br>[0144] 感染要被治療的受治者可以是人類(lèi)或?qū)θ祟?lèi)有經(jīng)濟(jì)價(jià)值和/或社會(huì)價(jià)值的哺乳動(dòng) 物，例如，除了人類(lèi)之外的食肉動(dòng)物（如貓和狗）、豬(豬、閹豬和野豬）、反芻動(dòng)物（如牛、公 牛、綿羊、長(zhǎng)頸鹿、鹿、山羊、野牛和駱駝）、馬和鳥(niǎo)類(lèi)(包括那些瀕危的、養(yǎng)在動(dòng)物園的鳥(niǎo)類(lèi)）， 以及飛禽，以及更加特別的，馴養(yǎng)飛禽，例如，家禽，如火雞、雞、鴨、鵝、珍珠雞等），因?yàn)樗鼈?同樣對(duì)人類(lèi)有經(jīng)濟(jì)價(jià)值。所述術(shù)語(yǔ)"受治者"不表示特定的年齡。因此，成年的和新生的受治 者均要覆蓋在內(nèi)。
[0145] 本發(fā)明還提供了 IAP拮抗劑在制造用于治療受治者的細(xì)胞內(nèi)感染的藥物方面的用 途。
[0146] 所述藥物可包含附加量的藥學(xué)上可接受的和適合的載體、稀釋劑或賦形劑。這些 載體、稀釋劑或賦形劑包括所有已知的溶劑、分散介質(zhì)、填充劑、固體載體、鑄件 (castings)、抗真菌和抗菌劑、表面活性劑、等滲和吸收劑等。應(yīng)當(dāng)理解的是，所述藥物還可 包含如本文中所述一種或多種額外的治療劑（即除了所述IAP拮抗劑之外的治療劑）。例如， 在感染為HBV感染的情況下，所述藥物可進(jìn)一步包含選自拉米夫定、阿德福韋、替諾福韋、替 比夫定和恩替卡韋的HBV抗病毒劑。在感染為HCV感染的情況下，所述藥物可進(jìn)一步包含聚 乙二醇化IFNa和利巴韋林，和/或米拉韋生（Janssen et al.N Engl J Med，2013，vol.368 (18):1685-94)〇
[0147] 本發(fā)明還設(shè)想了與其它藥物活性劑的聯(lián)合制劑和/或聯(lián)合給藥，所述其它藥物活 性劑包括但不限于TNF-α激動(dòng)劑（如TNF-α)，TRAIL(TNF相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體），STRAIUta 劑，例如但不局限于TRAIL受體抗體。
[0148] 本領(lǐng)域的技術(shù)人員將會(huì)理解的是，本文中所描述的本發(fā)明容許除了這些具體描述 的之外的變體和修飾。會(huì)被理解的是，本發(fā)明包括所有落入其精神和范圍之內(nèi)的變體和修 飾。本發(fā)明還包括所有在本說(shuō)明書(shū)中單獨(dú)或共同提及或指出的步驟、特征、組合物和化合 物，以及兩種以上的所述步驟或特征的任意或全部的組合。
[0149]除非另有定義，否則本文中所用的所有技術(shù)或科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的 普通技術(shù)人員的常規(guī)理解相同的含義。盡管任何與本文所述的這些相類(lèi)似或等同的材料和 方法可被用于實(shí)踐和檢驗(yàn)本發(fā)明，但現(xiàn)在描述的是優(yōu)選的材料和方法。
[0150] 實(shí)施例
[0151] 實(shí)施例1:小鼠的乙型肝炎感染
[0152] 本發(fā)明的發(fā)明人采用了可用于引起小鼠的HBV感染的技術(shù)7,8。將含有大于基因組 長(zhǎng)度HBVl. 2(側(cè)翼為腺伴隨病毒的末端反向重復(fù))的裸質(zhì)粒DNA液壓注射以產(chǎn)生大量的下腔 靜脈壓來(lái)迫使DNA進(jìn)入肝臟，在此其被納入肝細(xì)胞 7'8。重要的是，注入動(dòng)物的DNA不包含任何 的腺伴隨病毒的編碼序列。所述質(zhì)粒未被封裝，故在注射制劑中不存在病毒結(jié)構(gòu)或非結(jié)構(gòu) 蛋白。
