用于抑制細(xì)胞粘附至rgd結(jié)合位點(diǎn)或引導(dǎo)診斷劑或治療劑至rgd結(jié)合位點(diǎn)的組合物和方法
【專利說明】用于抑制細(xì)胞粘附至RGD結(jié)合位點(diǎn)或引導(dǎo)診斷劑或治療劑 至RGD結(jié)合位點(diǎn)的組合物和方法
[0001] 本申請是國際申請日為2010年11月10日的國際申請PCT/US2010/056277進(jìn)入 中國、申請?zhí)枮?01080061074. 6的題為"用于抑制細(xì)胞粘附至R⑶結(jié)合位點(diǎn)或引導(dǎo)診斷劑 或治療劑至RGD結(jié)合位點(diǎn)的組合物和方法"的發(fā)明專利申請的分案申請。
[0002] 相關(guān)申請 根據(jù)35 U. S. C. 119 (e)，本申請要求2009年11月10日提交的題名為仏尊JosihoasAndMethodsForInhibitingCellularAdhesionToRGDBindingSites{說號物 規(guī) 胞粘附至R⑶結(jié)合位點(diǎn)的組合物和方法）的美國臨時專利申請順序號61/259, 748的優(yōu)先 權(quán)，其完整公開內(nèi)容通過引用明確結(jié)合到本文中。
技術(shù)領(lǐng)域
[0003] 本發(fā)明總的來說涉及化學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，更具體地講涉及可用于抑制細(xì)胞粘附至 Arg-Gly-Asp ( "RGD"三肽）結(jié)合位點(diǎn)的組合物和方法以及以下病癥的相關(guān)治療：例如炎 癥、傷口愈合、防止瘢痕形成、血栓形成、癌癥轉(zhuǎn)移和腫瘤、增殖性或非增殖性糖尿病視網(wǎng)膜 病、玻璃體液液化、誘導(dǎo)玻璃體視網(wǎng)膜后部脫離（PVD)、玻璃體視網(wǎng)膜疾病的發(fā)病機(jī)制，例 如飄浮物、特發(fā)性黃斑裂孔、玻璃體黃斑牽引、年齡相關(guān)性黃斑變性、濕性黃斑變性、脈絡(luò)膜 新生血管形成、玻璃體視網(wǎng)膜手術(shù)、靜脈閉塞、角膜新生血管形成、缺血性視神經(jīng)、虹膜發(fā)紅 (rubiosis iridis)和青光眼手術(shù)中防止瘢痕形成。
【背景技術(shù)】
[0004] R⑶三肽序列存在于許多蛋白質(zhì)中，其中其在細(xì)胞粘附中發(fā)揮作用。其中存在R⑶三肽 序列的蛋白質(zhì)的實(shí)例包括膠原、纖連蛋白、玻連蛋白、馮維勒布蘭德因子（VWF)、某些解聯(lián)蛋 白和某些網(wǎng)柄菌凝素。
[0005] 整聯(lián)蛋白是異二聚體細(xì)胞表面受體，其通過與具有暴露的RGD序列的配體結(jié)合而 介導(dǎo)細(xì)胞與胞外基質(zhì)（ECM)間的粘附。認(rèn)為正常的整聯(lián)蛋白-RGD結(jié)合在參與細(xì)胞生長、迀 移和存活的基因表達(dá)中起作用。這種細(xì)胞生長、迀移和存活的錯誤調(diào)節(jié)可導(dǎo)致許多疾病狀 態(tài)，包括血栓形成、炎癥和癌癥。因此，作為細(xì)胞粘附蛋白潛在模擬物研究了 RGD肽，并針對 其與整聯(lián)蛋白結(jié)合的能力、針對治療目的（例如抑制細(xì)胞凋亡、血管生成、腫瘤發(fā)生）、針對 以其多聚體形式作為內(nèi)部放射治療藥以及癌癥成像劑的用途及其攜帶抗癌藥物的能力進(jìn) 行了研究。
[0006] 在眼中，整聯(lián)蛋白影響包括眼發(fā)育、細(xì)胞迀移、愈合在內(nèi)的許多過程和一些病理過 程。整聯(lián)蛋白還可在眼組織中介導(dǎo)炎癥和血栓形成。另據(jù)報道，在動物模型中，玻璃體內(nèi)注 射RGD肽引起玻璃體視網(wǎng)膜后部脫離，因此，可用于治療某些視網(wǎng)膜病癥和/或在玻璃體切 除術(shù)中促進(jìn)玻璃體的摘除。[參見 Olivera，L. B.等， toFacilitateInductionofaPosteriorVitreousDetachment:aNewPrinciplein (有利于誘導(dǎo)玻璃體后部脫離的RGD肽輔助的玻璃體切除 術(shù)：藥理學(xué)玻璃體溶解的新原理）；CurrentEyeResearch(8): 333-40 (2002年12月25 日）]。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明提供包括R-G-磺基丙氨酸（即R-G-NH-CH(CH2-S03H)C00H或Arg-Gly_NH-CH(CH2-S03H)C00H)及其衍生物（包括藥學(xué)上可接受的鹽、水合物、立體異構(gòu) 體、多聚體、環(huán)狀形式、線性形式、藥物綴合物、前藥及其衍生物）的新的化合物。
