用于減緩細(xì)胞衰老的包含rho激酶抑制劑的組合物及其用圖
【專利說明】用于減緩細(xì)胞衰老的包含RHO激酶抑制劑的組合物及其用 途
[oow] 相關(guān)申請(qǐng) W02] 本申請(qǐng)要求2014年10月6日在韓國(guó)知識(shí)產(chǎn)權(quán)局提交的韓國(guó)專利申請(qǐng) No. 10-2014-0134481的權(quán)益，其完整公開內(nèi)容通過提述并入本文。 發(fā)明領(lǐng)域
[0003] 本公開設(shè)及用于減緩細(xì)胞衰老的組合物、減少哺乳動(dòng)物中細(xì)胞衰老的方法、和治 療哺乳動(dòng)物中細(xì)胞衰老相關(guān)癥狀的方法。
[0004] 發(fā)明背景
[0005] 衰老可定義為細(xì)胞分裂的永久停止。已在細(xì)胞水平觀察到復(fù)制性衰老或細(xì)胞衰老 作為老化模型。當(dāng)持續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞分裂多次，但老化的細(xì)胞不再能分裂。衰老細(xì)胞對(duì) 程序性細(xì)胞死亡有抗性，且一些衰老細(xì)胞保持不分裂狀態(tài)達(dá)幾年。
[0006] 化O激酶是屬于絲氨酸-蘇氨酸激酶的AGC (PKA/PKG/PKC)家族的激酶。包括 ROCKl和R0CK2在內(nèi)的化〇有關(guān)的蛋白激酶（即ROCK)在哺乳動(dòng)物、斑馬魚、爪贍狂enopus) 等中發(fā)現(xiàn)。人ROCKl具有ISOkDa的分子量，而且是小GT化Se化oA的主要下游效應(yīng)物。 哺乳動(dòng)物ROCK包括激酶域、卷曲螺旋區(qū)、和血小板-白細(xì)胞激酶C底物同源（Pleckstrin homology, PH)結(jié)構(gòu)域，當(dāng)化oA-GTP不存在時(shí)血小板-白細(xì)胞激酶C底物同源結(jié)構(gòu)域通過自 身抑制性分子內(nèi)折疊降低ROCK的激酶活性。 陽007] 由于ROCK在與細(xì)胞衰老有關(guān)的細(xì)胞過程中所起的作用，仍然需要開發(fā)用化O激酶 抑制劑減緩Cre化cing)細(xì)胞衰老的組合物和方法。 陽00引 發(fā)明概述
[0009] 提供一種用于在哺乳動(dòng)物中治療與細(xì)胞中的脂褐素積累有關(guān)的癥狀的組合物，所 述組合物包含化O激酶抑制劑作為活性成分。所述細(xì)胞可W是具有脂褐素積累的皮膚組織 細(xì)胞、肌肉組織細(xì)胞或神經(jīng)組織細(xì)胞。優(yōu)選地，所述哺乳動(dòng)物是人。
[0010] 在一個(gè)方面，所述與脂褐素積累有關(guān)的癥狀是神經(jīng)元蠟樣脂褐質(zhì)沉積癥（NCL)、年 齡相關(guān)的黃斑變性、屯、臟的褐色萎縮、肢端肥大癥、去神經(jīng)萎縮、脂質(zhì)肌病、慢性阻塞性肺病 (COPD)、或其組合。
[0011] 提供一種用于在體外或在哺乳動(dòng)物中減少細(xì)胞中脂褐素積累的組合物，所述組合 物包含化O激酶抑制劑作為活性成分。
[0012] 提供一種用于刺激人細(xì)胞的增殖的組合物，所述組合物包含化O激酶抑制劑作為 活性成分。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述人細(xì)胞是成纖維細(xì)胞、肌細(xì)胞或神經(jīng)細(xì)胞。在一個(gè)方面， 所述組合物用于治療皮膚皺紋、降低的修復(fù)傷口的能力、肌肉衰減癥（sarcopenia)、哈-格 二氏早老性綜合征化Utchinson-Gil化rd progeria syn化ome)、或其組合。提供一種減少 哺乳動(dòng)物中細(xì)胞衰老的方法，包括通過對(duì)所述哺乳動(dòng)物施用有效量的化〇激酶抑制劑來減 緩細(xì)胞衰老。
[0013] 提供一種治療哺乳動(dòng)物中的與細(xì)胞衰老有關(guān)的癥狀的方法，其中所述方法包括通 過對(duì)所述哺乳動(dòng)物施用有效量的化O激酶抑制劑來治療與細(xì)胞衰老有關(guān)的癥狀。
[0014] 提供一種治療哺乳動(dòng)物中的胞內(nèi)脂褐素積累相關(guān)癥狀的方法，其中所述方法包括 通過對(duì)所述哺乳動(dòng)物施用有效量的化O激酶抑制劑來治療脂褐素積累相關(guān)病癥。
[0015] 提供一種刺激人細(xì)胞增殖的方法，包括：將所述人細(xì)胞暴露于有效量的化O激酶 抑制劑W刺激所述人細(xì)胞，其中所述人細(xì)胞是成纖維細(xì)胞、肌細(xì)胞或神經(jīng)細(xì)胞。特別地，所 述暴露包括將有效量的化O激酶抑制劑施用給人體部位，其中所述部位是皮膚組織、肌肉 組織或神經(jīng)組織。
