同時(shí)負(fù)載化療藥物和光動(dòng)力治療藥物的細(xì)胞膜微囊的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及一種同時(shí)負(fù)載化療藥物和光動(dòng)力治療藥物的細(xì)胞膜微囊的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]光動(dòng)力治療是采用激光與光動(dòng)力治療藥物(光敏劑)結(jié)合對(duì)疾病組織進(jìn)行特異性殺傷的一種新型治療手段。激光刺激光動(dòng)力治療藥物后，周圍02轉(zhuǎn)變?yōu)閱尉€態(tài)氧等活性氧物質(zhì)，活性氧通過氧化作用殺傷靶細(xì)胞。但起主要?dú)饔玫膯尉€態(tài)氧存活時(shí)間短，實(shí)現(xiàn)光動(dòng)力治療藥物的定位作用是光動(dòng)力治療研究的重點(diǎn)內(nèi)容之一，通過載體對(duì)其傳遞是實(shí)現(xiàn)該功能的一種方法。
[0003]化療也是治療腫瘤等疾病的常用方法。阿霉素為一種蒽環(huán)類抗腫瘤抗生素，為細(xì)胞周期非特異性藥，其作用機(jī)制主要是阿霉素分子嵌入DNA而抑制核酸的合成。主要用于治療急性白血病、惡性淋巴瘤、肝癌、肺癌、胃癌、食管癌、乳腺癌、宮頸癌、膀胱癌、睪丸癌、甲狀腺癌、軟組織腫瘤、骨肉瘤和神經(jīng)母細(xì)胞癌等。目前臨床給藥多為靜脈滴注，但該藥對(duì)骨髓和心臟都有較為嚴(yán)重的毒副作用，并且長(zhǎng)期用藥導(dǎo)致腫瘤多藥耐藥，易造成化療失敗。
[0004]可通過微米和納米尺度的藥物載體，將光動(dòng)力治療藥物和化療藥物聯(lián)合使用，從而克服兩種治療方式各自的缺點(diǎn)，提高療效。通常的藥物載體主要是使用人工合成的聚合物或天然來源的蛋白質(zhì)和多糖作為原料，其結(jié)構(gòu)比較簡(jiǎn)單。但是往往生物相容性差，較易被人體的免疫系統(tǒng)識(shí)別并清除，具有體內(nèi)循環(huán)時(shí)間短且不易到達(dá)病變部位的缺點(diǎn)，這些缺點(diǎn)限制了其推廣與應(yīng)用。
[0005]仿細(xì)胞微囊是由細(xì)胞膜將囊內(nèi)空間與囊外空間隔離開來形成的球狀物質(zhì)。利用細(xì)胞松弛素處理哺乳動(dòng)物細(xì)胞，破壞維持細(xì)胞形態(tài)的肌動(dòng)蛋白的組裝，然后在機(jī)械剪切的作用下制備仿細(xì)胞微囊。
[0006]仿細(xì)胞微囊作為藥物載體有諸多優(yōu)點(diǎn):由于微囊表面實(shí)質(zhì)是一層類細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，因此具有極佳的生物相容性；并且有望降低自體免疫系統(tǒng)的清除作用，具有更好的臨床應(yīng)用價(jià)值。洋地黃皂苷是一種表面活性劑，可以提高細(xì)胞膜的通透性，使得不能自由滲透細(xì)胞膜的親水性藥物分子也可以進(jìn)入細(xì)胞膜微囊內(nèi)部；同時(shí)洋地黃皂苷可以與高濃度的鈣離子結(jié)合，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞膜的再次封閉。因此，可使用洋地黃皂苷暫時(shí)地通透細(xì)胞膜，將化療藥物和光動(dòng)力治療藥物裝載入細(xì)胞膜微囊中；隨后封閉囊壁，實(shí)現(xiàn)藥物的緩釋和保護(hù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是提供一種同時(shí)負(fù)載化療藥物和光動(dòng)力治療藥物的細(xì)胞膜微囊的制備方法。
[0008]本發(fā)明的同時(shí)負(fù)載化療藥物和光動(dòng)力治療藥物的細(xì)胞膜微囊的制備方法，包括以下步驟:
1)在培養(yǎng)有人源細(xì)胞的培養(yǎng)盤中加入20μ?濃度為lmg/mL的細(xì)胞松弛素溶液，37°C下孵育30min ;生理鹽水洗數(shù)次，胰酶消化，離心去掉細(xì)胞，得細(xì)胞膜微囊懸液；
