奇壬醇在制備治療多發(fā)性硬化藥物的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，特別設(shè)及一種奇壬醇在制備治療多發(fā)性硬化藥物的應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】
[0002] 多發(fā)性硬化（M巧是最常見的一種中樞神經(jīng)脫髓銷疾病。EAE實(shí)驗(yàn)性變態(tài)反應(yīng)性腦 脊髓炎（EA巧是一種W特異性致敏的CD4+T細(xì)胞介導(dǎo)為主的，W中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)小血管周 圍出現(xiàn)單個(gè)核細(xì)胞浸潤及髓銷脫失為特征的自身免疫性疾病，是人類多發(fā)性硬化（M巧的 理想動(dòng)物模型。多發(fā)性硬化應(yīng)及早診斷，及早治療，遵循循證醫(yī)學(xué)證據(jù)，結(jié)合患者的經(jīng)濟(jì)條 件和意愿，進(jìn)行合理治療。但是目前有循證醫(yī)學(xué)論據(jù)支持的藥物相當(dāng)有限，并且價(jià)格昂貴。 目前國內(nèi)治療MS因受經(jīng)濟(jì)條件和醫(yī)療保險(xiǎn)報(bào)銷等因素限制，只有極少數(shù)患者能用干擾素 0治療，絕大多數(shù)還是使用腎上腺糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑等治療，效果有限并且副作用 大。稀簽草是我國常用的抗風(fēng)濕中藥，奇壬醇化irenol)是從稀簽草分離得到的主要成分， 前期研究奇壬醇在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎模型（CIA)中具有抗炎作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺點(diǎn)與不足，提供奇壬醇在制備治療多 發(fā)性硬化藥物的應(yīng)用。
[0004] 本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：奇壬醇在制備治療多發(fā)性硬化藥物的應(yīng) 用。
[0005] 所述的奇壬醇在制備治療多發(fā)性硬化的口服藥物的應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果：本發(fā)明發(fā)現(xiàn)口服奇壬醇能夠誘導(dǎo) 致敏性CD4巧細(xì)胞通過線粒體途徑發(fā)生調(diào)亡，可W顯著延遲多發(fā)性硬化動(dòng)物模型-EAE的發(fā) 病時(shí)間，并且顯著減輕EAE的臨床癥狀。W奇壬醇作為治療多發(fā)性硬化的口服藥物，成本低 廉，分子機(jī)制明確，為治療多發(fā)性硬化提供了新的治療藥物。
【附圖說明】
[0007] 圖1是奇壬醇的結(jié)構(gòu)；
[0008] 圖2是不同動(dòng)物模型動(dòng)物服用奇壬醇后的發(fā)病時(shí)間結(jié)果圖；
[0009] 圖3是不同動(dòng)物模型的動(dòng)物服用奇壬醇后的的病理結(jié)果檢測圖；
[0010] 圖4是kirenol顯示抑制血清中炎性細(xì)胞因子IFN-丫和IL-17A的分泌結(jié)果圖， 其中：A為kirenol顯示抑制血清中炎性細(xì)胞因子IFN-丫的分泌結(jié)果，B為kirenol顯示抑 制血清中炎性細(xì)胞因子IL-17A的分泌結(jié)果；
[0011] 圖5是流式細(xì)胞儀檢測不同動(dòng)物模型小鼠服用奇壬醇后淋己結(jié)T細(xì)胞亞群Thl細(xì) 胞的結(jié)果；
[0012] 圖6是流式細(xì)胞儀檢測不同動(dòng)物模型小鼠服用奇壬醇后淋己結(jié)T細(xì)胞亞群化17 細(xì)胞的結(jié)果；
[0013] 圖7是流式細(xì)胞技術(shù)分析不同動(dòng)物模型小鼠服用奇壬醇后naiveT細(xì)胞和效應(yīng)性 /記憶性T細(xì)胞百分比的結(jié)果圖；
[0014] 圖8是流式細(xì)胞技術(shù)分析不同動(dòng)物模型小鼠服用奇壬醇后體內(nèi)淋己細(xì)胞調(diào)亡檢 測結(jié)果圖；
[0015] 圖9是體外實(shí)驗(yàn)研究奇壬醇抑制EAE的機(jī)制結(jié)果圖，將EAE型小鼠淋己細(xì)胞體外 培養(yǎng)用M0G刺激活化，并同時(shí)加入不同濃度的奇壬醇培養(yǎng)不同的時(shí)間，檢測M0G特異性效應(yīng) 性T細(xì)胞的增殖和調(diào)亡百分比；
[0016] 圖10是體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究奇壬醇促進(jìn)M0G特異性CD4巧細(xì)胞調(diào)亡的分子機(jī)制 結(jié)果圖；運(yùn)用Westernblotting和流式細(xì)胞技術(shù)分析M0G特異性CD4巧細(xì)胞的調(diào)亡相關(guān)蛋 白表達(dá)和運(yùn)行化spase3抑制劑后的調(diào)亡況百分比及化spase3的活性。
