專利名稱：：用于治療糖尿病血管并發(fā)癥的方法用于治療糖尿病血管并發(fā)癥的方法相關(guān)申請(qǐng)的交叉參考本申請(qǐng)要求2006年6月14日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)No.60/804,656以及20O6年IO月18日提交的美國(guó)非臨時(shí)專利申請(qǐng)No.11/582,894的優(yōu)先權(quán)，所述申請(qǐng)通過(guò)參考全文并入本文。
背景技術(shù)：
：本發(fā)明涉及糖尿病血管并發(fā)癥的藥物治療，特別涉及用薯蕷屬(Z)/o^^M)物種的提取物治療糖尿病血管并發(fā)癥的方法。己經(jīng)提示在糖尿病血管并發(fā)癥的病理中有非酶糖基化(Maillard反應(yīng))。最近的免疫組化研究顯示高度糖基化終產(chǎn)物(AGE)的形成在糖尿病對(duì)象中被加強(qiáng)(Liuetal.，Diabetes.48:2074-2082,1999)。已知AGE形成本身改變組織蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì)。另夕卜，AGE修飾的蛋白質(zhì)和各種類型的細(xì)胞之間的相互作用被認(rèn)為在糖尿病對(duì)象體內(nèi)觀察到的異常情況中具有病理作用。因此，體內(nèi)AGE的過(guò)量積累被認(rèn)為是激發(fā)糖尿病血管并發(fā)癥例如粥樣硬化病變、腎病、血管損傷、神經(jīng)病和視網(wǎng)膜病的主要因素(Vlassaraetal.，JournalofInternalMedicine251:87-101，2002)。慢性高血糖實(shí)質(zhì)上涉及糖尿病血管并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展。在肝臟中，AGE修飾的蛋白質(zhì)的內(nèi)吞導(dǎo)致清道夫受體的丟失和肝竇內(nèi)皮細(xì)胞中胞內(nèi)運(yùn)輸?shù)难舆t(Hansenetal.，Diabetologia45:1379-1388,2002)。在腎臟中，AGE修飾的IV型膠原和層粘連蛋白降低了它們與帶負(fù)電荷的蛋白聚糖相互作用的能力，提高了對(duì)白蛋白的血管通透性(Silbigeretal.，KidneyInt43:853-64，1993)。迄今為止，已經(jīng)有了一些尋求預(yù)防AGE形成、降低AGE對(duì)細(xì)胞的作用和破壞已經(jīng)存在的AGE交聯(lián)的方法。一種重要的藥物學(xué)策略利用了小親核肼化合物氨基胍(AGE介導(dǎo)的交聯(lián)的一種強(qiáng)抑制劑)。另一種AGE抑制藥物仍在開(kāi)發(fā)之中，包括已經(jīng)示出在大鼠中阻止糖尿病性腎小球硬化癥的四4氫噻唑衍生物OPB-9195。也已發(fā)現(xiàn)血管緊張肽轉(zhuǎn)變酶抑制劑(ACEI)例如雷米普利(mmipril)在用鏈脲佐菌素(STZ)處理的糖尿病小鼠體內(nèi)緩解腎病。盡管目前己經(jīng)開(kāi)發(fā)的化合物或藥物己用于抑制AGE和AGE交聯(lián)的形成，但是已有AGE不能被所述特定化合物清除，或者所述藥物損傷糖尿病對(duì)象體內(nèi)的細(xì)胞和組織。確認(rèn)與給予糖尿病對(duì)象的化合物或藥物相關(guān)的毒性和副作用也是困難的。薯蕷是一種用于傳統(tǒng)中藥的非常重要的藥用植物，并且其藥理作用已經(jīng)研究了很多年。在1936年，Tsukamotoetal從薯蕷科(Z)zVwcoreacea)植物中分離了薯蕷皂苷配基(薯蕷的一種類固醇皂苷)，并將所分離的薯蕷皂苷配基用作迅速合成藥用類固醇的原料。然而，尚未進(jìn)行在糖尿病血管并發(fā)癥的治療中使用薯蕷提取物的研究。發(fā)明概述本發(fā)明涉及治療糖尿病血管并發(fā)癥的方法，包括給予需要的對(duì)象治療有效量的薯蕷屬物種的提取物。或者，本發(fā)明涉及薯蕷屬物種的提取物用于制備治療糖尿病血管并發(fā)癥的藥物的用途，其中所述藥物以治療有效量給予需要其的對(duì)象。當(dāng)與附圖一起閱讀時(shí)，上文概述以及下文發(fā)明詳述可以被更好地理解。為了闡明本發(fā)明，在附圖中示出了目前優(yōu)選的實(shí)施方案。然而應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明不限于與附圖相關(guān)的確切實(shí)驗(yàn)條件及參數(shù)。在附圖中圖IA和IB分別是示出薯蕷屬物種的甲醇和乙醇提取物的HPLC分析產(chǎn)生的峰的層析圖2是示出14種薯蕷屬物種的測(cè)試組用單一隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA(RAPD)引物(SEQIDNO:l)擴(kuò)增的擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳標(biāo)記模式的合成圖像；圖3是示出Kupffer細(xì)胞中一系列基因表達(dá)的合成圖像；圖4A至4D是示出STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠的不同肝臟組織學(xué)的顯微圖像，每一幅圖像放大倍數(shù)為400X，比例標(biāo)尺表示50)im;圖5A至5D是示出STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠的不同腎臟組織學(xué)的顯微圖像，每一幅圖像放大倍數(shù)為400X，比例標(biāo)尺表示50Mm;圖6A至6E是示出注射了AGE的小鼠的不同肝臟組織學(xué)的顯微圖像，每一幅圖像放大倍數(shù)為640X,比例標(biāo)尺表示2(Him;圖7A至7E是示出注射了AGE的小鼠的不同腎臟組織學(xué)的顯微圖像，每一幅圖像放大倍數(shù)為640X，比例標(biāo)尺表示20pm。