[0153] 對(duì)小鼠進(jìn)行間歇放血并分離其血清。采用Qiagen病毒DNA提取試劑盒來(lái)純化病毒 DNA。如前所述9，通過(guò)RT-PCR實(shí)現(xiàn)HBV基因組的絕對(duì)定量。
[0154] 采用這種技術(shù)，C57BL/6小鼠（任一性別為6-12周齡)被感染了HBV，它們表達(dá)表面 抗原、核心抗原和e-抗原，以及表現(xiàn)出高水平的血清HBV DNA(見(jiàn)圖1)。還有，在受感染動(dòng)物 的血清中識(shí)別出了病毒粒子，且肝臟的組織學(xué)檢查顯示出約20%的肝細(xì)胞被感染了 HBV(表 達(dá)HBcAg(乙肝核心抗原））。這個(gè)非常接近地模擬了人類(lèi)感染。而且，非常類(lèi)似于人類(lèi)感染， 小鼠在感染后的8至12周開(kāi)始控制病毒血癥，但超過(guò)感染后的24周仍舊在小鼠的血清中發(fā) 現(xiàn)了HBV DNA(見(jiàn)圖2)。這表明HBV的全復(fù)制生命周期在小鼠肝臟細(xì)胞中進(jìn)行了重演，游離型 HBV轉(zhuǎn)錄模板可能持續(xù)存在于某些肝細(xì)胞中，導(dǎo)致在感染后的24周觀察到病毒血癥的復(fù)發(fā)。
[0155 ] 實(shí)施例2:用b i r i napan t對(duì)小鼠的治療
[0156]用HBV來(lái)感染C57BL/6小鼠，并在感染后6天接受birinapant(30mg/kg腹膜內(nèi)給藥） 或載體對(duì)照(DMSO)每周一次給藥總共3周(3次劑量)的治療。
[0157] HBV感染后六天，小鼠接受birinapant或載體對(duì)照的治療。相比于用載體對(duì)照治療 的小鼠的病毒載量，在三次劑量的birinapant之后，HBV病毒載量減少了兩個(gè)數(shù)量級(jí)。在首 次劑量的birinapant之后的39天，所有birinapant治療的HBV感染小鼠在它們的血清中不 具有可察覺(jué)到的HBV DNA。平均來(lái)看，在此時(shí)間點(diǎn)用載體對(duì)照治療的小鼠在它們的血清中仍 舊具有約IO6個(gè)拷貝的HBV DNA(見(jiàn)圖3)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3次劑量的birinapant在促進(jìn)HBV清除方 面具有相當(dāng)于6次劑量的birinapant的同等效力。birinapant治療早在首次治療劑量后的 10天就實(shí)現(xiàn)了 HBV的清除（見(jiàn)圖4)。
[0158] 實(shí)施例3:cIAPl和cIAP2的基因靶向重演了用birinapant治療所看到的HBV清除動(dòng) 力學(xué)
[0159] 具有ClAPl缺陷(肝特異性缺陷)并且所有組織中CIAP2缺陷的基因靶向小鼠，能夠 以與用birinapant治療的小鼠相似的動(dòng)力學(xué)來(lái)清除HBV感染(見(jiàn)圖5)。
[0160] 實(shí)施例4:birinapant在人類(lèi)外周血單核細(xì)胞(PBMC)中抗HIV-1JR-CSF的活性
[0161] 方法
[0162] 病毒分離
[0163] 從NIAID艾滋病研究和參考試劑計(jì)劃（NIAID AIDS Research and Reference Reagent Program)處獲得了HIV-I分離種群JR-CSF(M組，B亞型，嗜CCR-5的（CCR5-tropic)， 分離自過(guò)濾的AIDS癡呆患者的腦脊液）。利用新鮮的人PBMC制備病毒的近傳代原種（low passage stocks)，并將其儲(chǔ)存在液氮中。在臨用之前，將病毒的預(yù)滴定小樣(pre-titered aliquots)從冷藏庫(kù)取出，在生物安全柜中快速解凍至室溫。