【具體實(shí)施方式】
[0017] 下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限 于此。
[001引 實(shí)施例1
[0019] 奇壬醇作為治療多發(fā)性硬化的口服藥物進(jìn)行應(yīng)用
[0020] 第1步：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組，建立疾病模型并進(jìn)行治療，（第一組，Control組：正常老 鼠；第二組，Control+Kirenol組：正常老鼠灌胃Kirenol;第S組，EAE組，小鼠建立EAE疾 病模型；第四組，EAE+Kirenol組，小鼠建立EAE疾病模型并同時(shí)灌胃Kirneol)。觀察動(dòng)物 臨床表現(xiàn)，并記錄發(fā)病時(shí)間和疾病評(píng)分，取腰髓做H&E病理染色，發(fā)現(xiàn)奇壬醇可顯著抑制中 樞神經(jīng)系統(tǒng)淋己細(xì)胞浸潤，對(duì)照組發(fā)現(xiàn)奇壬醇并不影響正常老鼠的中樞神經(jīng)系統(tǒng)。結(jié)果如 圖2-3所示。從圖2-3可W看出，kirenol顯著延遲EAE的發(fā)病時(shí)間，并減輕EAE的臨床癥 狀（圖2)。取四組小鼠腰髓做H&E染色，結(jié)果顯示kirenol顯著抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性細(xì) 胞浸潤，kireno對(duì)正常小鼠的中樞神經(jīng)系統(tǒng)沒有影響（圖3)。圖1顯示的是奇壬醇的單體 結(jié)構(gòu)。
[002。第2步：檢測動(dòng)物體內(nèi)CD巧淋己細(xì)胞亞群比例，發(fā)現(xiàn)奇壬醇顯著抑制致炎性T細(xì) 胞（化1和化17)的比例。對(duì)照組發(fā)現(xiàn)奇壬醇并不影響正常老鼠T細(xì)胞分群。取四組小 鼠的血清，檢測血清中的炎性細(xì)胞因子，結(jié)果顯示kirenol顯示抑制血清中炎性細(xì)胞因子 IFN-丫和IL-17A的分泌（圖4A、B)，流式細(xì)胞儀檢測四組小鼠淋己結(jié)T細(xì)胞亞群，結(jié)果顯 示kirenol顯著下調(diào)EAE小鼠體內(nèi)化1 (圖5A、B)和化17細(xì)胞的百分比（圖6A、B)。注釋： Thl細(xì)胞分泌炎性細(xì)胞因子IFN- 丫，化17細(xì)胞分泌炎性細(xì)胞因子IL-17A，圖5A和圖6A是 代表性的流逝細(xì)胞圖，圖5B和圖6B是12只小鼠的統(tǒng)計(jì)圖。
[0022]第3步：檢測動(dòng)物體內(nèi)初始T細(xì)胞（na'iveT)和記憶性成熟T細(xì)胞（memo巧T cell)的比例，發(fā)現(xiàn)奇壬醇可顯著抑制引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓銷病變的的記憶性成熟T細(xì) 胞的比例，初始T細(xì)胞會(huì)代償性增高。對(duì)照組發(fā)現(xiàn)奇壬醇并不影響正常老鼠初始T細(xì)胞 (naiveT)和記憶性成熟T細(xì)胞（memo巧TceU)的比例。取四組小鼠的淋己結(jié)，制成淋 己細(xì)胞懸液，流式細(xì)胞技術(shù)分析naiveT細(xì)胞的百分比，結(jié)果顯示kirenol處理的EAE小鼠 體內(nèi)初始T (naiveT)細(xì)胞上調(diào)（CD4+CD62L+和CD4+CCR7+)(圖7A、B)，但是記憶性的T細(xì)胞 百分比下調(diào)（CD4+CXCR3+ ;CD4+CCR6+ ;CD4+CD44hi曲CD62L10W)(圖7C、D、巧。Kirenol不 影響正常小鼠的T細(xì)胞類別。
[0023] 第4步：取動(dòng)物體內(nèi)淋己細(xì)胞做調(diào)亡檢測發(fā)現(xiàn)奇壬醇通過誘導(dǎo)CD巧細(xì)胞調(diào)亡來抑 制EAE。取四組小鼠的淋己結(jié)，制成淋己細(xì)胞懸液，體外用抗原M0G(制備EAE動(dòng)物模型的 抗原）刺激培養(yǎng)48小時(shí)，用3H滲入法檢測M0G特異性淋己細(xì)胞的增殖，結(jié)果現(xiàn)在kirenol 處理過的EAE小鼠體內(nèi)M0G特異性淋己細(xì)胞的增殖顯著下降（圖8A)，流式細(xì)胞技術(shù)檢測四 組小鼠體內(nèi)CD4巧細(xì)胞的調(diào)亡，結(jié)果顯示kirenol顯著增加EAE小鼠體內(nèi)CD4巧細(xì)胞的調(diào) 亡（圖8B、C).Kirenol不影響正常小鼠的CD4巧細(xì)胞調(diào)亡。取EAE小鼠淋己結(jié)，制成淋己 細(xì)胞懸液，體外用M0G刺激培養(yǎng)12、24和36小時(shí)，同時(shí)加入不同濃度kirenol,用3H滲入 法檢測M0G特異性淋己細(xì)胞的增殖，結(jié)果顯示kirenol抑制M0G特異性淋己細(xì)胞的增殖，并 且呈劑量和時(shí)間依賴性（圖9A)，鑒于12小時(shí)細(xì)胞增殖差異不大，流式細(xì)胞技術(shù)檢測24和 48小時(shí)CD4巧細(xì)胞的調(diào)亡，結(jié)果顯示kirneol促進(jìn)M0G刺激活化的CD4巧細(xì)胞的調(diào)亡（圖 9B、C)