發(fā)明詳述為了更好地理解本發(fā)明，進(jìn)一步詳細(xì)地解釋本文所用的一些術(shù)語(yǔ)。術(shù)語(yǔ)"一個(gè)"在本文中是指一個(gè)或多于一個(gè)(即至少一個(gè))文中的語(yǔ)法賓語(yǔ)。例如，"一個(gè)元件"意味著一個(gè)元件或多于一個(gè)元件。術(shù)語(yǔ)"糖尿病血管并發(fā)癥"在本文中是指在糖尿病病程中出現(xiàn)的血管病變，包括心血管疾病、神經(jīng)病、視網(wǎng)膜病和腎病，其可導(dǎo)致糖尿病患者的殘疾和高死亡率。如本文所用，"百分之"或"％"是指成份的重量百分比，其基于包含所述成份作為一部分的組合物的重量使用。如本文所用，"對(duì)象"是指任何動(dòng)物例如哺乳動(dòng)物、特別地包括人，所述動(dòng)物受到或可能受到糖尿病血管并發(fā)癥的影響。本發(fā)明提供了治療糖尿病血管并發(fā)癥的方法，所述方法包括給予需要的對(duì)象治療有效量的薯蕷屬物種的提取物。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)例中，所述薯蕷屬物種的提取物通過(guò)包括如下步驟的過(guò)程制備(a)將薯蕷屬物種的塊莖與基于醇的溶劑在存在乙酸的情況下混和以獲得提取組合物；(b)對(duì)步驟(a)中獲得的提取組合物進(jìn)行分離處理以獲得可溶性級(jí)分；和(c)從步驟(b)中獲得的可溶性級(jí)分中除去溶劑以獲得薯蕷屬物種的提取物。所述基于醇的溶劑包括任何能夠作為溶劑的合適的醇。例如但不限于，所述基于醇的溶劑包括甲醇、乙醇、異丙醇或丁醇或其混和物。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，所述薯蕷屬物種的塊莖在存在大約1%乙酸溶液的情況下用乙醇提取。優(yōu)選地，所述薯蕷屬物種的塊莖在存在大約1%乙酸溶液的情況下用大約50至大約90%乙醇提取。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述薯蕷屬物種的塊莖在存在大約1%乙酸溶液的情況下用大約85%乙醇提取。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，碾磨所述薯蕷屬物種的塊莖并在存在大約1%乙酸溶液的情況下與大約30%至大約卯％甲醇(例如大約40%甲醇)混和。提取的混和物可以靜置過(guò)夜并通過(guò)過(guò)濾步驟例如真空過(guò)濾分離以獲得濾液。之后可以將所述濾液凍干以獲得薯蕷的粗提取物。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)例中，所述方法任選地在制備過(guò)程的步驟(a)之前包括對(duì)所述薯蕷屬物種的塊莖進(jìn)行預(yù)處理，所述預(yù)處理包括如下步驟(i)將薯蕷屬物種的塊莖浸入大約1%乙酸溶液中；(ii)碾磨所述薯蕷屬物種的塊莖；和(iii)凍干經(jīng)過(guò)碾磨和乙酸處理過(guò)的薯蕷屬物種的塊莖，產(chǎn)生經(jīng)過(guò)碾磨的、凍干的及乙酸處理過(guò)的薯蕷屬物種的塊莖。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，所述薯蕷屬物種提取物可以如下制備-將薯蕷屬物種的塊莖浸入大約1%乙酸溶液中、之后進(jìn)行研磨以及之后將乙酸處理過(guò)的塊莖凍干以及之后通過(guò)用基于醇的溶劑浸泡而提取凍干的塊莖，以及將經(jīng)過(guò)碾磨的凍干的塊莖與基于醇的溶劑混和以形成混和物，以及將該混和物靜置過(guò)夜以獲得提取物。本發(fā)明還提供了治療糖尿病血管并發(fā)癥的方法。所述方法包括給予需要這種治療的對(duì)象治療有效量的薯蕷屬物種的提取物，其中所述提取物通過(guò)包括如下步驟的過(guò)程制備(a)將薯蕷屬物種的塊莖浸入1%乙酸溶液中；(b)碾磨乙酸處理過(guò)的薯蕷屬物種的塊莖；和(C)凍干經(jīng)過(guò)碾磨和乙酸處理過(guò)的薯蕷屬物種的塊莖；產(chǎn)生經(jīng)過(guò)碾磨的、凍干的及乙酸處理過(guò)的薯蕷屬物種的塊莖；(d)將至少一部分步驟(c)的經(jīng)過(guò)碾磨的、凍干的及乙酸處理過(guò)的薯蕷屬物種的塊莖與基于醇的溶劑在存在大約1%乙酸溶液的情況下混和以獲得提取組合物；(e)對(duì)步驟(d)中獲得的提取組合物進(jìn)行分離處理以獲得可溶性級(jí)分；和(f)從步驟(e)中獲得的可溶性級(jí)分中除去溶劑以獲得薯蕷屬物種的提取物。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，在本發(fā)明的制備過(guò)程和治療方法中使用的薯蕷屬物種是參薯CD/ojcwe""/ataL.)cv.Phyto，其特征為當(dāng)薯蕷屬物種的基因組DNA通過(guò)SEQIDNO:9的引物擴(kuò)增時(shí)隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(RAPD)指紋包括如下14個(gè)DNA條帶428bp、452bp、537bp、602bp、723bp、817bp、934bp、H40bp、1242bp、1478bp、1641bp、1904bp、2151bp和2918bp，當(dāng)薯蕷屬物種的基因組DNA通過(guò)SEQIDNO:9的引物擴(kuò)增時(shí)。