評(píng)估實(shí)驗(yàn)是通過(guò)比較Caco-2細(xì)胞 對(duì)尤特奇S100包衣的包裹FITC-Ins及Tat的殼聚糖納米粒和尤特奇S100包衣的包裹 FITC-Ins的殼聚糖納米粒中FITC-Ins的轉(zhuǎn)運(yùn)及攝取的效率來(lái)實(shí)現(xiàn)的。尤特奇S100包衣的 包裹FITC-Ins及Tat的殼聚糖納米粒（ES-Tat-cNPs)與尤特奇S100包衣的包裹FITC-Ins 的殼聚糖納米粒（ES-cNPs)的制備方法如下： 尤特奇S100的包裹FITC-Ins及Tat的殼聚糖納米粒：稱取分子量為10萬(wàn)道爾頓脫乙 酰度為95%的殼聚糖粉末8mg，溶于4ml的0. 2%的醋酸溶液中，用lmol/L的氫氧化鈉溶液 調(diào)節(jié)pH值至6. 0,稱為溶液A。稱取2mg的Tat (氨基酸序列GRKKRRQRRRP)，溶于溶液A中 并稱為溶液B，在室溫下將溶液B置于磁力攪拌器上攪拌。稱取4mg的FITC-Ins，溶于2mL 的0? lmol/L的鹽酸溶液，用lmol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至8. 0,稱為溶液Q。在室溫 攪拌的條件下將溶液(^緩慢加入到溶液B中，繼續(xù)攪拌1小時(shí)形成溶液D1。稱取2mg的三 聚磷酸鈉溶于2mL的蒸餾水中并稱為溶液E，在室溫?cái)嚢璧臈l件下將溶液E緩慢加入到溶液 口:中，繼續(xù)攪拌0. 5小時(shí)形成納米粒混懸液F i。稱取2mg的尤特奇S100溶于lmL的無(wú)水乙 醇溶液中稱為溶液I。在室溫?cái)嚢璧臈l件下將溶液I緩慢加入到混懸液匕中，繼續(xù)攪拌12 小時(shí)，即形成尤特奇S100包衣的包裹FITC-Ins及Tat的殼聚糖納米粒。因用到FITC-Ins， 整個(gè)制備過(guò)程最好在避光條件下進(jìn)行。
[0032] 尤特奇S100包衣的包裹FITC-Ins的殼聚糖納米粒：稱取分子量為10萬(wàn)道爾頓 脫乙酰度為95%的殼聚糖粉末8mg，溶于4ml的0. 2%的醋酸溶液中，用lmol/L的氫氧化鈉 溶液調(diào)節(jié)pH值至6. 0,稱為溶液A。在室溫條件下將溶液A置于磁力攪拌器上攪拌。稱取 4mg的FITC-Ins，溶于2mL的0? lmol/L的鹽酸溶液，用lmol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值 至8. 0,稱為溶液Q。在室溫?cái)嚢璧臈l件下將溶液(^緩慢加入到溶液A中，繼續(xù)攪拌1小時(shí) 形成溶液A。稱取2mg的三聚磷酸鈉溶于2mL的蒸餾水中并稱為溶液E，在室溫?cái)嚢璧臈l 件下將溶液E緩慢加入到溶液6 :中，繼續(xù)攪拌0. 5小時(shí)形成納米?；鞈乙篐 i。稱取2mg尤 特奇S100溶于lmL的無(wú)水乙醇溶液中稱為溶液I。在室溫?cái)嚢璧臈l件下將溶液I緩慢加入 到混懸液氏中，繼續(xù)攪拌12小時(shí)，即形成尤特奇S100包衣的包裹FITC-Ins的殼聚糖納米 粒。整個(gè)制備過(guò)程在避光的條件下進(jìn)行。
[0033] 細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)：將ES-Tat-cNPs和ES-cNPs混懸液在4°C的條件35000rpm超速離 心35min，離心后的沉淀用蒸餾水洗滌3次。隨后，沉淀用漢克平衡鹽溶液（HBSS)分散后用 0. 22微米的微孔濾膜過(guò)濾備用。培養(yǎng)好的Caco-2細(xì)胞用1. 5mL的HBSS在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵 育半小時(shí)，然后棄去HBSS，細(xì)胞培養(yǎng)板的上室部分別加入0. 5ml的處理好了的兩種納米粒 溶液，下室加入1. 5ml的HBSS，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中37°C孵育。在設(shè)定的時(shí)間點(diǎn)把細(xì)胞培養(yǎng) 板從細(xì)胞培養(yǎng)箱取出并從下室取〇. lml的樣品溶液裝入到棕色容量瓶中，同時(shí)補(bǔ)充等量的 新鮮HBSS溶液到下室，并把細(xì)胞培養(yǎng)板放回細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育。然后在避光條件往棕色容 量瓶加丙酮稀釋，用熒光分光光度計(jì)測(cè)量熒光強(qiáng)度計(jì)算Caco-2細(xì)胞對(duì)FITC-Ins的轉(zhuǎn)運(yùn)效 率。激發(fā)波長(zhǎng)為490nm，發(fā)射波長(zhǎng)為516nm。結(jié)果見(jiàn)表3及附圖6所示。