[0008] 本發(fā)明還提供用于在人或動物受試者中抑制細(xì)胞粘附至RGD結(jié)合位點(diǎn)或?qū)⑵渌?診斷劑或治療劑遞送到RGD結(jié)合位點(diǎn)的組合物，和用于通過將有效量的包含R-G-磺基丙 氨酸肽或其衍生物（包括藥學(xué)上可接受的鹽、水合物、立體異構(gòu)體、多聚體、環(huán)狀形式、線性 形式、藥物綴合物、前藥及其衍生物）的組合物給予受試者，而在人或動物受試者中抑制細(xì) 胞粘附至RGD結(jié)合位點(diǎn)或?qū)⑵渌\斷劑或治療劑遞送到RGD結(jié)合位點(diǎn)的方法。本發(fā)明的 R-G-磺基丙氨酸肽的具體實(shí)例包括Arg-Gly-NH-CH(CH2-S03H)C00H的線性形式（在本文稱 為化合物1的實(shí)例）和Arg-Gly_NH-CH(CH2-S03H)C00H)的環(huán)狀形式（在本文稱為化合物2 的實(shí)例）。
[0009] 本發(fā)明的R-G-磺基丙氨酸衍生物的通式包括但不限于具有下列通式I-VII的化 合物： 通式I:
其中X選自：H、Ci-C6烷基、Ph或S03H，Y= 0H或NH2。
[0010] 通式II:
其中X選自：H、Ci-C6烷基、Ph或S03H。
[0011] 通式III:
其中X選自：H、Ci-C6烷基、Ph或S03H，其中Z選自：H或S03H。
[0012] 通式 IV:
其中X選自：H、Ci - C6烷基、Ph或S03H;Y選自0H或NH2。
[0013]通式 V:
其中X選自：H、Ci - C6烷基、Ph或S03H。
[0014]通式 VI:
其中X選自：H、Ci - C6烷基、Ph或S03H。
[0015]通式 VII: XfR-G-磺基丙氨酸-X 其中 X 和父丨選自：環(huán)狀或線性的-Phe-Val-Ala、-Phe-Leu-Ala、-Phe-Val-Gly、-Phe_L eu-Gly、-Phe-Pr〇-Gly、-Phe-Pr〇-Ala、-Phe_Val或以下氨基酸的D-異構(gòu)體或L-異構(gòu)體的 任何組合的任何鹽：Arg、Gly、磺基丙氨酸、Phe、Val、Ala、Leu、Pro、Thr。
[0016] 通式VII的環(huán)狀形式的實(shí)例包括但不必限于：
其中X'選自：H、Ci - C6烷基、Ph或S03H;Z選自H或Me;Y選自0H、NH2。
[0017] 磺酸是強(qiáng)于相應(yīng)羧酸的酸類?；撬峄鶊F(tuán)的這種較高極性導(dǎo)致較強(qiáng)的分子間結(jié)合。 例如，R-G-磺基丙氨酸（其具有更極化的0-H鍵）可與整聯(lián)蛋白結(jié)合位點(diǎn)中蛋白質(zhì)的酰胺 基團(tuán)形成比R-G-天冬氨酸（RGD肽）（其具有相對較不極化的0-H鍵）強(qiáng)的氫鍵和/或與 整聯(lián)蛋白結(jié)合位點(diǎn)中絡(luò)合的金屬離子具有較強(qiáng)的相互作用。
[0018] 如本文其它部分更詳細(xì)描述的一樣，合成了通式VII的一個具體實(shí)例甘氨酰 (Glycinyl)-精氨酰-甘氨酰-磺基丙氨酸-蘇氨酰-脯氨酸-C00H (GRG磺基丙氨酸TP ; 下文稱為化合物1)，并在動物中進(jìn)行了測試，發(fā)現(xiàn)其通過抑制整聯(lián)蛋白-胞外基質(zhì)（ECM)相 互作用，而有效地誘導(dǎo)視網(wǎng)膜表面上的玻璃體后部脫離（PVD)。另如本文其它部分更詳細(xì)描 述的一樣，使用人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC)，在傷口愈合模型中對化合物1進(jìn)行了試驗(yàn)，并 且表明其與環(huán)狀-R⑶肽抑制（40%)相比，在12小時內(nèi)抑制細(xì)胞粘附達(dá)74%。這些研究表明 和證實(shí)了甘氨酰-精氨酰-甘氨酰-磺基丙氨酸-蘇氨酰-脯氨酸-C00H甚至可比R⑶肽 本身更強(qiáng)地與整聯(lián)蛋白結(jié)合的基本原理。
