金芪降糖片治療糖尿病心血管并發(fā)癥的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及中醫(yī)藥領(lǐng)域，設(shè)及金巧降糖片治療糖尿病屯、血管并發(fā)癥。
【背景技術(shù)】
[0002] 糖尿病是一種由于膜島素分泌缺陷及(或）其生物學(xué)作用障礙引起的W高血糖為 特征的代謝疾病，是在遺傳基礎(chǔ)上，有環(huán)境因素參與的遺傳易感性疾病，是一種慢性全身性 代謝疾病，嚴(yán)重危害人類健康，積極開(kāi)展糖尿病的防治工作已成為主要的社會(huì)公共衛(wèi)生問(wèn) 題。
[0003] I型糖尿病的發(fā)病原因主要是由于膜島素分泌絕對(duì)缺少，II型糖尿病是從膜島素 抵抗為主伴膜島素相對(duì)不足到膜島素分泌不足為主伴膜島素抵抗的病理過(guò)程。目前公認(rèn)II 型糖尿病是一種在環(huán)境因素、生活方式的改變的作用下由多個(gè)基因分別或相互作用所導(dǎo)致 的復(fù)雜遺傳病，但是II型糖尿病的病因尚未完全闡明。
[0004] 目前糖尿病是嚴(yán)重威脅人類生命及生活質(zhì)量的一類疾病，其中II型糖尿?。╰ype 2 diabetes melli化s，T2DM)患者約占90%，而II型糖尿最主要致死原因?yàn)橥?、血管并發(fā)癥。
[0005] 西醫(yī)目前常采用飲食、運(yùn)動(dòng)療法橫酷脈類、雙脈類、嚷挫燒二酬類、α-葡萄糖巧酶 抑制劑、瑞格列奈、膜島素等來(lái)治療II型糖尿病，僅嚷挫燒二酬類可改善膜島素抵抗。病人 在用西藥治療的同時(shí)，又不斷地出現(xiàn)動(dòng)脈硬化、冠屯、病和高血壓等并發(fā)癥，Π 型糖尿病的復(fù) 雜機(jī)制及其導(dǎo)致的全身病變是西藥治療的薄弱環(huán)節(jié)。不論是橫脈類的促泌劑還是嚷挫燒二 酬類的增敏劑在實(shí)驗(yàn)和臨床研究中都不具備明顯的減肥功效，而肥胖是2型糖尿病乃至代 謝綜合征的重要病理基礎(chǔ)。
[0006] 流行病學(xué)研究表明肥胖、高熱量飲食等是2型糖尿病最主要的環(huán)境因素。2型糖尿 病是由于膜島素的生物調(diào)節(jié)發(fā)生障礙，膜島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的失活引起膜島素抵抗，導(dǎo)致 膜島素分泌相對(duì)不足，病人常伴有糖脂代謝素亂，出現(xiàn)代謝異常變現(xiàn)為高血糖、高甘油Ξ醋 血癥和高膽固醇血癥等。糖尿病控制較差會(huì)引發(fā)各種并發(fā)癥，其中屯、血管病變?yōu)樘悄虿』?者最嚴(yán)重而突出的問(wèn)題，基本病理為動(dòng)脈硬化及微血管病變導(dǎo)致屯、血管等部位的衰竭病 變，而且病情較重是糖尿病患者致死的主要原因之一。
[0007] 金巧降糖片是W金銀花、黃巧為主要成分的一種比較成熟的中藥降血糖復(fù)方制 劑，一直具有良好的降血糖、降血脂等作用，在臨床應(yīng)用中收到較好的效果。然而目前很少 有研究金巧降糖片對(duì)糖尿病屯、血管并發(fā)癥的治療，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)高脂誘導(dǎo)建立動(dòng)物模型，觀 察金巧降糖片對(duì)高脂誘導(dǎo)的果蛹代謝素亂的調(diào)節(jié)及屯、血管疾病的治療作用，為臨床用藥提 供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
[000引金巧降糖片作為比較成熟的中藥降血糖復(fù)方制劑，一直具有良好的降血糖、降血 脂作用，在糖尿病治療中具有良好的改善膜島素抵抗和糾正脂質(zhì)代謝作用。目前已有研究 提示金巧降糖片可W保護(hù)血管內(nèi)皮，金巧降糖片還可W減輕糖尿病慢性腎損傷，其程度可 能與降脂作用程度相關(guān);但是目前還未有研究金巧降糖片對(duì)糖尿病屯、血管并發(fā)癥的作用， 本實(shí)驗(yàn)首次研究發(fā)現(xiàn)金巧降糖片對(duì)屯、功能具有較好的保護(hù)作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 金巧降糖片在制備治療糖尿病屯、血管并發(fā)癥的組合物的應(yīng)用，金巧降糖片由黃連 10.3重量份黃巧15.4重量份金銀花61.8重量份制成。
[0010] 金巧降糖片在制備治療糖尿病屯、血管并發(fā)癥的組合物的應(yīng)用，用于治療糖尿病并 發(fā)屯、衰。
[0011] 金巧降糖片在制備治療糖尿病屯、血管并發(fā)癥的組合物的應(yīng)用，用于治療高脂飲食 引起的糖脂代謝素亂。
[0012] 金巧降糖片在制備治療糖尿病屯、血管并發(fā)癥的組合物的應(yīng)用，用于治療屯、功能損 傷。
[001引金巧降糖片由黃連10.3重量份黃巧15.4重量份金銀花61.8重量份制成，其具體 方法如下：