[0016] 所述化O激酶抑制劑可W局部施用至包含具有脂褐素積累的細(xì)胞的皮膚組織、肌 肉組織或神經(jīng)組織。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述化O激酶抑制劑的施用通過將化O激酶抑制 劑局部施用至包含具有脂褐素積累的細(xì)胞的組織來進(jìn)行。
[0017] 本申請(qǐng)的方法可用于治療皮膚皺紋、降低的修復(fù)傷口的能力、肌肉衰減癥、哈-格 二氏早老性綜合征、或其組合。
[0018] 附圖簡(jiǎn)述
[0019] 運(yùn)些和/或其他方面從對(duì)例示性實(shí)施方案連同所附附圖的下列描述來看將變得 明顯且更容易領(lǐng)會(huì)的。
[0020] 圖1，該示例圖顯示了暴露于多種濃度的化O激酶抑制劑Y-27632、Fasudil和 SR3677的細(xì)胞的細(xì)胞集落形成； 陽02U 圖2,該系列圖繪出了在存在化O激酶抑制劑Y-27632巧yM)、FasudiUSyM)和 SR3677(0. 5 iiM)情況下培養(yǎng)的衰老成纖維細(xì)胞（37次細(xì)胞傳代后）的相對(duì)細(xì)胞數(shù)對(duì)時(shí)間；
[0022] 圖3是顯微鏡圖像，其例示了在存在化O激酶抑制劑Y-27632巧y M)情況下培養(yǎng) 的衰老成纖維細(xì)胞（37次細(xì)胞傳代后）的細(xì)胞形狀；
[0023] 圖4是細(xì)胞在各種細(xì)胞生長(zhǎng)階段的百分比的圖，其例示了化O激酶抑制劑Y-27632 和化SUdil對(duì)衰老成纖維細(xì)胞（37次細(xì)胞傳代后）的細(xì)胞周期的影響； W24] 圖5是顯微鏡圖像的圖，其例示了在存在化O激酶抑制劑Y-27632巧y M)、 FasudiUS y M)和SR3677 (0. 5 y M)的情況下在含瓊脂培養(yǎng)基中培養(yǎng)衰老成纖維細(xì)胞（37次 細(xì)胞傳代后）的結(jié)果； 陽0巧]圖6至8是例示了在存在化〇激酶抑制劑Y-27632 (5 y M)、Fasudi 1巧y M)和 SR3677(0. SiiM)的情況下培養(yǎng)的衰老成纖維細(xì)胞（37次細(xì)胞傳代后）的衰老有關(guān)的 (SA) - 0 -半乳糖巧酶活性（圖6A、7A和8A的a和b)的顯微鏡圖像的圖，和例示具有衰老 有關(guān)的（SA)-P-半乳糖巧酶活性的細(xì)胞的百分比的圖（圖6B、7B和8B);
[0026] 圖9,該組圖顯示了在存在化O激酶抑制劑Y-27632巧yM)、FasudiUSyM)和 SR3677(0. 5 iiM)的情況下培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞（37次細(xì)胞傳代后）中脂褐素的量；
[0027] 圖10,該組圖顯示了在存在化O激酶抑制劑Y-27632巧yM)、FasudiUSyM)和 SR3677(0. 5 iiM)的情況下培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞（37次細(xì)胞傳代后）中的反應(yīng)性氧種類； 陽02引 圖11，該組圖顯示了在存在化O激酶抑制劑Y-27632巧yM)、FasudiUSyM)和 SR3677(0. 5 iiM)的情況下培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞（37次細(xì)胞傳代后）的線粒體膜電位；
[0029] 圖12,該圖顯示了在存在化〇激酶抑制劑Y-27632(5 yM)、FasudiUSyM)和 SR3677 (0. 5 y M)的情況下培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞（38次細(xì)胞傳代后）中的DNA損傷程度，通過 指示DNA損傷程度的DNA曽星測(cè)定法值NA comet assay)測(cè)量； W30] 圖13是顯微鏡圖像的圖，其例示了在存在化O激酶抑制劑Y-27632巧y M)、 FasudiUSiiM)和SR3677 (0.5 iiM)的情況下培養(yǎng)的成肌細(xì)胞（11次細(xì)胞傳代后）中的細(xì)胞 形狀變化； 陽03U 圖14,該組圖顯示了在存在化O激酶抑制劑Y-27632巧yM)、FasudiUSyM)和 SR3677(0. SiiM)的情況下培養(yǎng)的成肌細(xì)胞（11次細(xì)胞傳代后）中的脂褐素量； 陽03引 圖15,該組圖顯示了在存在化O激酶抑制劑Y-27632巧yM)、FasudiUSyM)和 SR3677(0. SiiM)的情況下培養(yǎng)的成肌細(xì)胞（11次細(xì)胞傳代后）中的反應(yīng)性氧種類； 陽03引 圖16,該組圖顯示了在存在化O激酶抑制劑Y-27632巧yM)、FasudiUSyM)和 SR3677(0. SiiM)的情況下培養(yǎng)的成肌細(xì)胞（11次細(xì)胞傳代后）中的線粒體膜電位； W34] 圖17是顯微鏡圖像的圖，其例示了在存在化O激酶抑制劑Y-27632巧y M)、 FasudiUS y M)和SR3677 (0. 5 y M)的情況下培養(yǎng)的早老性成纖維細(xì)胞（progeric fibroblasts) (17次傳代后）中的細(xì)胞形狀變化；