[0019] 可呈L-形式或D-形式的R-G-磺基丙氨酸肽序列是整聯(lián)蛋白-ECM相互作用的競 爭性抑制劑。R-G-磺基丙氨酸肽序列可以是蛋白酶抗性衍生物或環(huán)狀衍生物或前藥衍生物 或與藥物遞送系統(tǒng)有關(guān)或?yàn)閱慰寺】贵w。
[0020] 本發(fā)明的組合物可用于抑制血管生成，其可用于治療炎癥、傷口愈合、血栓形成、 癌癥轉(zhuǎn)移和腫瘤。其它有益的應(yīng)用可存在于眼科學(xué)中，包括增殖性或非增殖性糖尿病視網(wǎng) 膜病、玻璃體液化、誘導(dǎo)玻璃體視網(wǎng)膜后部脫離（PVD)、玻璃體視網(wǎng)膜疾病的發(fā)病機(jī)制，例如 特發(fā)性黃斑裂孔、玻璃體黃斑牽引、年齡相關(guān)性黃斑變性、濕性黃斑變性、脈絡(luò)膜新生血管 形成、玻璃體視網(wǎng)膜手術(shù)、靜脈閉塞和青光眼手術(shù)中防止瘢痕形成。再者，本發(fā)明的多聚體 組合物和/或放射性標(biāo)記的組合物可用作檢測腫瘤的診斷/成像劑和治療腫瘤的放射治療 劑及因其腫瘤定向性質(zhì)而用作抗癌藥物載體。
[0021] 摻入R-G-磺基丙氨酸肽的生物材料還可為細(xì)胞長期存活和生長及為應(yīng)用于組織 工程學(xué)和再生醫(yī)學(xué)的活組織工程提供合成的粘性微環(huán)境。通過其結(jié)合整聯(lián)蛋白粘附受體的 性質(zhì)，R-G-磺基丙氨酸肽當(dāng)與生物材料或支架連接時，可提供促粘附信號。基于R-G-磺基 丙氨酸的材料介導(dǎo)細(xì)胞粘附、細(xì)胞擴(kuò)散和迀移。此外，整聯(lián)蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞粘附促進(jìn)細(xì)胞增 殖和存活，并在多細(xì)胞結(jié)構(gòu)和組織的裝配和組構(gòu)中起關(guān)鍵作用。
[0022] 用于治療黃斑變性的藥物像Lucentis和阿瓦斯丁以抑制VEGF為基礎(chǔ)，否則VEGF 引用新血管生長、血管生成，隨之造成黃斑水腫。已知小肽R⑶可通過競爭性結(jié)合，通過抑 制細(xì)胞與胞外基質(zhì) 1附著來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，如Brooks等人的美國專利號6, 500, 924中所示。
[0023] RGD妝結(jié)合基序或識別基序可存在于胞外基質(zhì)的蛋白質(zhì)中和通過識別RGD粘附 表位而連接細(xì)胞的胞內(nèi)細(xì)胞骨架與ECM的整聯(lián)蛋白中。參見例如F 〇〇s，R Y.，Invest. Opthalmol. Vis. Sci. (1972) 11，801-808。不與ECM附著的細(xì)胞通常進(jìn)行細(xì)胞凋亡。
[0024] -般而言，成纖維細(xì)胞和胞外基質(zhì)的糖蛋白組分間的相互作用引起主要通過在細(xì) 胞表面整聯(lián)蛋白上相互作用的含R⑶氨基酸序列介導(dǎo)的嚴(yán)重瘢痕形成。還已知R⑶序列在 炎癥反應(yīng)和穩(wěn)態(tài)反應(yīng)期間參與細(xì)胞-ECM相互作用（參見Hershkoviz，S. M.等，Invest. Ophthalmol. Vis. Sci.，（1994)，35, 2585-2591)，且整聯(lián)蛋白在傷口愈合或病理過程中的 細(xì)胞迀移中以及在調(diào)節(jié)炎癥和血栓形成中起重要作用。因此，有效的整聯(lián)蛋白拮抗劑，像 R⑶肽，作為藥理劑如抗炎劑、抗轉(zhuǎn)移劑或抗血栓劑可以是非常有用的（參見Elner，S. G.和 ElnenV.M.，/^^? (1996) 37:696-701。文獻(xiàn)中還報道了透明質(zhì)酸的CD44受體通過其對透 明質(zhì)酸的親和力，以及可能還通過其對其它配體（例如骨橋蛋白、膠原和基質(zhì)金屬蛋白酶 (MMP))的親和力，介導(dǎo)細(xì)胞-細(xì)胞和細(xì)胞-基質(zhì)相互作用。
[0025] 與乙酰透明質(zhì)酸的粘附在細(xì)胞迀移、腫瘤生長和進(jìn)展中起重要作用，還參與淋巴 細(xì)胞活化、再循環(huán)和歸巢以及血細(xì)胞生成。表達(dá)改變或功能障礙引起多種致病表型（參見 例如Jiang D.，Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. (2007) 23:435-461;以及Knudson，W?等， Matrix Bio. (2002)，21 :15-23)。