[0034] 細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)：將ES-Tat-cNPs和ES-cNPs分別根據(jù)實(shí)施例2中所述方法進(jìn)行超 速離心。離心后的沉淀用蒸餾水洗滌3次。隨后，沉淀用HBSS分散后用0. 22微米的微孔 濾膜過(guò)濾備用。培養(yǎng)好的Caco-2細(xì)胞用1. 5mL的HBSS在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育半小時(shí)，然后 棄去HBSS，加入1. 5mL的處理好了的兩種納米粒溶液，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中37°C孵育。在預(yù) 設(shè)的時(shí)間點(diǎn)，將細(xì)胞培養(yǎng)板取出，用4°C的HBSS洗滌細(xì)胞3次，加入100 y L 4°C RIPA細(xì)胞 裂解液冰浴孵育20min使細(xì)胞裂解。待細(xì)胞裂解完全后加入0.25% trypsin-0.02% EDTA， lOOOrpm離心5min。取上清液。取上清液用丙酮稀釋，然后在避光條件下用熒光分光光度 計(jì)測(cè)定熒光強(qiáng)度計(jì)算Caco-2細(xì)胞對(duì)FITC-Ins的攝取效率。結(jié)果見(jiàn)表3及附圖6、7所示。
[0035] 表3納米粒在Caco-2細(xì)胞中的轉(zhuǎn)運(yùn)及攝取效率（％ )
從附圖6中可知：Cac〇-2細(xì)胞對(duì)ES-Tat-cNPs中FITC-Ins的轉(zhuǎn)運(yùn)效率是Caco-2細(xì)胞 對(duì)ES-cNPs中FITC-Ins的轉(zhuǎn)運(yùn)效率的4倍左右。這證明本發(fā)明所制備的ES-Tat-cNPs有 一個(gè)良好的促進(jìn)細(xì)胞對(duì)FITC-Ins的轉(zhuǎn)運(yùn)的左右。
[0036] 從附圖7中可知：經(jīng)過(guò)ES-Tat-cNPs處理的Caco-2細(xì)胞的攝取效率是ES-cNPs處 理的Caco-2細(xì)胞3倍。這證明本發(fā)明所制備的ES-Tat-cNPs具有增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)FITC-Ins攝 取的左右。
[0037](四）降血糖研究 本發(fā)明在體內(nèi)的評(píng)估是通過(guò)比較ES-Tat-cNPs和ES-cNPs分別在糖尿病大鼠及健康的 巴馬小香豬上的降血糖效果及巴馬小香豬的血漿胰島素含量來(lái)實(shí)現(xiàn)的。
[0038]將ES-Tat-cNPs (20IU/kg)、ES_cNPs (20IU/kg)、胰島素溶液（20IU/kg)和生理鹽 水結(jié)腸部位注射施用給糖尿病大鼠。將純的胰島素溶液（liu/kg)皮下注射（SC)到糖尿病 大鼠體內(nèi)作為陽(yáng)性對(duì)照。在設(shè)定的時(shí)間點(diǎn)，從被處理的大鼠尾部靜脈收集血液樣品。并且 用羅氏血糖儀測(cè)定血糖含量。通過(guò)血液樣品中的葡萄糖含量與初始值的百分比來(lái)繪制降糖 效率曲線。結(jié)果見(jiàn)表4及附圖8所示。
[0039] 表4大鼠實(shí)驗(yàn)中各種降血糖效果（%)

從附圖8中可知：ES-Tat-cNPs較ES-cNPs顯示更好的降糖效果，ES-Tat-cNPs的最 大降糖百分?jǐn)?shù)為66. 06%，而ES-cNPs為85. 24%。ES-Tat-cNPs的藥理相對(duì)生物利用度為 14. 30%，是 ES-cNPs 的 2. 16 倍。
[0040] 巴馬小香豬中口服ES-Tat-cNPs和ES-cNPs體內(nèi)研究 將6只健康的巴馬小香豬隨機(jī)分為兩組，分別灌胃口服將ES-Tat-cNPs (10IU/kg)和 ES-cNPs (10IU/kg)混懸液。在設(shè)定的時(shí)間點(diǎn)，從巴馬小香豬前腔靜脈收集血液樣品。所 收集的血液樣品分為兩部分：一部分立即用羅氏血糖儀測(cè)定血糖含量，通過(guò)血液樣品中的 葡萄糖含量與初始值的百分比來(lái)繪制降糖效率曲線；另外一部分加入肝素鈉后13000rpm 離心5分鐘，離心后取上清液用ELISA試劑盒測(cè)定血漿胰島素的含量，并繪制胰島素含量與 時(shí)間的曲線圖。結(jié)果見(jiàn)表5及附圖9所示。血漿中胰島素含量如表6及附圖10所示。
[0041] 表5巴馬小香豬降血糖效果_
從附圖9及附圖10中可知：巴馬小香豬口服ES-Tat-cNPs和ES-cNPs后，胰島素的主要 吸收部位為結(jié)腸。ES-Tat-cNPs組的最低降血糖效果達(dá)到60. 8%，而ES-cNPs組只有73. 4%。 此外，ES-Tat-cNPs組胰島素的最大血藥濃度為6. 5846 ng/mL，而ES-cNPs組只有為3. 432 ng/mL。ES-Tat-cNPs 口服生物利用度為ES-cNPs的1.73倍。表明本發(fā)明方法所制備的 ES-Tat-cNPs具有增強(qiáng)胰島素口服結(jié)腸吸收的功能。
【附圖說(shuō)明】
[0042] 圖1為本發(fā)明制備的ES-Tat-cNPs透射電鏡圖像。
[0043] 圖2為Tat-cNPs的透射電鏡圖像。
[0044] 圖3為在pH=l. 2中，胰島素從ES-Tat-cNPs及Tat-cNPs中釋放的曲線。
[0045] 圖4為在pH=6. 8中，胰島素從ES-Tat-cNPs及Tat-cNPs中釋放的曲線。
[0046] 圖5為在pH=7. 4中，胰島素從ES-Tat-cNPs及Tat-cNPs中釋放的曲線。
[0047] 圖6為本發(fā)明制備的ES-Tat-cNPs和ES-cNPs在Caco-2細(xì)胞中的