[0164] 在新鮮的人PBMC中的抗HIV效力評(píng)價(jià)
[0165] 從篩選的捐贈(zèng)者（Biological Specialty Corporation，Colmar，PA)中分離HIV和 HBV血清陰性的新鮮人PBMC。細(xì)胞通過(guò)低速離心和在I3BS中重新混懸來(lái)沉淀/洗滌2-3次，以 除去污染性的血小板。然后在50mL離心管內(nèi)將白細(xì)胞化的血液用Dulbecco磷酸鹽緩沖鹽水 (DPBS)1:1 稀釋?zhuān)⑼ㄟ^(guò) 14mL的淋巴細(xì)胞分離介質(zhì)（Lymphocyte Separation Medium，LSM; Mediatech，Inc ·的 Cellgro?;密度I · 078+/-0 · 002g/ml;Cat · #85-072-CL)來(lái)分層，然后在 600X g下離心30分鐘。將帶狀的PBMC輕輕地從生成的界面吸出，隨后通過(guò)低速離心用PBS洗 滌2次。最終的洗滌之后，細(xì)胞通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)排除法(trypan blue exclusion)來(lái)計(jì)數(shù)，并以1 XlO6細(xì)胞/mL在補(bǔ)充了 15%胎牛血清(Fetal Bovine Serum，F(xiàn)BS)和2mM L-谷氨酰胺、4yg/ mL植物血球凝集素(Phytohemagglutinin，PHA; Sigma公司）的RPMI 1640中重新混懸。使所 述細(xì)胞在37°C下孵育48-72小時(shí)。孵育后，將PBMC離心并重新混懸在含15%FBS、2mM L-谷氨 酰胺、lOOU/mL青霉素、100yg/mL鏈霉素和20U/mL重組人IL-2(R&D Systems，Inc公司）的 RPMI 1640中。于培養(yǎng)基中包含IL-2以維持PHA促有絲分裂刺激(mitogenic stimulation) 引發(fā)的細(xì)胞分裂。將PBMC以1-2 X IO6細(xì)胞/mL的濃度保持于此培養(yǎng)基中，兩周更換一次培養(yǎng) 基，直至用于測(cè)定。細(xì)胞在被認(rèn)為用于測(cè)定太老并被舍棄之前，最多保持在培養(yǎng)液中兩周。 單核細(xì)胞衍生的巨噬細(xì)胞(MDM)由于貼附于組織培養(yǎng)瓶上的結(jié)果而在培養(yǎng)中耗盡。
[0166] 對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)PBMC測(cè)定，將來(lái)自至少兩個(gè)正常捐贈(zèng)者的PHA受激細(xì)胞合并（混合在一 起），在新鮮的培養(yǎng)基中稀釋至I X IO6細(xì)胞/mL的最終濃度，以50μLν孔(5 X IO4細(xì)胞/孔)置入 96孔的圓底微培養(yǎng)板的內(nèi)孔中。合并(混合)來(lái)自多于一個(gè)正常捐贈(zèng)者的單核細(xì)胞是用于使 在個(gè)體捐贈(zèng)者之間觀察到的變化降至最低，所述變化源自在HIV感染及對(duì)原代淋巴細(xì)胞群 體的PHA和IL 2的全面反應(yīng)方面的定量和定性差異。各個(gè)培養(yǎng)板均包含病毒/細(xì)胞對(duì)照孔 (細(xì)胞+病毒)和試驗(yàn)孔(藥物+細(xì)胞+病毒）。在此體外測(cè)定中，在整個(gè)孵育期間保持高的PBMC 活力。因此，受感染的孔被用于評(píng)價(jià)抗病毒活性和細(xì)胞毒性。