USA)溶解在與唾液具有類似成分 的緩沖液（模擬唾液緩沖液，包括SSB、0. 021M的Na2HP04/NaH2P04、pH7. 0、36mM的NaCl和 0. 96mM的CaCl2)或RPMI 1640培養(yǎng)基中，形成三種不同的濃度（0. 5、1. 0和2. Omg/ml)。
[0037] 制備實施例2 :溶菌酶和過氧化物酶
[0038] 將分別用作本發(fā)明的溶菌酶和過氧化物酶的雞蛋清溶菌酶（HEWL)和牛乳過氧化 物酶（bLPO) (Sigma-Aldrich，St Louis, M0, USA)溶解于 SSB 中。使用濃度為 30. 0 y g/ml 的HEWL或濃度為25. 0 y g/ml的bLPO進行分析。
[0039] 實施例1 :HA的真菌生長抑制活性
[0040]在本實驗中使用 了白色念珠菌（Candida albicans) ATCC10231、18804 和 11006。 在沙氏葡萄糖培養(yǎng)基（Sabouraud dextrose medium)內(nèi)接種每種白色念珠菌各一個菌落， 在沙氏葡萄糖瓊脂（SDA)中以37°C攪拌培養(yǎng)18小時。采集，清洗細胞，然后以濃度為lxlO 5 個細胞/ml重懸浮在RPMI 1640培養(yǎng)基中。為檢測HA的真菌生長抑制活性，將HA以不同 濃度（0. 5, 1. 0和2. 0mg/ml)溶解在100ml含有白色念珠菌的RPMI 1640培養(yǎng)基中，然后在 37°C下攪拌培養(yǎng)。在600nm下每隔1小時測量培養(yǎng)基的光密度而確定增殖期，然后將所述 培養(yǎng)基的光密度與無HA培養(yǎng)基的光密度作比較。此實驗重復做4次。
[0041] HA表現(xiàn)出對白色念珠菌生長的抑制作用，而且該抑制作用與此實驗中所用的HA 的濃度成比例。所述HA對白色念珠菌ATCC11006細胞株的抑制作用最強，而對白色念珠菌 ATCC18804細胞株的抑制作用最弱（見圖1、2和3)。
[0042] 實施例2 :HA的念珠菌殺傷活性
[0043] 在10ml的RPMI 1640培養(yǎng)基中接種白色念珠菌ATCC1023U18804以及11006的菌 落各一個，然后在37°C下邊攪拌培養(yǎng)18小時。采集，清洗細胞，然后在SSB中使之再懸浮， 其濃度為1x10 s個細胞/ml。為檢測HA的念珠菌殺傷活性，將20 y 1細胞懸浮液以加入到 40 y 1不同濃度的HA中（最終濃度：0. 5、1. 0和2. Omg/ml)。在37°C下將樣本培養(yǎng)1. 5小 時，然后每隔15分鐘進行混合。將最終培養(yǎng)樣本稀釋10倍，而后在SDA板上接種50 y 1 (167 個細胞）稀釋培養(yǎng)樣本，一式三份，然后在37°C下培養(yǎng)過夜。通過比較實驗板與無HA對照 板上的菌落數(shù)量，而檢測出念珠菌殺傷活性。此外，計算細胞存活率的損失（1-實驗板上的 菌落數(shù)/對照板上的菌落數(shù)X 100)。此實驗重復做6次。
[0044] HA(最終濃度：0.5、1.0和2. Omg/ml)表現(xiàn)出無可測的念珠菌殺傷活性，而且表現(xiàn) 出所述實驗板的所有細胞株與對照組（無HA)相比在菌落數(shù)量上無明顯差異。
[0045] 實施例3 :HA對溶菌酶和過氧化物酶的念珠菌殺傷活性的作用（HA與念珠菌細胞 一起培養(yǎng)，然后用抗菌酶進行處理）
[0046] 將上述培養(yǎng)的白念珠菌的細胞懸浮液用于SSB中，其濃度為lxlO 5個細胞/ml，然 后在等量HA中加入20 y 1所述細胞懸浮液（最終濃度：0? 5、1. 0和2. Omg/ml)。在37°C 下，將樣本邊攪拌培養(yǎng)1小時。40 y 1的所述細胞懸浮液與20 y 1的HEWL混合（最終濃 度：30 y g/ml)，或與20 y 1過氧化物酶混合（最終濃度：25 y g/ml的bLPO, ImM的KSCN和 100 y M的H202)，然后在37°C下邊攪拌培養(yǎng)1小時。在培養(yǎng)結(jié)束時，將樣本稀釋10倍，而后 在SDA板上接種50 y 1 (167個細胞）稀釋培養(yǎng)樣本，一式三份，然后在37°C下培養(yǎng)過夜。計 算念珠菌殺傷活性及細胞存活率減少量。此實驗重復做8次。
[0047] HA表現(xiàn)出對溶菌酶和過氧化物酶系統(tǒng)中的念珠菌殺傷活性的抑制作用，而且所述 抑制作用與HA的濃度成正比。根據(jù)所述白色念珠菌細胞株，其抑制程度也不同，但HA在 1. 0~2. 0mg/ml時，可完全抑制本實驗中所用的溶菌酶和過氧化物酶系統(tǒng)中的念珠菌殺傷 活性（參見表1和表2)。
[0048] 【表1】
[0049]
[0050] HA對溶菌酶的白色念珠菌殺傷活性的影響（HA與念珠菌細胞一起培養(yǎng)，然后用溶 菌酶處理）
[0051] HEWL:雞蛋清溶菌酶；以及CFU :菌落形成單位
[0052] 【表2】
