以外源性線粒體為有效成份的組合物、其用途及修復(fù)細(xì)胞的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明有關(guān)于抗老化及修復(fù)線粒體受損細(xì)胞的方法，特別指一種以外源性線粒體 為有效成份的組合物、其用途及修復(fù)細(xì)胞的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 線粒體為細(xì)胞內(nèi)負(fù)責(zé)提供細(xì)胞能量，產(chǎn)生三磷酸腺苷（adenosine triphosphate, ATP)。線粒體會(huì)因?yàn)榧?xì)胞內(nèi)能量需求或細(xì)胞壓力的不同，而進(jìn)行動(dòng)態(tài)變化，并非一直處于 單一線粒體狀態(tài)。具體來說，當(dāng)細(xì)胞能量需求增加時(shí)，線粒體會(huì)持續(xù)地分裂（fission)，以 快速地產(chǎn)生三磷酸腺苷；相反地，當(dāng)細(xì)胞處于饑餓狀態(tài)時(shí)，線粒體會(huì)進(jìn)行融合（fusion)， 以降低能量的生產(chǎn)及利用，維持細(xì)胞正常生理功能。此外，線粒體在遭遇如膜電位降低、 線粒體DNA突變（mtDNA)等受損時(shí)，也會(huì)進(jìn)行融合反應(yīng)，通過同源性重組（homologous recombination)的方式，置換受損的線粒體DNA，而當(dāng)線粒體內(nèi)突變的DNA累積過多，以致 無法進(jìn)行修復(fù)時(shí)，線粒體會(huì)被自嗤體（autophagosome)清除，僅留下正常的線粒體（Lamb CA et al.，2013)。是以，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)同時(shí)具有過多受損的線粒體而無法被清除時(shí)，會(huì)使細(xì)胞走向 細(xì)胞凋亡（Mukhopadhyay S et al.，2014)。
[0003] 線粒體的缺損與功能不全與許多疾病相關(guān)，例如：Leber遺傳性視神經(jīng)萎縮 癥（Leber，s hereditary optic neuropathy)類中風(fēng)發(fā)作癥候群（Mitochondrial Enephalomyopathy,Lactic Acidosis, and Strokelike Episodes,MELAS)、肌抽躍療癇合并 紅色I(xiàn)監(jiān)樓肌纖維癥（Myoclonic Epilepsy Associated With Ragged-Red Fibers，MERRF) 等。另外，神經(jīng)退化性疾病，例如亨丁頓舞蹈癥、阿茲海默癥、帕金森氏癥等疾病也與線粒體 分裂融合的能力失調(diào)相關(guān)（Ghavami S et al.，2014)。此外，老化現(xiàn)象或年紀(jì)增長(zhǎng)會(huì)使線粒 體中突變DNA增長(zhǎng)并且累積，而導(dǎo)致相關(guān)疾病的產(chǎn)生，例如老年黃斑部病變（age-related macular degeneration, AMD) (Brennan LA et al. , 2014 ；Jarrett SG et al.，2010)與皮 膚老化等（Blatt T et al.，2005 ;Makrantonaki E et al.，2007)。
[0004] 為能延緩皮膚老化，人們會(huì)使用許多美容保養(yǎng)產(chǎn)品，例如玻尿酸、維生素 A與維生 素 C、抗氧化劑、防曬劑等，或是尋求醫(yī)學(xué)美容診所改善老化現(xiàn)象，例如雷射、肉毒桿菌、電波 拉皮等。但是，目前現(xiàn)有的美容方法皆無法自根本改善或延緩皮膚老化現(xiàn)象的發(fā)生。另有 研究證實(shí)，注射間質(zhì)干細(xì)胞能有效地改善皮膚皺紋等老化現(xiàn)象，而使干細(xì)胞療法被認(rèn)為是 延緩皮膚老化的契機(jī)。然而實(shí)際上，干細(xì)胞取得不容易，大量培養(yǎng)須耗費(fèi)過多時(shí)間與金錢， 并且，干細(xì)胞移植具有突變產(chǎn)生腫瘤或是產(chǎn)生排斥反應(yīng)等風(fēng)險(xiǎn)。因此，目前仍未有一種安全 性高且能確實(shí)有效地改善皮膚老化現(xiàn)象的方法。