所述隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(RAPD)分析描述于實(shí)施例4。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，治療有效量的薯蕷屬物種的提取物通過(guò)口服途徑給予需要治療糖尿病血管并發(fā)癥的對(duì)象。但是，所述提取物可以通過(guò)任何其他適當(dāng)?shù)慕o予途徑給予需要的對(duì)象以獲得相似的治療效果，例如靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、透皮途徑，特別是透粘膜途徑包括經(jīng)鼻途徑。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員，所述治療有效量以及給予的劑量和頻率可以容易地根據(jù)他們的知識(shí)和基于本公開(kāi)的僅僅常規(guī)實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)方法學(xué)確定。所述劑量可以是大約1至大約100mg/kg體重/日，優(yōu)選地大約5至大約40mg/kg體重/日，以及最優(yōu)選地大約10至大約30mg/kg體重/曰。提供下文的實(shí)施例以進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明。這些實(shí)施例不是為了限制本發(fā)明的范圍，并且它們也應(yīng)當(dāng)被這樣解釋。實(shí)施例實(shí)施例l:薯蕷屬物種的粗提取物(PH)的制備將薯蕷屬物種的去皮塊莖在存在1%乙酸的情況下浸入基于醇的溶液。攪拌后，將該混和物溶液靜置過(guò)夜。通過(guò)此過(guò)程獲得的可溶性部分進(jìn)行凍干以得到薯蕷屬物種的粗提取物(PH)。特別地，將1.4kg薯蕷屬物種的去皮塊莖切成小塊并浸入1%乙酸溶液。將所述小塊浸入所述乙酸溶液中過(guò)夜并除去上清。在提取之前將所述小塊凍干。將凍干的小塊進(jìn)行碾磨并與大約30%至大約90%甲醇(例如大約40%甲醇)作為大約1.5L至大約2.5L的溶劑在存在大約1%乙酸溶液的情況下混8和。將所述混和物靜置過(guò)夜并通過(guò)真空過(guò)濾進(jìn)行過(guò)濾以獲得濾液。之后將所述濾液凍干以獲得薯蕷屬物種的粗提取物(PH)。或者，將凍干的小塊進(jìn)行碾磨并與大約50%至大約90%乙醇(例如大約85%乙醇)作為大約1.5至大約2.5L的溶劑在存在大約1%乙酸溶液的情況下混和。相似地，將所述混和物靜置過(guò)夜并通過(guò)真空過(guò)濾進(jìn)行過(guò)濾以獲得濾液。之后將所述濾液凍干以獲得薯蕷屬物種的粗提取物(PH)。實(shí)施例2:薯蕷屬物種的粗提取物(PH)的分析將實(shí)施例1中得到的粗提取物(包括甲醇和乙醇提取物)使用具有兩個(gè)泵(LC-10AT)、一個(gè)SPD-10A程控可調(diào)波長(zhǎng)UV/Vis光電二極管陣列檢測(cè)器、一個(gè)SCL-10A系統(tǒng)控制器和一個(gè)配有保護(hù)柱(35mmx4.6mm,并且具有5pm填充；Supdco)的C-18柱(Supdcosil,250mmx4.6mm,并且具有5|im填充；Supelco,Bellefonte，USA)的ShimadzuHPLC系統(tǒng)(具有ClassVP6.12版軟件的ClassVP系列；Shimadzu,Kyoto,Japan)通過(guò)HPLC進(jìn)行分析。PH的HPLC樣品(10mg/mL)使用含有88%水(流動(dòng)相A)和12%甲醇(流動(dòng)相B)的流動(dòng)相制備為20pL等份并上樣至用所述流動(dòng)相以流速0.9mL/min平衡的柱。全部有機(jī)溶劑都是HPLC級(jí)，并在使用之前用0.22^im濾器過(guò)濾并脫氣。將HPLC方法的總運(yùn)行時(shí)間設(shè)定為20min。在所述ShimadzuSPD-10AUV-Vis光電二極管陣列檢測(cè)器上在260nm監(jiān)測(cè)洗脫譜。結(jié)果基于下文表1所列出的參數(shù)進(jìn)行定量。得到的色譜結(jié)果用ClassVP6.12版軟件(Shimadzu,Kyoto,Japan)進(jìn)行處理和記錄。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>參考圖IA和IB,譜中的峰可以很好地分辨。在所述譜中觀察到幾個(gè)峰，其中峰4示出PH中的活性成份。如在圖IA和IB中示出的，峰4的保留時(shí)間是大約7.045min(對(duì)于甲醇提取物)和大約7.474(對(duì)于乙醇提取物)。因此，薯蕷屬物種的甲醇提取物的HPLC譜與乙醇提取物的HPLC譜相似。在化學(xué)成份上薯蕷屬物種的甲醇提取物與薯蕷屬物種的乙醇提取物幾乎相同，因此在治療中它們應(yīng)當(dāng)提供同樣的活性和效力。實(shí)施例3:含有粗提取物(PH)的小鼠詞料的制備將PurinaChow5001(—種可商購(gòu)的小鼠飼料)碾磨為粉末。將凍干的粗提取物PH以代替相同量的被碾磨的飼料的量加入到所述被碾磨的飼料中，形成詞料混和物。將所述詞料混和物均一地與蒸餾水混和，通過(guò)擠壓成型重塑形狀，在微波爐中以適當(dāng)?shù)墓β屎婵?min，并在冷卻至室溫后在-70"C冷凍。在凍干后，將所述飼料混和物制成與最初的PurinaChow飼料非常相似的顆粒。將所述顆粒儲(chǔ)存于-2(TC冰箱。