在微量滴定管中以2 X濃度制 備測(cè)試藥物的稀釋度，并采用標(biāo)準(zhǔn)形式將IOOyL的各個(gè)濃度(總共九個(gè)濃度)放入適當(dāng)?shù)目?中。將50yL預(yù)定稀釋度的病毒原種放入各個(gè)測(cè)試孔(最終MOI E 0.1)中。在感染后六天內(nèi)將 PBMC培養(yǎng)物保持在37°C、5 % C02的條件下。此期間之后，收集無(wú)細(xì)胞的上清液樣本以分析逆 轉(zhuǎn)錄酶的活性。取出上清液樣本之后，通過(guò)向所述培養(yǎng)板添加 MTS來(lái)測(cè)定化合物的細(xì)胞毒 性，以確定細(xì)胞活力。還在顯微鏡下檢查了各個(gè)孔，并記錄下任何的異常情況。
[0167] 逆轉(zhuǎn)錄活性測(cè)定
[0168] 利用了基于微量滴定板的逆轉(zhuǎn)錄(RT)反應(yīng)(Buckheit et al · ,AIDS Research and Human Retroviruses 7:295-302,1991)。將氣標(biāo)記的胸苷三磷酸（3H_TTP，80Ci/mmol， NEN)以lmCi/ml溶于I: ldH2〇:乙醇中。通過(guò)混合150yPoly rA(20mg/ml)與0.5ml寡脫氧胸苷 酸（oligodT)(20 單位/ml)及5.35ml無(wú)菌dH2〇而制得了 Poly rA: 〇1 igodT模板：引物 (Pharmacia公司）作為原液，隨后取樣（1.0ml)并在-20°C下儲(chǔ)存。每天新鮮制取RT反應(yīng)緩沖 液，其由 125μ1 1.0M EGTA、125yl dH2〇、125yl 20%Triton Χ100、50μ1 1.0M Tris(pH 7·4)、50μ1 1.0M DTT和40μ1 1.0M MgCl2組成。通過(guò)混合1份3H-TTP、4份dH20、2.5份poly r A: ο I i godT原液和2.5份反應(yīng)緩沖劑而制得了最終的反應(yīng)混合物。將十微升的此反應(yīng)混合 物放入圓底微量滴定板中，加入15μ1含病毒的上清液并混合。所述微量滴定板在37°C下孵 育60分鐘。孵育之后，將反應(yīng)體積點(diǎn)樣到DE81過(guò)濾墊(Wal Iac公司）上，在5 %磷酸鈉緩沖液 或2X SSC(Life Technologies公司）中清洗5次，每次5分鐘，在蒸餾水中清洗2次，每次1分 鐘，在70 %乙醇中清洗2次，每次1分鐘，然后干燥。結(jié)合的放射性(每分鐘計(jì)數(shù)，CPM)采用標(biāo) 準(zhǔn)液體閃爍技術(shù)來(lái)量化。
[0169] 針對(duì)PBMC活力的MTS染色來(lái)測(cè)量細(xì)胞毒性
[0170] 在測(cè)定結(jié)束時(shí)，用可溶性的基于四氮唑的染料MTS ( CelITiter? 96Reagen t， Promega公司）將測(cè)定板染色，以確定細(xì)胞活力和量化化合物毒性。MTS被代謝活性的細(xì)胞的 線粒體酶代謝而產(chǎn)生可溶性甲臜(formazan)產(chǎn)物，允許快速定量分析細(xì)胞活力和化合物毒 性。此試劑是穩(wěn)定的單一溶液，不要求使用前制備。在所述測(cè)定結(jié)束時(shí)，每孔加入10_25yL的 MTS (基于體積的10 %的最終濃度），然后將微量滴定板在37°C、5 %⑶2下孵育4-6小時(shí)以評(píng) 價(jià)細(xì)胞活力。采用粘性板密封器來(lái)代替蓋子，將密封的滴定板倒置幾次以混合所述可溶性 甲職產(chǎn)物，并以Molecular Devices Vmax或SpectraMax Plus酶標(biāo)儀在490/650nm處用分光 光度法讀取所述板。