[0005] 在1989年的研究指出，給予外源性線粒體與細(xì)胞共同培養(yǎng)，必須通過直接注射或 膜融合后，線粒體始能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，使帶有基因缺陷的線粒體的細(xì)胞恢復(fù)正常功能（King MP et al.，1988 ;King MP et al.，1989)。許多研究也證實(shí)，單純將細(xì)胞與線粒體共培養(yǎng)， 無法使線粒體進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)（Chang JC et al.，2013;Spees JL et al.，1989)，因而也無法 得知直接給予外源性線粒體是否能進(jìn)入細(xì)胞。而由先前技術(shù)的內(nèi)容可知，不同細(xì)胞對(duì)于攝 入外來線粒體的能力可能不同，因此，在線粒體進(jìn)入細(xì)胞的途徑不明前，研究人員無法通過 調(diào)整實(shí)驗(yàn)條件，使與線粒體相關(guān)的實(shí)驗(yàn)加以重復(fù)實(shí)施。
[0006] 再者，雖然細(xì)胞通過吞嗤作用（phagocytosis)攝入外源物質(zhì)，如細(xì)菌等，但是，經(jīng) 吞嗤途徑被攝入的外源物質(zhì)會(huì)與溶酶體（Iysosome)形成吞嗤溶解小體（phagolysosome), 而使外源物質(zhì)降解。因此，一般認(rèn)為，外源線粒體無法通過吞噬作用，而保留在細(xì)胞內(nèi)，并修 復(fù)內(nèi)生性線粒體。而近期研究利用如美國(guó)專利第8648034號(hào)所揭細(xì)胞穿膜勝肽，或如美國(guó) 專利公開第20130022666號(hào)所揭微脂體包覆線粒體，用以幫助線粒體與細(xì)胞膜融合而易于 進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，提高細(xì)胞的氧化呼吸作用。但是，上述方法雖然可以促進(jìn)線粒體送入細(xì)胞中， 但其所使用的載體，如穿膜勝肽與微脂體，可能會(huì)引起線粒體與細(xì)胞膜破裂，造成線粒體的 損傷與目標(biāo)細(xì)胞的毒性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的主要目的即在于提供一種組合物，其包含有效量的外源性線粒體。
[0008] 本發(fā)明的次一目的在于提供該組合物的用途，其用以修復(fù)受損線粒體或改善細(xì)胞 老化。
[0009] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種修復(fù)細(xì)胞的方法，其將有效量的外源性線粒體投 予至一個(gè)體中，使該外源性線粒體完整地被送至細(xì)胞內(nèi)，據(jù)以達(dá)成修復(fù)受損細(xì)胞、改善或預(yù) 防細(xì)胞老化的功效。
[0010] 為能達(dá)成上述目的，本發(fā)明的一實(shí)施例所揭一種組合物，其包含有一外源性線粒 體，以及至少一藥學(xué)上或美容上可接受的載體。
[0011] 較佳地，該組合物更包含有一輔劑，而該輔劑為血清、血漿、補(bǔ)體或至少上述二成 份的組合所組成的群。
[0012] 較佳地，所述外源性線粒體由細(xì)胞中萃取而得。
[0013] 較佳地，所述外源性線粒體通過離心純化的方法自細(xì)胞中獲得。
[0014] 在本發(fā)明的另一實(shí)施例中，上述醫(yī)藥組合物的用途用以改善皮膚細(xì)胞的老化現(xiàn) 象。
