一種提高胰島素口服結(jié)腸吸收的殼聚糖納米粒及制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明所涉及可用于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域的納米粒及其制備方法，特別涉及一種提 高胰島素口服結(jié)腸吸收的殼聚糖納米粒及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 胰島素在臨床上被廣泛的用于治療I型糖尿病，目前其主要給藥方式為皮下注 射。糖尿病患者為了控制自己的血糖水平需要每天多次的注射胰島素（Ins)，給患者的身心 帶來了極大的痛苦和日常生活的諸多不便?？诜o藥系統(tǒng)被認(rèn)為是患者順應(yīng)性最好、最自 然、最安全的一種給藥方式，但胰島素口服生物利用度非常低，基本沒有藥理效應(yīng)。其主要 原因：一是胰島素在消化道中容易被酸及酶降解失活；二是胰島素的分子量較大，跨越消 化道粘膜上皮細(xì)胞的能力差，無法被有效的吸收。
[0003] 為了解決胰島素口服生物利用度低的問題，研究者們提出了許多方案，如：對(duì)胰島 素分子進(jìn)行修飾，加入吸收促進(jìn)劑，在處方中加入酶抑制劑，發(fā)展新的藥物傳遞系統(tǒng)來包裹 胰島素，像微球、脂質(zhì)體、納米粒給藥系統(tǒng)。
[0004] 細(xì)胞穿透肽是一類能夠通過生物膜進(jìn)入細(xì)胞的短肽，它們?cè)谳^低的溶度條件下， 就可以在不對(duì)細(xì)胞膜造成明顯損傷的條件下透過細(xì)胞膜進(jìn)入到各種細(xì)胞中；它們還能夠高 效促進(jìn)各種物質(zhì)包括蛋白質(zhì)，納米粒進(jìn)入細(xì)胞。有文獻(xiàn)報(bào)道一種提高胰島素生物利用度的 策略（Journal Controlled Release, 2007，118: 177-184)，是將膜島素與一種細(xì)胞穿透 肽(寡聚精氨酸)混合后注射到大鼠的回腸部位。然而由于胰島素和細(xì)胞穿透肽口服后在胃 腸道中不穩(wěn)定，易被胃酸、胃蛋白酶和胰蛋白酶降解，這種沒有經(jīng)過任何處理的胰島素與細(xì) 胞穿透肽的混合液只有通過直接注射到小腸段的手段才能起作用，通過口服給藥無法有效 提高胰島素的生物利用度。
[0005]與消化道的其他部位相比較，結(jié)腸擁有有利于胰島素吸收的生理?xiàng)l件，如蛋白酶 的密度及活性相對(duì)較低、相對(duì)較溫和的pH條件、粘液的更新速度較慢，內(nèi)容物的滯留時(shí)間 較長，這些條件使結(jié)腸成為蛋白質(zhì)藥物吸收較為理想的部位。
[0006] 文獻(xiàn)（]〇111'的1〇1!'八卩卩116(1?〇15〇11613(^611〇6，1997，63(1):125-132. International Journal of Pharmaceutics, 2002，249(1-2): 139-147)報(bào)道用離子交聯(lián) 法制備了包裹著胰島素的殼聚糖納米粒，此方法制備的納米粒在胃酸環(huán)境下不穩(wěn)定，不能 夠保護(hù)其所包裹的物質(zhì)。文獻(xiàn)(沈陽藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，23(2): 65-69)報(bào)道用羥丙基 甲基纖維素酞酸酯（HP55)對(duì)用離子交聯(lián)法制備的裝載著Ins的殼聚糖納米粒進(jìn)行腸溶包 衣以提高胰島素的口服結(jié)腸吸收，但胰島素的口服生物利用度有待提高。