[0171]數(shù)據(jù)分析
[0172]運(yùn)用自用計(jì)算機(jī)程序，PBMC數(shù)據(jù)分析包括了 I C5q (病毒復(fù)制的50 %抑制）、I C9q (病 毒復(fù)制的90%抑制）、IC95(病毒復(fù)制的95%抑制）、TC5Q(50%細(xì)胞毒性）、TC 9Q(90%細(xì)胞毒 性）、TC95 ( 95%細(xì)胞毒性)和治療指數(shù)值(TI=TC/IC;也稱(chēng)為抗病毒指數(shù)或Al)的計(jì)算。以下 提供了抗病毒活性和毒性二者的原始數(shù)據(jù)和所述數(shù)據(jù)的圖表形式。
[0173] 結(jié)果
[0174]評(píng)價(jià)了含有或不含固定濃度的TNF-α的birinapant抗HIV-I的抗病毒效力，其結(jié)果 總結(jié)于表1中。還有，圖6和7分別顯示了用單獨(dú)的或與10ng/ml TNF-α結(jié)合的各種濃度的 birinapant在PBMC中對(duì)HIV JR_CSF復(fù)制的抑制。
[0175]表1:在PBMC中 Birinapant 土 TNF-α 抗 HIV-IJR-CSF 的活性
[0177] Birinapant在PBMC中展現(xiàn)抗HIV-I的抗病毒活性及某些細(xì)胞毒性。在固定濃度 (10ng/mL)的TNF-α的存在下，在抗病毒效力方面有了6倍的增長(zhǎng)。在細(xì)胞毒性方面的1.6倍 的增長(zhǎng)是在所述測(cè)定的預(yù)期生物差異的范圍內(nèi)。單獨(dú)使用TNF-a在此測(cè)定中發(fā)揮了減少 35 %的HI V復(fù)制的效力，且利用MTS端點(diǎn)不會(huì)影響細(xì)胞活力。
[0178] 實(shí)施例5: birinapant抗HIV-I受感染細(xì)胞的活性
[0179] 方法
[0180] 分離和活化。來(lái)自健康捐贈(zèng)者的PBMC通過(guò)Ficoll (GE)梯度離心來(lái)分離，并用磁珠 (Miltenyi公司）來(lái)去除CD8+細(xì)胞。余下的PBMC或者保持在幼稚態(tài)Cnaive state)，或者在 PHA(10yg/mL)中活化并在 RF10(RPMI，10%FCS，2%谷氨酰胺）（補(bǔ)充有 IL-2(10U/mL)和 IL-7 (25ng/mL))中培養(yǎng)3天。
[0181] HIV感染。在37°C下以0.1的MOI用HIV NL4.3(GFP+，nef缺陷）將活化的PBMC感染2 小時(shí)，或棄去未被感染的。孵育后，將細(xì)胞在PBS中洗滌3次，并在補(bǔ)充有IL-2和IL-7的RFlO 中混懸，并在I X IO6細(xì)胞/mL下進(jìn)一步培養(yǎng)3天。
[0182] birinapant處理。向PBMC補(bǔ)充新鮮的培養(yǎng)基，然后用birinapant(0 · ΙμΜ、IyMSlOy Μ)或單獨(dú)的DMS0(1 %最終濃度)處理6小時(shí)或12小時(shí)。處理之后，將細(xì)胞在最終濃度2% (w/ v)的多聚甲醛中固定。
[0183] FACS。固定的細(xì)胞用PermWash (BD公司）進(jìn)行可滲透化處理，并在4°C下用針對(duì)⑶4 (APC-H7; 1:20)、CD3(PE-Cy7，1:40)和活性半胱天冬酶3(AF647，1:25)的抗體(所有的抗體 均購(gòu)自BD公司）染色1小時(shí)。
[0184] 結(jié)果
[0185] 結(jié)果顯示于圖8中。單次劑量的ΙΟμΜ birinapant之后，55%的HIV受感染細(xì)胞在24 小時(shí)內(nèi)死亡。Mrinapant對(duì)幼稚細(xì)胞的活力具有極小的影響，并對(duì)活化T細(xì)胞具有小的影 響。