[0026] 最近，研究表明CD44和細(xì)胞基質(zhì)組分（例如HA)的相互作用在各種炎性疾病的發(fā) 生中起重要作用，乙酰透明質(zhì)酸-CD44相互作用的中斷可導(dǎo)致脈絡(luò)膜新生血管形成的改善 (參見Hiroshi Mochimaru等，Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. (2009) 50:4410-4415)。
[0027] 這些證據(jù)表明，細(xì)胞-細(xì)胞和細(xì)胞-ECM相互作用中的粘附分子像R⑶肽或⑶44 在各種病原性疾病的發(fā)生中起重要作用，相互作用的抑制中可以是治療和治愈疾病方面的 新的治療靶標(biāo)。
[0028] 合成肽還顯示與整聯(lián)蛋白和生長因子結(jié)合。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，含環(huán)化五肽的R⑶序列抑 制玻連蛋白與a v03整聯(lián)蛋白（integin)的結(jié)合（參見Michael A. Dechantsreiter等， J. Med. Chem. (1999) 42:3033-3040)和玻連蛋白和纖連蛋白兩者與av03和a IIb03整 聯(lián)蛋白的結(jié)合（參見 Roland Haubner 等，J. Am. Chem. Soc.，（1996) 118:7461-7472)。 已經(jīng)表明這種抑制可用于治療多種無關(guān)聯(lián)的疾病。在倉鼠研究中，與對照動物相比，環(huán)狀 五肽延遲腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移（參見M. A. Buerkle等，British J. Cancer (2002) 86: 788-795)。五肽還顯示降低鐮刀形紅細(xì)胞與血管內(nèi)皮的結(jié)合并改進(jìn)血液動力學(xué)行為（參 見 Eileen M. Finnegan 等，Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol.，（2007) 293: H1038-H1045)。另一種含RGD序列的環(huán)狀肽表明與a 40 1的強(qiáng)烈結(jié)合，a 40 1是已知在 炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答中的白細(xì)胞結(jié)合中起作用的整聯(lián)蛋白（參見Pina M. Cardarelli等， J. Biol. Chem. (1994) 269:18668-18673)。研究表明一種合成的硫酸化四肽與VEGF強(qiáng) 烈結(jié)合（參見 Maynard，J.A. Hubbell, Acta Biomaterialia (2005) 1:451-459)。
[0029] 此外，在一個重要和有用的應(yīng)用中，二聚R⑶肽-藥物綴合物顯示可用于腫瘤靶向 的靶向整聯(lián)蛋白的藥物遞送（參見Chen等，J. Med. Chem.，（2005) 48(4) :1098-1106)。
[0030] 在另一個同樣重要和有用的應(yīng)用中，已顯示多聚體放射性標(biāo)記的R⑶肽可通過靶 向整聯(lián)蛋白a 3而用作腫瘤檢測的診斷/成像劑，和用作腫瘤特異性靶向和治療的放射 治療劑（參見 Zi-Bo Li 等，J. Nucl. Medicine, (2007) 48:1162 - 1171)。
[0031] 在眼科學(xué)中，在傷口愈合中（特別是在青光眼中）通過成纖維細(xì)胞形成瘢痕是主 要問題之一。這起因于成纖維細(xì)胞和ECM的糖蛋白組分之間的相互作用。ECM糖蛋白的識 別通過對粘附表位（例如Arg-Gly-Asp (或RGD)序列）特異的細(xì)胞表面整聯(lián)蛋白而發(fā)生。 存在于血漿蛋白質(zhì)（包括纖連蛋白（FN)和玻連蛋白（VN))的若干基質(zhì)中的RGD序列，參與 在炎癥反應(yīng)和穩(wěn)態(tài)反應(yīng)期間發(fā)生的細(xì)胞-ECM相互作用。抑制成纖維細(xì)胞與ECM的糖蛋白 之間的相互作用緩解瘢痕形成（參見Rami Hershkoviz等，1]1￥6