[0014] 黃連加70%乙醇回流提取二次，每次2小時(shí)，濾過(guò)，合并濾液，減壓濃縮至相對(duì)密度 為1.15~1.20(60°C )的浸膏，用鹽酸調(diào)節(jié)PH值至1~2，加氯化鋼適量，靜置12小時(shí)，濾過(guò)，沉 淀加水適量，用20 %氨氧化鋼調(diào)節(jié)PH值至6~7，攬拌使溶解，濾過(guò)，取沉淀減壓干燥粉碎備 用；
[0015] 黃巧加80%乙醇回流提取Ξ次，每次2小時(shí)，濾過(guò)，合并濾液，減壓濃縮至相對(duì)密度 為1.25~1.30(60°C)的浸膏，減壓干燥粉碎備用；
[0016] 金銀花加水溫浸二次，每次1小時(shí)，合并提取液，濾過(guò)，減壓濃縮至相對(duì)密度為1.17 ~1.22(60°C)的浸膏，待溫度降至40°C時(shí)，攬拌下緩慢加入乙醇，使含醇量達(dá)70%，靜置24 小時(shí)，濾過(guò)，減壓濃縮至相對(duì)密度為1.22~1.28(60°C)的浸膏，減壓干燥粉碎備用。
[0017] 取上述Ξ種粉末，加入輔料適量，制成顆粒，壓制成1000片，包薄膜衣，即得金巧降 糖片
[001引藥效試驗(yàn)過(guò)程：
[0019] 本研究通過(guò)高脂食物飼養(yǎng)果蛹造模誘導(dǎo)果蛹發(fā)生糖脂代謝素亂，繼而研究發(fā)現(xiàn)高 脂飲食引起糖尿病相關(guān)糖脂代謝素亂可引起屯、管結(jié)構(gòu)和功能的改變，引起提前發(fā)生的屯、 衰。本次研究還發(fā)現(xiàn)金巧降糖片可明顯改善高脂飲食引起的糖脂代謝素亂及保護(hù)代謝素亂 引起的屯、功能損傷。
【附圖說(shuō)明】
[0020] 圖1:金巧降糖片對(duì)高脂飲食果蛹甘油Ξ醋及海藻糖含量的影響
[0021] 圖2:金巧降糖片對(duì)高脂飲食果蛹屯、功能的影響
[0022] 圖3:金巧降糖片對(duì)高脂飲食果蛹屯、管4ebp、pepck mRNA表達(dá)量的影響
[0023] 圖4:金巧降糖片對(duì)高脂飲食果蛹4EBP蛋白憐酸化的影響
[0024] 1 材料
[0025] 1.1藥品與試劑
[0026] 金巧降糖片（天津中新藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司隆順格制藥廠），BCA蛋白濃度測(cè)定 試劑盒（Thermo)，憐酸化4EBPl(Thr37/46)兔抗（CST#2855s)，SYBR巧光定量試劑盒 (Roche)，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)試劑盒（Vazyme)，F(xiàn)ly化p(Ca;rolina Biological S叫ply Co.) iTRIzoKinvitrogen)，葡萄糖測(cè)試試劑盒(Sigma)、甘油Ξ醋試劑盒(上海科華生物工 程股份有限公司），脂肪酶(Sigma)，海藻糖酶(Sigma)。
[0027]引物序列：
[002引1.2儀器
[0029] 人工氣候培養(yǎng)箱(南京恒裕儀器設(shè)備制造有限公司RP-300A)，酶標(biāo)儀(BioTeK基因 有限公司），勻漿機(jī)（IKA T10B)，相差顯微鏡（OLYMPUS BX53F)，EM-CCD (AND0R)，電泳儀 (BI〇-RAD)，PCR儀(Peltier Thermal Cycler PTC-200)。
[0030] 1.4動(dòng)物:野生型（Oregon-R strain)健康果蛹。
[誦]巧法
[0032] 2.1果蛹甘油Ξ醋及海藻糖含量測(cè)定
[0033] 隨機(jī)每組6只果蛹，加入50化1 PBST后高速30s勻漿3次后離屯、取上清.取測(cè)試蛋白 濃度，70°C五分鐘變性后用葡萄糖試劑盒測(cè)試上清葡萄糖含量，加入海藻糖酶37°C解育1小 時(shí)后將海藻糖分解為葡萄糖后再次測(cè)試葡萄糖含量，計(jì)算差值即為海藻糖含量;上清加入 脂肪酶37°C解育過(guò)夜將甘油Ξ醋分解為甘油，甘油Ξ脂試劑盒測(cè)試甘油Ξ醋含量。
[0034] 2.2蛋白免疫印跡分析檢測(cè)口-468口蛋白表達(dá)
[00巧]隨機(jī)每組五只果蛹，用蛋白裂解液提取果蛹組織蛋白，5%SDS-PAGE濃縮膠+12% SDS-PAGE分離膠電泳，轉(zhuǎn)移蛋白至硝酸纖維膜上，W5%脫脂奶封閉，加入憐酸化4EBP( 1; 1000,4°C解育過(guò)夜KPBST洗膜，加入相應(yīng)二抗（1:1000)解育化，PBST洗膜，化學(xué)發(fā)光法顯 影，W化bul in作為內(nèi)參，進(jìn)行半定量分析。
[0036] 2.3果蛹屯、功能分析
[0037] 2.3.1.果蛹人造緩沖液的配置
[003 引 母液：NaCl:6.31gA;KCl:0.37gA;CaC12:0.22gA;MgC12:0.76g/X;Hepes (pH7.1):3.57g/l;Na肥P04:0.084g/l;Na肥03:0.48g/l; 1M NaOH調(diào)節(jié)抑為7.1。
[0039] 糖溶液:薦糖:17. Ig/l;海藻糖:1.89g/L
[0040] 配制1M的薦糖