[0007] 本發(fā)明采用殼聚糖納米粒包裹胰島素及細(xì)胞穿透肽Tat，再對(duì)制備好的納米粒用 尤特奇S100進(jìn)行包衣。一方面解決了殼聚糖納米粒同時(shí)包裹胰島素和細(xì)胞穿透肽兩種物 質(zhì)的技術(shù)難題，從而實(shí)現(xiàn)用細(xì)胞穿透肽Tat增加胰島素的跨腸道細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)，提高胰島素的 口服吸收生物利用度。另一方面，解決了胰島素和細(xì)胞穿透肽Tat 口服后在胃腸道中的穩(wěn) 定性問題，使得細(xì)胞穿透肽Tat能夠發(fā)揮提高藥物跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)吸收的活性，使胰島素能夠順 利到達(dá)人體最佳吸收部位，起到良好的治療效果。本發(fā)明比現(xiàn)有技術(shù)方法制備出的殼聚糖 納米粒具有更好的穩(wěn)定性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的一個(gè)目的是使用簡單方便可控的制備方法--離子交聯(lián)法來制備一種 包裹胰島素與細(xì)胞穿透肽Tat的殼聚糖納米粒，并且通過腸溶材料尤特奇S100對(duì)該納米粒 進(jìn)行包衣，獲得一種提高胰島素口服結(jié)腸吸收的納米載體。用尤特奇S100包衣的殼聚糖納 米粒在胃及小腸低pH值的環(huán)境下不會(huì)有明顯的內(nèi)容物釋放，當(dāng)尤特奇S100包衣的殼聚糖 納米粒運(yùn)動(dòng)到小腸底部pH值較高環(huán)境中時(shí)尤特奇S100開始溶解，包裹在尤特奇S100里面 的殼聚糖納米粒暴露在腸腔中。殼聚糖納米粒在腸腔中緩慢釋放所包裹的細(xì)胞穿透肽Tat 及胰島素。當(dāng)殼聚糖納米粒進(jìn)入結(jié)腸時(shí)，發(fā)生去質(zhì)子化，殼聚糖納米粒被破壞，胰島素和Tat 被完全釋放到結(jié)腸中，Tat促進(jìn)結(jié)腸上皮細(xì)胞對(duì)胰島素的吸收。因而提高了胰島素的口服 生物利用度。
[0009] 本發(fā)明在制備包裹胰島素和細(xì)胞穿透肽Tat的殼聚糖納米粒時(shí)，采用殼聚糖與胰 島素先混合的辦法，這可使胰島素與殼聚糖的分子間相互作用增加，從而提高胰島素的包 封率，包封率高達(dá)80%。本發(fā)明采用殼聚糖與三聚磷酸鈉離子交聯(lián)的方法制備殼聚糖納米 粒，納米粒的整個(gè)制備過程不加入任何有機(jī)溶劑，制備條件溫和簡便。與現(xiàn)有的殼聚糖納米 粒的制備方法相比，本發(fā)明操作簡便，可以較好保護(hù)胰島素及肽Tat的活性。
[0010] 本發(fā)明所使用的肽Tat是常用的細(xì)胞穿透肽中的一種。當(dāng)包裹胰島素和肽Tat 口 服到達(dá)結(jié)腸后，殼聚糖納米粒在該環(huán)境中不穩(wěn)定，納米粒被破壞，胰島素及肽Tat釋放進(jìn)入 結(jié)腸腸腔，肽Tat促進(jìn)結(jié)腸上皮細(xì)胞對(duì)胰島素的吸收，從而起到增加胰島素口服的生物利 用度。