在喂養(yǎng)當(dāng)天將所述顆粒溫至室溫，并用UV燈輻射在無(wú)菌工作臺(tái)上滅菌。制備具有不同濃度粗提取物的飼料混和物。實(shí)施例4:在隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA(RAPD)分析中鑒定薯蕷屬物種DNA提取一種未知薯蕷屬物種(一式二份示于樣品編號(hào)100或102)與13種已知薯蕷屬物種的測(cè)試組一起進(jìn)行鑒定，所述己知薯蕷屬物種包括參薯cv.(栽培變種)TainungNo.1(樣品編號(hào)1)、甘薯(D^cwea"c"/wta)(樣品編號(hào)3)、黃獨(dú)(D/oworeaZm仏z/era)(樣品編號(hào)4)、參薯cv.8702(樣品編號(hào)5)、參薯cv.SanzhiA(樣品編號(hào)6)、參薯cv.SanzhiB(樣品編號(hào)7)、參薯cv.Dayeshoufeng(樣品編號(hào)9)、參薯cv.TainungNo.2(樣品編號(hào)10)、參薯cv.Jifa(樣品編號(hào)67)、參薯cv.ZhangerNo,2(樣品編號(hào)64)、參薯cv.DashanNo.3(樣品編號(hào)13)、參薯cv.DashanNo.2(樣品編號(hào)12)和參薯cv.Taidong(樣品編號(hào)11)，全部在臺(tái)灣生長(zhǎng)。為了通過(guò)測(cè)序鑒定薯蕷屬物種，每一種薯蕷屬樣品收集0.2g新鮮葉片并在研缽中與液氮混和碾磨。將碾磨的組織與900|il2%CTAB提取緩沖液(含有1.4MNaCl、lOOmMTris-HClpH8.0、20rnMEDTA和0.2%卩-巰基乙醇)在1.5ml離心管中混和，之后在65X:水浴中溫育30分鐘。之后對(duì)樣品離心，并將上清液轉(zhuǎn)移至含有600pL氯仿/異戊醇(24:l)的干凈管并振蕩直至樣品處于乳化狀態(tài)。將樣品進(jìn)一步離心，并將上清液轉(zhuǎn)移至干凈管并與40pL10%CTAB(含有0.7MNaCl)和400)iL氯仿/異戊醇(24:l)混和。再次離心樣品，并將上清液(400iiL)轉(zhuǎn)移至干凈管中并與400^LCTAB沉淀緩沖液混和并置于冰上大約15-20分鐘以沉淀DNA。用400mL高鹽TE(10mMTris-HCl,pH8.0;lmMEDTA;禾卩1MNaCl)和800pL95%乙醇漂洗所述DNA樣品。離心所述DNA樣品，并用400|^75%乙醇進(jìn)一步漂洗沉淀，之后將所述DNA沉淀重懸于蒸餾并去離子(dd)H20中并儲(chǔ)存于-2(TC。RAPD反應(yīng)使用隨機(jī)RAPD引物SEQIDNO:1(在此情況中是OPA-18(AGGTGACCGT)(OperonTechnologies,USA))在RAPD分析中擴(kuò)增薯蕷屬物種的基因組DNA。在含有10x緩沖液、2.5mM每種dNTP(dATP,dCTP,dGTP和dTTP)、2.0pM引物(Operon)、5單位7^DNA聚合酶(TaKaRaBiomedicals)和5ng模板DNA的25pL體積中進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)。對(duì)樣品進(jìn)行41個(gè)由在94'C變性lmin、在36°。退火lmin、在72"C延伸2min組成的循環(huán)，以及一個(gè)在72'C進(jìn)行10分鐘的最終延伸循環(huán)。在PCR完成后，將10pL反應(yīng)混和物上樣至含有0.5pg/mL溴化乙錠的2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳。數(shù)據(jù)分析在凝膠電泳中，在凝膠的第一條泳道(最左邊)和最后一條泳道(最右邊)都上樣DNA分子量標(biāo)記(M)，例如0X174DNA/Haelll標(biāo)記(PromegaCo.,USA)，以提供不同大小的參考條帶，例如500bp、1000bp、1500bp、2000bp、2500bp、3000bp、3500bp和4000bp，之后在每一條泳道上樣每種薯蕷屬物種的PCR樣品。從每個(gè)樣品擴(kuò)增的DNA產(chǎn)物的譜用熒光顯象劑顯影，并且用圖像獲取軟件Alphalmager1220獲取攝影圖像。由于測(cè)試組的每一種薯蕷屬物種在RAPD指紋中產(chǎn)生其自己的DNA條帶，因此確定本發(fā)明的薯蕷屬物種的RAPD指紋以與其他薯蕷屬物種區(qū)別。當(dāng)薯蕷屬物種的基因組DNA用SEQIDNO:9的引物擴(kuò)增時(shí)，特定薯蕷屬物種的指紋包括如下14個(gè)DNA條帶428bp、452bp、537bp、602bp、723bp、817bp、934bp、1140bp、1242bp、1478bp、1641bp、1904bp、2151bp和2918bp，當(dāng)薯蕷屬物種的基因組DNA用SEQIDNO:1的OPA-18引物擴(kuò)增時(shí)，該引物用于鑒定未知薯蕷屬物種(圖2中一式二份示于樣品編號(hào)100或102)。也使用Gel-Compar軟件進(jìn)行了聚類分析或?qū)Ψ治?pairanalysis)以計(jì)算兩種薯蕷屬物種之間的相似性指數(shù)。用于所述分析的參數(shù)來(lái)自RAPD指紋。