[0035] 圖18,該組圖顯示了在存在化O激酶抑制劑Y-27632巧yM)、FasudiUSyM)和 SR3677(0. 5 iiM)的情況下培養(yǎng)的早老性成纖維細(xì)胞（17次傳代后）中的脂褐素量；
[0036] 圖19,該組圖顯示了在存在化O激酶抑制劑Y-27632巧yM)、FasudiUSyM)和 SR3677(0. SiiM)的情況下培養(yǎng)的早老性成纖維細(xì)胞（17次傳代后）中的反應(yīng)性氧種類；
[0037] 圖20,該組圖顯示了在存在化O激酶抑制劑Y-27632巧yM)、FasudiUSyM)和 SR3677(0. SiiM)的情況下培養(yǎng)的早老性成纖維細(xì)胞（17次傳代后）的線粒體膜電位；
[0038] 圖21，該圖顯示了在存在化〇激酶抑制劑Y-27632(5 yM)、FasudiUSyM)和 SR3677(0. SiiM)的情況下培養(yǎng)的早老性成纖維細(xì)胞（17次傳代后）中的DNA損傷程度，通 過指示DNA損傷程度的DNA曽星測(cè)定法測(cè)量；和
[0039] 圖22是例示了在存在化〇激酶抑制劑Y-27632 (5 y M)、FasudiUS y M)和 SR3677(0. SiiM)的情況下培養(yǎng)的早老性成纖維細(xì)胞（17次傳代后）的SA-P-半乳糖巧酶 活性的顯微鏡圖像的圖（圖22A的a-e)，和例示具有SA- 0 -半乳糖巧酶活性的細(xì)胞的百分 比的圖（圖22B)。 W40] 圖23顯示了在應(yīng)用Y-27632或作為對(duì)照的DMSO后年老小鼠的時(shí)間匹配的傷口大 小和傷口外觀。
[0041] 圖24代表免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其顯示Y-27632處理在年老小鼠（19個(gè)月齡） 的傷口愈合中起著重要作用。
[0042] 圖25代表W下實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其顯示傷口重塑組織的橫截面面積中膠原沉積的厚度 掲示了在老年小鼠中用Y-27632處理的傷口相比于用DMSO處理的傷口中更密集和更厚的 膠原。 陽0創(chuàng)圖26代表了顯示年老小鼠中用Y-27632處理的傷口相比于用DMSO處理的傷口中 表皮中的PCNA+細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 W44] 發(fā)明詳述
[0045] 現(xiàn)將對(duì)例示性的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)提述，其例子例示在附圖中，其中相似的參照 編號(hào)從頭到尾指相似的要素。在此方面，目前的例示性實(shí)施方案可能具有不同形式且不應(yīng) 理解為受限于本文中陳述的說明。因此，下文僅通過參照附圖描述了例示性實(shí)施方案W解 釋各方面。如本文中使用的，術(shù)語"和/或"包括一個(gè)/種或多個(gè)/種所列關(guān)聯(lián)項(xiàng)的任意和 所有組合。表述如"至少一個(gè)/種"在置于一組要素之前修飾整組要素而不修飾該組的單 個(gè)要素。另外的方面部分將在下面的說明書中陳述，而部分從說明書將是明顯的，或者可通 過實(shí)踐呈現(xiàn)的例示性實(shí)施方案得知。
[0046] 提供可用于減緩細(xì)胞衰老的組合物，其中所述組合物包含化O激酶抑制劑作為活 性成分。
[0047] 化O激酶，也稱為"化O-有關(guān)的蛋白質(zhì)激酶（ROCK)"，是屬于絲氨酸-蘇氨酸激酶 的AGC(PKA/PKG/PKC)家族的激酶。在哺乳動(dòng)物、斑馬魚、爪贍等中發(fā)現(xiàn)ROCK(例如ROCKl 和R0CK2)。人ROCKl具有ISOkDa的分子量且是小GT化Se化oA的主要下游效應(yīng)物。哺 乳動(dòng)物ROCK包含激酶域、卷曲螺旋區(qū)、和血小板-白細(xì)胞激酶C底物同源（Plec