有所影響。在為期180天的治療期 間，疼痛日記表明使用50毫克⑶B-4124劑量的女性，有170天或96%的無(wú)疼痛天數(shù)(標(biāo)準(zhǔn)偏 差=8.86天）。從統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)來(lái)看，疼痛持續(xù)時(shí)間的縮短，要好于(p = 0.0012)使用Lucnn? (亮丙瑞林)所獲得的117.8天(74%，標(biāo)準(zhǔn)偏差51.4天)無(wú)疼痛天數(shù)。并且，在無(wú)疼痛天數(shù)方 面，CDB-4124的50毫克劑量的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)要好于25毫克和12.5毫克劑量。使用0^-412412.5 毫克及25毫克劑量的病人，無(wú)疼痛天數(shù)分別為115.9天(66%;標(biāo)準(zhǔn)偏差69.2天)及133.6天 (75 % ;標(biāo)準(zhǔn)偏差27.4天）。此類結(jié)果清楚地說(shuō)明⑶B-4124的劑量反應(yīng)。從統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)來(lái)看，25 毫克和12.5毫克劑量的CDB-4124，與Lucri η?（亮丙瑞林)并無(wú)差別。在接受治療的第一個(gè) 月結(jié)束時(shí)，從統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)來(lái)看，與基準(zhǔn)而非其它三個(gè)試驗(yàn)組相比，50毫克Proellex組（ρ = 0.031)的