接下來(lái)，通過(guò)未加權(quán)對(duì)組算術(shù)平均值分析(unweightedpair-groupingmeanarithmeticalanalysis,UPGMA)，用如下方程在聚類分析中計(jì)算相似性指數(shù)ii<formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula>其中nxy是薯蕷屬物種x和y的相同DNA條帶的數(shù)目，和ny分別是薯蕷屬物種x和y的總DNA條帶(Nei,M.andW.H.Li.1979，MathematicalModelforstudyinggeneticvariationintermsofrestrictionendonucleases，Proc.Natl.Acad.Soc.U.S.A,76:5269-5273)。未知薯蕷屬物種與參薯cv.SanzhiA或參薯cv.ZhangerNo.2具有大約88.9%的相似性指數(shù)。進(jìn)一步地，所述薯蕷屬物種與黃獨(dú)或甘薯具有大約37.5%的相似性指數(shù)。另外，所述未知薯蕷屬物種與參薯cv.TainungNo.1、參著cv.8702、參暮cv.SanzhiB、參著cv.Dayeshoufeng、參蓄cv.TainungNo.2、參薯cv.DashanNo.3或參薯cv.DashanNo.2具有超過(guò)75.5%的相似性指數(shù)?；诰垲惙治龌?qū)Ψ治鼋Y(jié)果，了解該未知薯蕷屬物種與己知物種不同，而是與參薯(Z)zVwcowaa/ato)亞種更為相似。因此，該未知薯蕷屬物種被命名為參薯cv.Phyto，如在2005年ll月15日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)Ser.No.11/274,775、2006年3月30日公開(kāi)的美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)No.20060068036Al中描述的那樣，所述公開(kāi)的文獻(xiàn)通過(guò)引用并入本文。實(shí)施例5:粗提取物對(duì)體外吞噬測(cè)定的作用Kupffer細(xì)胞的分離和培養(yǎng)對(duì)C57BL6/j小鼠腹膜內(nèi)(ip)注射以1:3的比例混和的Rompim⑧甲苯噻嗪麻醉劑和氯胺酮(S-(+)-氯胺酮)麻醉劑的混和物。每一只小鼠的中心靜脈插入一根聚乙烯導(dǎo)管，用10ml無(wú)Ca2+HBSS緩沖液以lml/min的灌注速度對(duì)肝臟灌注10分鐘，并用含有0.05%IV型膠原酶的HBSS緩沖液以lmL/min的灌注速度灌注10分鐘以軟化肝組織。切下軟化后的肝組織，清洗并用鑷子切開(kāi)以從肝組織中釋放細(xì)胞懸液。在分離結(jié)締組織后，將細(xì)胞懸液用#53尼龍網(wǎng)過(guò)濾并在30g離心3分鐘。之后將細(xì)胞懸液在600g離心5分鐘。棄去上清并在15mLRBC裂解緩沖液中重懸細(xì)胞沉淀并使反應(yīng)進(jìn)行2分鐘。向細(xì)胞懸液中加入15mLRPMI1640培養(yǎng)基并離心，之后在5mLRPMI1640培養(yǎng)基中重懸細(xì)胞沉淀并鋪在含有25%(v/v)PercollTM密度梯度培養(yǎng)基的PercolFM溶液頂部。對(duì)細(xì)胞液進(jìn)行離心，并收集含有富集的Kupffer細(xì)胞的細(xì)胞沉淀。用RPMI1640培養(yǎng)基漂洗富集的Kupffer細(xì)胞并重懸于無(wú)血清的RPMI1640培養(yǎng)基中。12Kupffer細(xì)胞的吞噬測(cè)定將Kupffer細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板上(4x105細(xì)胞/孔)并在添加了10%FCS的RPMI培養(yǎng)基(下文中也稱為10%FCSRPMI培養(yǎng)基)中培養(yǎng)至少24小時(shí)。將培養(yǎng)基更換為添加了不同濃度PH(1000嗎/mL，100pg/mL,10pg/mL和lpg/mL)的2%FCSRPMI培養(yǎng)基。在培養(yǎng)2小時(shí)后，向每一孔中加入重懸于50plPBS中的liLim大小的FITC珠(5x106/孔)并進(jìn)一步在37。C培養(yǎng)1.5小時(shí)。之后，通過(guò)用PBS漂洗四次除去未結(jié)合的lpm大小的FITC珠。加入FluoroQuenchTM染料(0.5iiL/孑L)以使從被攝取的lpm大小的FITC珠發(fā)射的熒光猝滅。在一小時(shí)后用細(xì)胞熒光測(cè)量?jī)x測(cè)量被攝取的1,大小的FITC珠的熒光并用對(duì)照組的熒光歸一化以確定相對(duì)吞噬指數(shù)，如表2所示。表2小鼠Kupffer細(xì)胞分組濃度(照/ml)攝取吞噬指數(shù)對(duì)照2%FCS1陽(yáng)性對(duì)照1001.01(促吞噬肽)101.2*I1.4910001.171001.41"PH101.22"11.25#a.數(shù)據(jù)用Student'st-檢驗(yàn)分析。*P<0.05,#P<0.02,**PO.01用不同濃度的粗提取物PH(1000^ig/mL，100昭/mL,10pg/mL和l昭/mL)處理的小鼠Kupffer細(xì)胞與沒(méi)有進(jìn)行任何處理的小鼠Kupfifer細(xì)胞對(duì)照組相比都示出提高的攝取吞噬。不同濃度的能夠促進(jìn)K邵ffer細(xì)胞吞噬的促吞噬肽在此測(cè)定中是陽(yáng)性對(duì)照。因此，結(jié)果提示薯蕷屬的粗提取物顯著促進(jìn)小鼠Kupffer細(xì)胞的細(xì)胞吞噬。實(shí)施例6:PH對(duì)于相關(guān)基因表達(dá)的作用從用PH處理的細(xì)胞分離總RNA在6孔平板中培養(yǎng)Kupffer細(xì)胞。將培養(yǎng)基用無(wú)血清培養(yǎng)基替換并維持4小時(shí)。分別用濃度為100ng/mL，10|ig/mL和l昭/mL的PH處理細(xì)胞48小13時(shí)。