2)取200μg步驟1)所得的細(xì)胞膜微囊加入到lmL洋地黃皂苷與化療藥物的混合溶液中，混合溶液中洋地黃皂苷濃度為10 Pg/mL，化療藥物的濃度為20-200 Pg/mL ;37°C孵育1 ?6h ;
3)將步驟2)所得的細(xì)胞膜微囊離心，用生理鹽水洗去多余的化療藥物；加入lmL光動(dòng)力治療藥物溶液，溶液中光動(dòng)力藥物濃度為20-200 Pg/mL ;37°C孵育1?6h ;
4)在步驟3)的溶液中加入ΙΟμ?0.5mol/mL氯化鈣溶液，37°C下孵育2h ;離心收集細(xì)胞膜微囊，洗滌，得到同時(shí)裝載化療藥物和光動(dòng)力治療藥物的細(xì)胞膜微囊。
[0009]本發(fā)明中所說的人源細(xì)胞可以是內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞或成纖維細(xì)胞；本發(fā)明中所說的化療藥物可以是鹽酸阿霉素；本發(fā)明中所說的光動(dòng)力治療藥物可以是吲哚菁綠。
[0010]本發(fā)明的原理:使用洋地黃皂苷提高細(xì)胞膜通透性，利用細(xì)胞內(nèi)外化療藥物的濃度差將化療藥物裝入細(xì)胞膜微囊；隨后利用化療藥物和光動(dòng)力治療藥物相反的電荷性質(zhì)，通過靜電吸引將大量的光動(dòng)力治療藥物裝入細(xì)胞膜微囊；最后使用氯化鈣溶液封閉細(xì)胞膜。
[0011]本發(fā)明的有益效果在于:
本發(fā)明工藝過程簡(jiǎn)單，制備速度快，可控性好，材料來源于天然細(xì)胞，具有優(yōu)越的生物相容性和傳遞性能；洋地黃皂苷的引入，可暫時(shí)增加細(xì)胞膜微囊的通透性，實(shí)現(xiàn)不能穿透完整細(xì)胞膜的化療藥物鹽酸阿霉素和光動(dòng)力治療藥物吲哚菁綠的裝載，并調(diào)控其裝載量，起到保護(hù)和緩釋的作用。該細(xì)胞膜微囊在808nm的激光照射下可產(chǎn)生活性氧，與化療藥物共同作用殺死腫瘤細(xì)胞，有望用于腫瘤治療。
【附圖說明】
[0012]圖1是細(xì)胞膜微囊的透射電鏡照片，其中(a)為原始的細(xì)胞膜微囊，(b)為裝載有鹽酸阿霉素和吲哚菁綠的細(xì)胞膜微囊。
[0013]圖2是實(shí)施例1所得的同時(shí)負(fù)載化療藥物和光動(dòng)力治療藥物的細(xì)胞膜微囊中的鹽酸阿霉素的釋放曲線。
[0014]圖3是實(shí)施例1所得的同時(shí)負(fù)載化療藥物和光動(dòng)力治療藥物的細(xì)胞膜微囊中的吲哚菁綠的釋放曲線。
[0015]圖4是實(shí)施例1所得的同時(shí)負(fù)載化療藥物和光動(dòng)力治療藥物的細(xì)胞膜微囊在不同光照劑量下對(duì)腫瘤細(xì)胞ifepG2的殺傷效果。
[0016]圖5是實(shí)施例1所得的同時(shí)負(fù)載化療藥物和光動(dòng)力治療藥物的細(xì)胞膜微囊注射到裸鼠體內(nèi)腫瘤部位并光照30s或90s，至第9天解剖后所獲得的腫瘤體積。
[0017]圖6是實(shí)施例1所得的同時(shí)負(fù)載化療藥物和光動(dòng)力治療藥物的細(xì)胞膜微囊注射到裸鼠體內(nèi)腫瘤部位并光照90s，隨后每3天測(cè)量的裸鼠體重。
【具體實(shí)施方式】
[0018]以下結(jié)合實(shí)例進(jìn)一步說明本發(fā)明，但這些實(shí)例并不用來限制本發(fā)明。
[0019]實(shí)施例1
1)在培養(yǎng)有人源內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)盤中加入20μ?濃度為lmg/mL的細(xì)胞松弛素溶液，37°C下孵育30min ;生理鹽水洗三次，胰酶消化，500rpm離心lOmin去掉細(xì)胞，上清液即為細(xì)胞膜微囊懸液；
2)取20(^g步驟1)所得的細(xì)胞膜微囊加入到lmL洋地黃皂苷與化療藥物鹽酸阿霉素的混合溶液中，混合溶液中洋地黃皂苷濃度為10 Pg/mL，鹽酸阿霉素的濃度為200 Pg/mL ;37°C孵育