[0024]第5步：體外實(shí)驗(yàn)，用抗原M0G刺激活化記憶性成熟T細(xì)胞（memo巧Tcell)，加 不同濃度奇壬醇，并且刺激培養(yǎng)24小時(shí)和36小時(shí)，發(fā)現(xiàn)奇壬醇誘導(dǎo)M0G特異性CD4+T細(xì)胞 (破壞中樞神經(jīng)系統(tǒng)的CD4+T細(xì)胞）調(diào)亡具有時(shí)間和劑量依賴性。取EAE小鼠淋己結(jié)，審U 成淋己細(xì)胞懸液，體外用M0G刺激培養(yǎng)36小時(shí)，并加入不同濃度的kirenol,流式細(xì)胞儀分 選出CD4巧淋己細(xì)胞，westernblot檢測調(diào)亡相關(guān)蛋白，結(jié)果現(xiàn)在kirenol增加cleaved caspase3和bax的表達(dá)，下調(diào)調(diào)亡抑制蛋白Bcl-2的表達(dá)（圖10A)，將M0G刺激培養(yǎng)的 淋己細(xì)胞用caspase3 抑制劑Ac-DEVD-CHO處理并用試劑盒檢測caspase3的活性，發(fā)現(xiàn) kirenol處理的淋己細(xì)胞內(nèi)caspase3活性增加，caspase3抑制劑Ac-DEVD-CHO可W括抗 kirenol的作用（圖10B)，流式細(xì)胞技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，caspase3抑制劑Ac-DEVD-CHO可W 括抗kirenol的促調(diào)亡作用（圖10C、D)，westernblot檢測發(fā)現(xiàn)kirenol增加細(xì)胞色素 C(cytoc虹omeC)的表達(dá)（圖10巧。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，kirenol通過線粒體途徑促進(jìn)M0G特 異性CD4巧淋己細(xì)胞的調(diào)亡。
[002引第6步：分子機(jī)制-M0G刺激CD4+T細(xì)胞并加不同濃度的奇壬醇，體外做wester、caspase活性檢測、流式等，發(fā)現(xiàn)奇壬醇通過線粒體途徑誘導(dǎo)M0G活化的CD4巧細(xì)胞調(diào)亡。
[0026] 上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的 限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化， 均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 奇壬醇在制備治療多發(fā)性硬化藥物的應(yīng)用。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的奇壬醇在制備治療多發(fā)性硬化藥物的應(yīng)用，其特征在于，所 述的奇壬醇在制備治療多發(fā)性硬化的口服藥物的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種奇壬醇在制備治療多發(fā)性硬化藥物的應(yīng)用，屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。所述的奇壬醇在制備治療多發(fā)性硬化的口服藥物的應(yīng)用。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)口服奇壬醇能夠誘導(dǎo)致敏性CD4+T細(xì)胞通過線粒體途徑發(fā)生凋亡，可以顯著延遲多發(fā)性硬化動(dòng)物模型-EAE的發(fā)病時(shí)間，并且顯著減輕EAE的臨床癥狀。以奇壬醇作為治療多發(fā)性硬化的口服藥物，成本低廉，分子機(jī)制明確，為治療多發(fā)性硬化提供了新的治療藥物。
【IPC分類】A61K31/047, A61P25/00
【公開號(hào)】CN105147648
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510029978
【發(fā)明人】肖娟, 劉文衛(wèi), 楊海波, 楊林, 秦鑫, 范曉航, 龔文容, 肖鵬
【申請(qǐng)人】湖北文理學(xué)院
【公開日】2015年12月16日
【申請(qǐng)日】2015年1月22日