在用PH處理之后，收集細(xì)胞并懸浮于lmLUltraspecTMRNA分離試劑盒(BiotexLaboratoriesInc.(USA))中。通過(guò)進(jìn)行所述試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)方案獲得總RNA。定量鑒定所獲得的總RNA。逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)分析根據(jù)如下步驟進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。首先使mRNA通過(guò)在26.5DEPC處理過(guò)的含有O.lpgoligo-dT、5昭總RNA的無(wú)菌反應(yīng)混和物中在7(TC熱處理10分鐘變性。逆轉(zhuǎn)錄如下進(jìn)行向反應(yīng)混和物中加入4pL10mMdNTP、0.5^1rRNasin、lpiLAMV(禽類成髓細(xì)胞性白血病病毒)反轉(zhuǎn)錄酶(RT)(10單位)和8pl5xRT緩沖液，使得總體積為40iiL，在42"C溫育60分鐘，之后在90"C熱失活5分鐘，從而獲得cDNA產(chǎn)物。接下來(lái)，向2.5pLcDNA產(chǎn)物中加入0半10mMdNTP、0.5(iLProzymeDNA聚合酶(ProtechEnterprise,Taipei,Taiwan)(2單位)、2}iL10xProzymeTM緩沖液、引物(1^L的ljag/joL有義DNA和lpL的l嗎4iL反義DNA)和無(wú)菌水以使總體積為20pL，并在DNA熱循環(huán)儀(Perkin-Elmer-Cetus)中溫育。之后，在變性溫度94°C、退火溫度5CTC和延伸溫度72"C的條件下進(jìn)行30個(gè)循環(huán)的PCR反應(yīng)。用于靶基因(小鼠CD36、小鼠組織蛋白酶和小鼠肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF))的引物序列包括有義和反義引物列于下面的表3中。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>CD36是一種與已知AGE結(jié)合的B型清道夫受體(Vlassaraetal.,JournaloflntemalMedicine251:87-101,2002)。組織蛋白酶D是一種降解AGE的酸性溶酶體蛋白酶(Miyataetal.,TheJournalofBiologicalChemistry272(7):40374042，1997)。HGF在肝臟中由Kupffer細(xì)胞產(chǎn)生，是一種促進(jìn)肝細(xì)胞功能的生長(zhǎng)因子(Lalanietal.，InternationalJournalofMolecularMedicine15:811-817,2005)。在確定粗提取物PH的作用中，在Kupffer細(xì)胞中評(píng)估CD36基因(345bp)(參考GeneBankNumber(Accession):NM—007643，稱為基因小家鼠(Musmusculus)CD36抗原(Cd36),mRNA，根據(jù)ShoreWa/.,NucleicAcidReasearch,30(8):1767-1773，2002中公開(kāi)的進(jìn)行定義)、組織蛋白酶D基因(867bp)(參考GeneBankNumber(Accession):BC54758,稱為小家鼠組織蛋白酶D,mRNA，完全編碼序列)和HGF基因(250bp)(參考GeneBankNumber(Accession):NM—010427.2，稱為小家鼠肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)，mRNA,根據(jù)Ikarietal.,DevelopmentalDynamics228:173-184，2003中公開(kāi)的進(jìn)行定義)的表達(dá)模式，同時(shí)提供p-肌動(dòng)蛋白基因(510bp)(參考GeneBankNumber(Accession):NM_007393，稱為小家鼠肌動(dòng)蛋白，beta,細(xì)胞質(zhì)(Actb):mRNA)的表達(dá)作為內(nèi)部對(duì)照。如圖3所示，所述粗提取物增加了組織蛋白酶D以及CD36和HGF在細(xì)胞中的表達(dá)。同時(shí)，所述表達(dá)模式顯示與Kupffer細(xì)胞的吞噬線性相關(guān)。因此，鑒于組織蛋白酶D、CD36和HGF基因的增加的表達(dá)，粗提取物PH會(huì)明顯地增強(qiáng)AGE的肝清除。實(shí)施例7:PH對(duì)鏈脲佐菌素(STZ)動(dòng)物模型的作用STZ小鼠模型在此實(shí)驗(yàn)中選擇8周齡C57BL/6j小鼠。將所述小鼠隨機(jī)分組為正常組(沒(méi)有STZ誘導(dǎo)的DM(糖尿病)正常小鼠)、對(duì)照STZ組(STZ-誘導(dǎo)的DM小鼠)、200mg/kg/日PH組(給予200mg/kg/日PH的STZ-誘導(dǎo)的DM小鼠)和1000mg/kg/日PH組(給予1000mg/kg/日PH的STZ-誘導(dǎo)的DM小鼠)。每一組中有5只小鼠。為了在所述小鼠中誘導(dǎo)DM，第一天以120mg/kg劑量腹膜內(nèi)(ip)注射STZ(溶于0.3mL0.1M檸檬酸緩沖液，pH4.5)，并且在隨后3天以80mg/kg劑量ip注射。在最后一次注射STZ后，每周監(jiān)控血漿葡萄糖，選擇具有高血漿葡萄糖水平O400mg/dL)的小鼠作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)中的STZ誘導(dǎo)的小鼠。