[0015] 在本發(fā)明的又一實(shí)施例中，上述組合物的用途用以修復(fù)受損細(xì)胞。
[0016] 本發(fā)明的一實(shí)施例中所揭一種修復(fù)細(xì)胞的方法，其將一有效量的外源性線粒體投 予至一個(gè)體，使所述外源性線粒體進(jìn)入細(xì)胞中，取代受損或老化的線粒體。
[0017] 較佳地，所述外源性線粒體在投予至該個(gè)體前，以由血清、血漿及補(bǔ)體所組成的群 中至少一成分進(jìn)行前處理。
[0018] 本發(fā)明的有益效果為：
[0019] 其一、使用外源性線粒體能克服已知技術(shù)中，以異體細(xì)胞移植所引發(fā)的排斥；
[0020] 其二、外源性線粒體由一般細(xì)胞株或活體取得，來源廣泛，并且不會(huì)對(duì)人體健康有 所危害，例如，已知的細(xì)胞移植技術(shù)，可能會(huì)導(dǎo)致癌癥或腫瘤的發(fā)生；
[0021] 其三、外源性線粒體能直接進(jìn)入細(xì)胞，與內(nèi)生性線粒體融合，取代老化細(xì)胞或受損 細(xì)胞中的受損線粒體，達(dá)到減低細(xì)胞的氧化壓力以及恢復(fù)細(xì)胞正常功能的功效，并且能夠 提供細(xì)胞長(zhǎng)久直接的保護(hù)；
[0022] 其四、外源性線粒體以血清或補(bǔ)體處理后，能夠完整地進(jìn)入細(xì)胞，并且避免以如穿 膜勝肽或微脂體（liposome)處理所引起的細(xì)胞毒性；
[0023] 其五、外源性線粒體能根本性地改善皺紋及皮膚老化的現(xiàn)象，并且有效地促使膠 原蛋白合成增加。
[0024] 據(jù)此，本發(fā)明所揭醫(yī)藥組合物具有高度安全性，而通過投予有效量的醫(yī)藥組合物 至一個(gè)體，通過外源性線粒體進(jìn)入細(xì)胞中，而能達(dá)到修復(fù)線粒體受損細(xì)胞及改善老化現(xiàn)象 的功能。
【附圖說明】
[0025] 圖1為具有紅色熒光標(biāo)定的線粒體與經(jīng)綠色熒光Iysotracker染色的BHK細(xì)胞， 共同培養(yǎng)一小時(shí)后，攝入的線粒體與細(xì)胞內(nèi)溶酶體（Iysosome)相對(duì)位置的結(jié)果。
[0026] 圖2為具有紅色熒光標(biāo)定的線粒體與BHK細(xì)胞共同培養(yǎng)四小時(shí)后，攝入的線粒體 與細(xì)胞內(nèi)溶酶體相對(duì)位置的結(jié)果。
[0027] 圖3A及圖3B為以掃描式電子顯微鏡觀察外源性線粒體被細(xì)胞吞噬的情形，其中， 圖3A中的方框表示，低倍率下正被吞噬的線粒體；圖3B中的箭號(hào)指出，高倍率下正被細(xì)胞 偽足吞噬的線粒體。
[0028] 圖4為具有紅色熒光標(biāo)定的線粒體與以鬼筆環(huán)肽（phalloidin)-FITC染色的BHK 細(xì)胞共同培養(yǎng)四小時(shí)后，觀察線粒體進(jìn)入BHK細(xì)胞的結(jié)果，其中，白色橫條標(biāo)示10 μ m。
[0029] 圖5為以抗生素 actinomycin D (ActD)處理BHK細(xì)胞后，紅色線粒體進(jìn)入BHK細(xì) 胞的結(jié)果。白色橫條標(biāo)示10 μ m。
[0030] 圖6為圖4與圖5,處理或不處理AcD的BHK細(xì)胞，具有外源性線粒體的細(xì)胞比例 的統(tǒng)計(jì)結(jié)果。
[0031] 圖7A為未經(jīng)補(bǔ)體處理的外源性紅色線粒體與帶有綠色熒光線粒體的BHK細(xì)胞共 同培養(yǎng)四小時(shí)后，攝入的線粒體與細(xì)胞內(nèi)線粒體相對(duì)位置的結(jié)果，其中，箭頭標(biāo)示黃色熒 光，代表外源性與內(nèi)生性線粒體在細(xì)胞內(nèi)位置重疊。
[0032] 圖7B為以經(jīng)C3補(bǔ)體10 μ g/mL處理的外源性線粒體與帶有綠色熒光線粒體的BHK 細(xì)胞共同培養(yǎng)四小時(shí)后，攝入的線粒體與細(xì)胞內(nèi)線粒體相對(duì)位