[0053]
[0054] HA對過氧化物酶的白色念珠菌殺傷活性的作用（HA與念珠菌細胞一起培養(yǎng)，然后 用過氧化物酶處理）
[0055] HEWL:牛乳過氧化物酶；以及CFU :菌落形成單位
[0056] 實施例4 :HA對溶菌酶和過氧化物酶的念珠菌殺傷活性的作用（HA與抗菌酶一起 培養(yǎng)，然后用念珠菌細胞進行處理）
[0057] 將20 y 1的HA溶液（最終濃度：0? 5、1. 0和2. Omg/ml)加入到20 y 1 HEWL (最終 濃度：30 y g/ml)或20 y 1過氧化物酶（最終濃度：25 y g/ml的bLPO, ImM的KSCN和100 y M 的H202)中，然后在37°C下邊攪拌培養(yǎng)1小時。將所得混合液加入到20 y 1細胞懸浮液中， 然后在37°C下邊攪拌培養(yǎng)1小時。在培養(yǎng)結(jié)束時，將樣本稀釋10倍，而后在SDA板上接種 50iil(167個細胞）稀釋培養(yǎng)樣本，一式三份，然后在37°C下培養(yǎng)過夜。計算念珠菌殺傷活 性和細胞存活率的損失。此實驗重復做8次。
[0058] HA首先與抗菌酶一起培養(yǎng)時，所述HA也能展現(xiàn)出對溶菌酶和過氧化物酶系統(tǒng)中 的念珠菌殺傷活性的抑制作用。HA在1. 0~2. Omg/ml時，此實驗中所用的溶菌酶和過氧化 物酶系統(tǒng)中的念珠菌殺傷活性將失活（見表3和4)。
[0059] 【表3】
[0060]
[0061] HA對溶菌酶的念珠菌殺傷活性的作用（HA與溶菌酶一起培養(yǎng)，然后用念珠菌細胞 處理）HEWL:雞蛋清溶菌酶；以及CFU :菌落形成單位
[0062]【表4】
[0063]
[0064] HA對過氧化物酶的念珠菌殺傷活性的作用（將HA與過氧化物酶一起培養(yǎng)，然后用 念珠菌細胞處理）
[0065] bLPO :牛乳過氧化物酶；以及CFU:菌落形成單位
[0066] 0. 5mg/ml HA可抑制79. 8±7. 7%的溶菌酶的念珠菌殺傷活性以及58. 8±4. 7% 的過氧化物酶的念珠菌殺傷活性。因此，可分別加入溶菌酶使?jié)舛却蠹s成為5 4. 0 yg/ ml (50~60 y g/ml)以及過氧化物酶使?jié)舛却蠹s成為39. 7 y g/ml (36~43 y g/ml)，以提供 抗真菌活性。
[0067] 雖然參考特定的示例性實施例展示并描述了本發(fā)明，但本領(lǐng)域的技術(shù)人員應理解 的是，其形式及細節(jié)在不超出所附的權(quán)利要求書的本發(fā)明范圍內(nèi)可進行各種變更。
【主權(quán)項】
1. 含有0. 5mg/ml透明質(zhì)酸（HA)的人工唾液，其中所述人工唾液包含30 y g/ml的溶菌 酶或25 y g/ml的過氧化物酶。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的人工唾液，其特征在于，所述透明質(zhì)酸是透明質(zhì)酸本身，透明 質(zhì)酸鹽，或透明質(zhì)酸與透明質(zhì)酸鹽的混合物，且所述透明制酸鹽是如透明質(zhì)酸鈉、透明質(zhì)酸 鉀、透明質(zhì)酸鈣、透明質(zhì)酸鎂、透明質(zhì)酸鋅和透明質(zhì)酸鈷的無機鹽，或所述透明制酸鹽是如 四丁基透明質(zhì)酸銨的有機鹽。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的人工唾液，其特征在于，所述透明質(zhì)酸的分子量為IOOkDa~ 1000 OkDa04. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的人工唾液，其特征在于，所述人工唾液用于治療口腔干燥或 口腔念珠菌病。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的人工唾液，其特征在于，所述人工唾液可用于預防或治療因 唾液分泌減少所引起的并發(fā)癥。
【專利摘要】本發(fā)明提供含有透明質(zhì)酸(HA)的人工唾液。由于該人工唾液在人唾液的生理范圍內(nèi)并表現(xiàn)出足夠的抗菌活性，該人工唾液可用于治療口腔干燥或口腔念珠菌病，而且可有效地用于預防或治療唾液分泌減少所引起的并發(fā)癥。
【IPC分類】A61P1/02, A61K38/54, A61K35/38, A61P31/10, A61K31/728
【公開號】CN105056219
【申請?zhí)枴緾N201510478283
【發(fā)明人】高弘燮, 樸文秀
【申請人】首爾大學校產(chǎn)學協(xié)力團
【公開日】2015年11月18日
【申請日】2011年4月1日
【公告號】CN103491967A, EP2661272A1, EP2661272A4, US8506937, US20120321605, WO2012093753A1