用PH喂養(yǎng)PH組小鼠2個(gè)月，而對(duì)照和正常組小鼠用普通小鼠飼料喂養(yǎng)。兩個(gè)月后，評(píng)估肝臟和腎臟組織病理學(xué)以確定藥物效力。尿白蛋白濃度分析將尿液稀釋IOOX用于蛋白質(zhì)定量。將牛血清白蛋白(BSA)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行系列稀釋(2mg/mL，lmg/mL,500嗎/mL,250嗎/mL,125jig/mL，61.5pg/mL,31.25嗎/mL和Ojig/mL)用于BCA分析。在37卩溫育30分鐘之后，進(jìn)行O.D.570nm吸收測(cè)量，并且進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線作圖。進(jìn)行線性回歸分析以獲得定量標(biāo)準(zhǔn)曲線和W值。從所述標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算總蛋白質(zhì)濃度。尿白蛋白的ELISA測(cè)試將96孔平板的每一個(gè)孔用具有固定的總蛋白質(zhì)含量(100iiLPBS中100嗎總蛋白質(zhì))的稀釋的尿液樣品包被并且在4i:儲(chǔ)存過(guò)夜。之后用漂洗緩沖液(含有0.05%v/v，Tween20的PBS)漂洗所述尿液樣品四次，之后用5%牛乳在室溫封閉2小時(shí)。用所述漂洗緩沖液再次漂洗四次，之后向每一個(gè)孔中加入5(HxL抗-MSA多克隆抗體稀釋液(I:IOOO于3%牛乳中)并在室溫溫育2小時(shí)。用所述漂洗緩沖液漂洗六次，之后向每一個(gè)孔中加入與過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的山羊抗雞IgG稀釋液(I:IOOO于PBS-BSA中)并在室溫溫育2小時(shí)。通過(guò)與lOOpLlmg/mL鄰苯二胺(于0.1M檸檬酸，pH5.5中)和5pLH202溫育確定結(jié)合的過(guò)氧化物酶。在10分鐘后通過(guò)加入2NNH2S04(20pL/孔)終止反應(yīng)，在波長(zhǎng)490nm通過(guò)ELISA讀數(shù)計(jì)測(cè)量吸收并用正常小鼠的平均吸收歸一化以確定相關(guān)指數(shù)，如表4所示。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>***P<0.001表4所示的結(jié)果顯示在給予了200mg/kg/日PH或1000mg/kg/日PH的小鼠中，尿白蛋白水平顯著低于對(duì)照組的STZ誘導(dǎo)的小鼠。因此，上述結(jié)果提示當(dāng)給予200mg/kg/日或1000mg/kg/日粗提取物PH時(shí)，STZ誘導(dǎo)的小鼠的腎臟功能得到恢復(fù)。組織病理學(xué)在處死之后，收集小鼠的肝臟和腎臟組織，除去其周?chē)∪饨M織和結(jié)締組織。之后將組織在4%多聚甲醛中固定并用石蠟包埋，然后將所述組織切為切片，每一切片的厚度為5pm。將組織切片在二甲苯中去石蠟并在梯度乙醇(100%乙醇，95%乙醇,80%乙醇)中漂洗，之后用蘇木精和曙紅(H&E)染色。接下來(lái)，在光鏡下觀察如上文描述所制備的肝組織切片。圖4A示出了來(lái)自正常小鼠的具有肝細(xì)胞的健康肝組織切片。參考圖4B，在STZ誘導(dǎo)的小鼠的肝組織切片中發(fā)現(xiàn)了一些囊泡，提示在肝細(xì)胞中發(fā)生脂肪變性。在給予了不同劑量PH的STZ誘導(dǎo)的小鼠中，肝組織被修復(fù)，并且以劑量依賴性方式防止了破壞，如圖4C和4D所示，盡管在這些肝組織切片中可能仍舊觀察到輕度的糖原積累。圖5A示出了來(lái)自正常小鼠的具有腎小球的健康腎組織切片。在圖5B中，STZ誘導(dǎo)的小鼠的腎組織切片示出了受損腎小球(與正常小鼠的健康腎臟切片對(duì)比)。當(dāng)STZ誘導(dǎo)的小鼠被給予不同劑量PH時(shí)，腎組織被修復(fù)，并且以劑量依賴性方式防止了破壞，如圖5C和5D所示，盡管在這些腎組織切片中可能仍舊觀察到一些受損的腎小球。實(shí)施例8:PH對(duì)AGE-BSA小鼠模型的作用小鼠血清制備每?jī)芍芡ㄟ^(guò)眼眶放血從小鼠收集全血樣品。使血液在室溫凝固至少2小時(shí)，之后離心以獲得血清。將血清在-20。C儲(chǔ)存至進(jìn)行測(cè)定。血清白蛋白純化將小鼠血清在0至4"C保存。沉淀通過(guò)在相同溫度在9000g離心15分鐘除去。將上清液用等體積50。/。乙醇(pH6.7)調(diào)節(jié)至pH6.9并靜置10分鐘，之后進(jìn)一步在9000g離心15分鐘以獲得上清液的級(jí)分I、II和III。將上清液的級(jí)分I、II和III用一半體積的70。/。乙醇(pH5.8)再次滴定以調(diào)節(jié)至pH5.8并靜置10分鐘，之后進(jìn)一步在9000g離心15分鐘以獲得級(jí)分IV沉淀。將級(jí)分IV上清液調(diào)節(jié)至pH4.8，之后在冰上在-5'C靜置60分鐘，并在9000g離心10分鐘以獲得級(jí)分V。將級(jí)分V冷凍并干燥用于重量分析。AGE-MSA制備將0.1g/mlMSA(小鼠血清白蛋白)和180mg/ml葡萄糖分別溶于磷酸鈉緩沖液(pH7.4)。溶液用0.22pm無(wú)菌濾器過(guò)濾。將5mL溶液加入至用封口膜(parafibn)密封的15mL試管并在黑暗中在37。C溫育。儲(chǔ)存8周后，將所述溶液在4r用蒸餾水(1/100，v/v)透析3或4次以完全出去葡萄糖。