[0011] 本發(fā)明的殼聚糖納米粒制備方法比現(xiàn)有技術(shù)方法制備出的殼聚糖納米粒具有更 好的物理化學(xué)穩(wěn)定性。所用的腸溶材料尤特奇S100為甲基丙烯酸和甲基丙烯酸甲酯（1:2) 共聚物，具有成膜性好，溶于乙醇、丙酮，在pH小于6. 8的水溶液中不溶，可以保護(hù)其包裹的 納米粒，在消化道下段當(dāng)pH大于6. 8的環(huán)境中開始溶解并對(duì)其包衣的納米粒失去保護(hù)作 用。通過上述方法把無水乙醇揮發(fā)完全后，尤特奇S100析出并沉降在殼聚糖納米粒的表面 形成腸溶包衣膜，使得用本發(fā)明制備的殼聚糖納米粒在消化道上部不會(huì)被破壞具有良好的 穩(wěn)定性，從而使結(jié)腸成為本發(fā)明藥物的主要釋放及吸收部位。
[0012] 本發(fā)明所述的一種提高胰島素口服結(jié)腸吸收的殼聚糖納米粒，其組成成分為 殼聚糖、尤特奇S100、細(xì)胞穿透肽Tat和胰島素，其中細(xì)胞穿透肽Tat的氨基酸序列為 GRKKRRQRRRP，細(xì)胞穿透肽Tat與殼聚糖的質(zhì)量比為1. 0: (3. 5~4. 5)，細(xì)胞穿透肽Tat與殼 聚糖的質(zhì)量比為1. 〇: (3. 5~4. 0)，胰島素與殼聚糖的質(zhì)量比為1. 0: (1. 5~2. 5)。該納米粒的 制備步驟如下： (a) 將殼聚糖粉末溶解于醋酸溶液中，制備成殼聚糖溶液，用lmol/L的氫氧化鈉溶液 調(diào)節(jié)pH值至5. 5~6. 0后，加入細(xì)胞穿透肽Tat使溶解； (b) 在室溫?cái)嚢璧臈l件下，將胰島素溶液緩慢加到（a)中的殼聚糖與細(xì)胞穿透肽Tat 的混合液中，繼續(xù)攪拌1小時(shí)； (c) 在室溫?cái)嚢璧臈l件下，將三聚磷酸鈉水溶液緩慢加到（b)所得的溶液中，繼續(xù)攪 拌0. 5小時(shí)，形成納米粒懸浮液； (d)在室溫?cái)嚢璧臈l件下，將尤特奇S100的無水乙醇溶液緩慢加到（c)所得的納米粒 懸浮液中，繼續(xù)攪拌12小時(shí)，即得一種提高胰島素口服結(jié)腸吸收的殼聚糖納米粒。
[0013] 本發(fā)明所述的一種提高胰島素口服結(jié)腸吸收的殼聚糖納米粒優(yōu)選的制備過程如 下： (1)稱取分子量5-10萬道爾頓、脫乙酰度大于85%的殼聚糖粉末7-9mg，溶于0. 2%的 醋酸溶液中，用lmol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至5. 5~6. 0,將殼聚糖溶液置于恒溫磁 力攪拌器上室溫勻速攪拌；稱取肽Tat粉末1. 75-2. 57mg (使Tat與殼聚糖的質(zhì)量比為 1: (3. 5~4. 0))，置于殼聚糖溶液中溶解。
[0014] (2)稱取胰島素粉末2. 8-6mg (使胰島素與殼聚糖的質(zhì)量比為1: (1. 5~2. 5))，溶于 0? Olmol/L的鹽酸溶液2ml中，用lmol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至7. 5~8. 5,在室溫?cái)?拌的條件下，將胰島素溶液加到（1)所得的殼聚糖溶液中攪拌混合1小時(shí)。
[0015] (3)稱取三聚磷酸鈉粉末1. 56-2. 57mg (使三聚磷酸鈉與殼聚糖的質(zhì)量比為 1: (3. 5~4. 5))，溶于水形成lmg/mL的三聚磷酸鈉的溶液，在室溫?cái)嚢璧臈l件下，將三聚磷 酸鈉溶液加到（2)所得的溶液中攪拌混合0. 5小時(shí)，使其形成納米粒懸浮液。
[0016] (4)稱取包衣材料尤特奇S100粉末2mg溶于無水乙醇溶液，形成濃度為2mg/mL的 尤特奇S100無水乙醇溶液，在室溫?cái)嚢璧臈l件下，將尤特奇S100無水乙醇溶液加到（3)所 得的納米粒懸浮液中