[0186]實(shí)施例5:birinapant抗結(jié)核分支桿菌感染的活性
[0187] 用結(jié)核分支桿菌(Mycobacterium tuberculosis)(H37Rv菌株)來(lái)感染總數(shù)32只小 鼠，休養(yǎng)4周后，17只小鼠用Birinipant處理(通過(guò)腹膜內(nèi)注射，30yg/g )，15只小鼠用DMSO處 理，二者均以每周一次的劑量給藥。三次劑量之后，安樂(lè)死小鼠并將肺取出、勻漿化并將勻 衆(zhòng)在Middlebrook 7H11瓊脂板上連續(xù)稀釋上樣。培養(yǎng)3周后確定菌落形成單位(CFU)，結(jié)果 顯示于圖9中。
[0188] 解剖小鼠時(shí)，用顯微鏡注意到birinipant處理組的肺外觀呈現(xiàn)粉色，一致且健康。 與DMSO組相比，脾也是增大了的。結(jié)果顯示出birinipant組中載菌量(0.33Log 1QCFU/肺)在 統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著降低(P = 〇.012)。
[0189] 實(shí)施例6:詰抗TNF-α細(xì)胞因子對(duì)birinapant活性的影響
[0190]用HBV來(lái)感染小鼠，然后在各種指示的時(shí)間點(diǎn)注射(腹膜內(nèi)）TNF-α拮抗抗體。作為 對(duì)照組，給另一群HBV感染小鼠注射不相關(guān)的IgGl同型對(duì)照抗體。
[0191 ] 此實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示于圖10中。如此圖所示，對(duì)TNF-a活性的詰抗抵消了birinapant 的效力。因此，birinapant，至少部分地，提升了內(nèi)源性產(chǎn)生的TNF-α殺死受感染肝細(xì)胞和/ 或降低HBV水平的能力。
[0192] birinapant顯示出促進(jìn)和提高內(nèi)源性產(chǎn)生的TNF-a的能力，以及提升此細(xì)胞因子 消除感染的能力。已知IAP同樣用于調(diào)節(jié)內(nèi)源TRAIL信號(hào)（另一TNF超家族成員），因而 birinapant，通過(guò)其詰抗IAP的能力，也可提升TRAIL摧毀受感染細(xì)胞的能力。
[0193] 數(shù)據(jù)表明birinapant提升了內(nèi)源TNF-α的活性，并促進(jìn)了此細(xì)胞因子摧毀受感染 細(xì)胞的能力。與單獨(dú)的birinapant相比，birinapant與同時(shí)給藥的外源性TNF-α樣分子的組 合，隨后將很可能會(huì)顯示出在摧毀HBV方面的顯著提高的效力(這已在實(shí)施例4中用HIV予以 說(shuō)明）。由于它的毒性，TNF-α難以被給藥人體，但相關(guān)分子TRAIL已被用于人體試驗(yàn)且未發(fā) 現(xiàn)有毒。因此，本發(fā)明的IAP拮抗劑（特別是birinapant)與TRAIL的組合可被用于提高 b i r i napan t的效力并促進(jìn)對(duì)感染細(xì)胞的清除。
[0194] 實(shí)施例7:其它IAP拮抗劑的活性
[0195] 用HBV來(lái)感染小鼠，并用birinapant或描述于Fan等2013(20)的稱(chēng)之為GT13072的 另一 IAP拮抗劑(SMAC模擬物)來(lái)處理。
[0196] 用HBV來(lái)感染C57BL/6小鼠，并在感染后6天將小鼠隨機(jī)分為3群。一群用 birinapant來(lái)處理(如實(shí)施例2所述），另一群接受GT13072每周一