得到的AGE-MSA用0.22jjm無(wú)菌濾器過(guò)濾，凍干成為粉末并定量，之后重新溶解并儲(chǔ)存于-2(TC。AGE小鼠模型將10周齡C57BL/6J小鼠隨機(jī)分組為正常組(沒(méi)有任何注射的正常小鼠)、MSA對(duì)照組(注射了MSA的小鼠)、200mg/kg/日PH組(給予200mg/kg/日PH的注射了AGE的小鼠)、1000mg/kg/日PH組(給予1000mg/kg/日PH的注射了AGE的小鼠)和AGE-MSA對(duì)照組(注射了AGE-MSA以誘導(dǎo)糖尿病血管并發(fā)癥的小鼠)。每一組中有5只小鼠。所述小鼠靜脈內(nèi)注射體積為200|xL的AGE-MSA。給予小鼠八次靜脈內(nèi)注射，每一次注射含有4mg/次/小鼠對(duì)照MSA或AGE-MSA(2次/周，4周)。從第15日給予小鼠含有不同劑量PH的小鼠飼料。兩個(gè)月后，處死小鼠并取出它們的肝臟和腎臟用于組織病理學(xué)。參考圖6E，在AGE-MSA對(duì)照組的小鼠肝組織切片中肝細(xì)胞形狀不規(guī)則，具有細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)積累，提示大量肝細(xì)胞被破壞。相反，在得自給予了粗提取物PH的小鼠的肝組織切片中未觀察到這種破壞(圖6C和6D)。因此，證明了粗提取物PH可以使AGE-MSA導(dǎo)致的肝臟破壞最小化。在正?；騇SA對(duì)照小鼠的腎組織切片中，腎小球保持完好，細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)沒(méi)有增加(圖7A和7B)。相反，在得自注射了AGE-MSA的小鼠的腎組織切片中觀察到腎小球被明顯破壞并且肥大(圖7E)。當(dāng)注射了AGE的小鼠被給予不同劑量的PH(200mg/kg/日PH和1000mg/kg/日PH)時(shí)，腎組織被修復(fù)并恢復(fù)如同正常小鼠的腎臟。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)了解對(duì)于上文描述的實(shí)施方案可以進(jìn)行改變而不偏離其廣泛的發(fā)明概念。因此，理解本發(fā)明不限于公開(kāi)的特定實(shí)施方案，其涵蓋本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)的各種修飾，如所附權(quán)利要求書(shū)所定義。18權(quán)利要求1.薯蕷屬物種提取物在制備用于治療糖尿病血管并發(fā)癥的藥物中的用途，其中所述藥物以治療有效量給予需要其的對(duì)象。2.權(quán)利要求1的用途，其中所述薯蕷屬物種提取物通過(guò)口服給予。3.權(quán)利要求1的用途，其中所述薯蕷屬物種是參薯p/o^w^丄.)cv.Phyto，其特征為當(dāng)所述薯蕷屬物種的基因組DNA通過(guò)SEQIDNO:9的引物擴(kuò)增時(shí)，隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA(RAPD)指紋包括如下14個(gè)DNA條帶428bp、452bp、537bp、602bp、723bp、817bp、934bp、1140bp、1242bp、1478bp、1641bp、l卯4bp、2151bp和2918bp，當(dāng)所述薯蕷屬物種的基因組DNA通過(guò)SEQIDNO:9的引物擴(kuò)增時(shí)。4.權(quán)利要求1的用途，其中所述薯蕷屬物種提取物通過(guò)包括如下步驟的方法制備(a)將薯蕷屬物種的塊莖與基于醇的溶劑在存在乙酸的情況下混和以獲得提取組合物；(b)對(duì)步驟(a)中獲得的提取組合物進(jìn)行分離處理以獲得可溶性級(jí)分；和(c)從步驟(b)中獲得的可溶性級(jí)分中除去溶劑以獲得薯蕷屬物種提取物。5.權(quán)利要求4的用途，其中所述基于醇的溶劑是基于甲醇的溶劑、基于乙醇的溶劑或其混和物。6.權(quán)利要求1的用途，其中所述薯蕷屬物種提取物通過(guò)包括如下步驟的方法制備-(a)將薯蕷屬物種的塊莖浸入1%乙酸溶液中；(b)碾磨乙酸處理過(guò)的薯蕷屬物種的塊莖；(C)凍干經(jīng)過(guò)碾磨和乙酸處理過(guò)的薯蕷屬物種的塊莖；產(chǎn)生經(jīng)過(guò)碾磨的、凍干的及乙酸處理過(guò)的薯蕷屬物種的塊莖；(d)將至少一部分步驟(c)的經(jīng)過(guò)碾磨的、凍干的及乙酸處理過(guò)的薯蕷屬物種的塊莖與基于醇的溶劑在存在大約1%乙酸溶液的情況下混和以獲得提取組合物；(e)對(duì)步驟(d)中獲得的提取組合物進(jìn)行分離處理以獲得可溶性級(jí)分；和(f)從步驟(e)中獲得的可溶性級(jí)分中除去溶劑以獲得薯蕷屬物種提取物。7.權(quán)利要求6的用途，其中所述基于醇的溶劑是基于甲醇的溶劑、基于乙醇的溶劑或其混和物。全文摘要本發(fā)明提供了一種用于治療糖尿病血管并發(fā)癥的方法，包括給予需要的對(duì)象治療有效量的薯蕷屬物種提取物。所述提取物優(yōu)選地通過(guò)包括(a)用基于醇的溶劑在存在乙酸溶液的情況下提取薯蕷屬物種的塊莖以形成提取組合物，(b)對(duì)步驟(a)中獲得的產(chǎn)物進(jìn)行處理以獲得可溶性級(jí)分，和(c)從步驟(b)中獲得的可溶性級(jí)分中除去溶劑以獲得提取物的過(guò)程制備。文檔編號(hào)A61K36/00GK101500586SQ200780030215公開(kāi)日2009年8月5日申請(qǐng)日期2007年6月14日優(yōu)先權(quán)日2006年6月14日發(fā)明者吳榮燦申請(qǐng)人:國(guó)立陽(yáng)明大學(xué)