用具有30kDa截留分子量的超濾膜處理濾液以除去雜質(zhì)，接著脫鹽和 濃縮。其后，冷凍干燥所得產(chǎn)物，從而制備乳凝集素粉末（實(shí)施例樣品l)(68g)。乳凝集素 粉末具有78%乳凝集素含量。由此制備的乳凝集素可用作抗炎劑而無需任何處理。
[0038] 實(shí)施例2
[0039] 將實(shí)施例1中制備的乳凝集素粉末（500mg)溶解在精制水（100mL)中，并用碳酸 氫鈉將溶液的pH調(diào)整至8。其后，將胰蛋白酶（由Sigma制造）（即，蛋白酶）添加至溶液 中使最終乳凝集素濃度為〇. 01 %，用酶在37°C處理混合物一小時(shí)。然后在85°C加熱處理混 合物10分鐘以使酶失活。冷凍干燥所得混合物，從而制備乳凝集素分解物粉末（實(shí)施例樣 品2) (463mg)。由此制備的乳凝集素分解物具有5kDa以下的分子量。乳凝集素分解物可用 作抗炎劑而無需任何處理。
[0040] 實(shí)施例3
[0041] 將實(shí)施例1中制備的乳凝集素粉末（l〇g)溶解在精制水（200mL)中，然后將溶液 保持在45°C。將蛋白酶A〃Amano〃SD (由Amano Enzyme Inc?制造）（2g)添加至溶液中，并 用酶處理混合物兩小時(shí)。然后在80°C加熱處理混合物10分鐘以使酶失活。冷凍干燥所得 混合物，從而制備乳凝集素分解物粉末（實(shí)施例樣品3) (8. 2g)。由此制備的乳凝集素分解 物具有5kDa以下的分子量。乳凝集素分解物可用作抗炎劑而無需任何處理。
[0042][試驗(yàn)例1]
[0043] 評(píng)價(jià)實(shí)施例1中制備的乳凝集素或?qū)嵤├?中制備的乳凝集素分解物對(duì)抑制為炎 性細(xì)胞因子的IL-6和IL-8產(chǎn)生的效果。將具有小腸上皮細(xì)胞樣特征的人結(jié)腸癌細(xì)胞株 Caco-2接種至24-孔微量滴定板并在包含10%牛胎兒血清的杜伯克改進(jìn)的伊格爾培養(yǎng)基 (DMEM)中培養(yǎng)兩周。將實(shí)施例1中制備的乳凝集素粉末（最終濃度：0. 5、5、50或500 y g/ mL，按乳凝集素計(jì)）或?qū)嵤├?中制備的乳凝集素分解物粉末（最終濃度：0. 5、5、50或 500 y g/mL，按乳凝集素分解物計(jì)）添加至已培養(yǎng)Caco-2的微量滴定板，接著培養(yǎng)12小時(shí)。 將用做陽性對(duì)照的乳過氧化物酶（最終濃度：5、50或500 y g/mL，按乳過氧化物酶計(jì)）添加 至另一已培養(yǎng)Caco-2的微量滴定板，接著培養(yǎng)12小時(shí)。隨后，將IL-1 0 (最終濃度：0. 2ng/ mL)添加至各微量滴定板，接著培養(yǎng)24小時(shí)。其后，回收培養(yǎng)上清液，并由ELISA測(cè)定上清 液的IL-6濃度和IL-8濃度。表1和表2示出結(jié)果。
[0044][表1]
[0045]
[0046] 數(shù)值：平均值土標(biāo)準(zhǔn)偏差（n= 8)。
[0047] * :顯著低于添加相同濃度的乳過氧化物酶的情況（p〈0. 05)。
[0048] [表 2]
[0049]
[0050] 數(shù)值：平均值土標(biāo)準(zhǔn)偏差（n= 8)。
[0051] * :顯著低于添加相同濃度的乳過氧化物酶的情況（p〈0. 05)。
[0052] 參考表1和表2,乳凝集素或乳凝集素分解化合物（最終濃度：5yg/mL以上）的 添加顯著地減少培養(yǎng)上清液的IL-6濃度和IL-8濃度。該效果顯著地高于由乳過氧化物酶 的添加獲得的效果。這些結(jié)果表明乳凝集素或乳凝集素的分解物顯示出抗炎效果。
[0053] [試驗(yàn)例2]
[0054] 根據(jù)日本專利申請(qǐng)?zhí)亻_No. 2007-112793中記載的方法使用角叉菜膠誘發(fā)大鼠足 跖腫脹模型評(píng)價(jià)乳凝集素或乳凝集素的分解物的抗炎效果。具體地，將實(shí)施例1中制備的 乳凝集素粉末或?qū)嵤├?中制備的乳凝集素分解物粉末懸浮在0. 5重量％的羧甲基纖維素 水溶液中，并將懸浮液以5或50mg/kg體重的乳凝集素或乳凝集素分解物的劑量經(jīng)口給藥 于威斯特雄性大鼠（體重：110至130g，每組10只大鼠）。與上述相同的方式，將乳過氧化 物酶以50mg/kg體重的劑量經(jīng)口給藥（即，陽性對(duì)照）。一小時(shí)之后，將A-角叉菜膠（即， 炎性物質(zhì)）在生理鹽水中的1重量％懸浮液皮下注射（0. lmL)至開始腫脹的大鼠的右后肢 足妬（right hindlimb footpad)。A-角叉菜膠注射之前和注射五小時(shí)之后，測(cè)量右后肢 足跖的面積，以確定足跖體積的增加率（VI)。對(duì)于陰性對(duì)照，將既不包含乳凝集素、乳凝集 素的分解物也不包含乳過氧化物酶的〇. 5重量％的羧甲基纖維素水溶液經(jīng)口給藥于大鼠， 將X-角叉菜膠（即，炎性物質(zhì)）在生理鹽水中的1重量％懸浮液皮下注射（0. lmL)至大 鼠的右后肢足跖，并確定大鼠的足跖體積的增加率（V0)。由下式計(jì)算角叉菜膠誘發(fā)腫脹的 抑制率：{(￥0，1)八0}\100。因此，腫脹抑制率越高，表明抗炎效果越高。表3示出結(jié)果。
[0055][表3]
[0056]
[0057] 數(shù)值：平均值土標(biāo)準(zhǔn)偏差（n= 10)。
[0058] * :顯著高于給藥50mg乳過氧化物酶的情況（p〈0. 05)。
[0059] 參考表3,乳凝集素或乳凝集素的分解物以5mg/kg體重以上的劑量的經(jīng)口給藥增 加角叉菜膠誘發(fā)腫脹的抑制率，其顯著高于在經(jīng)口給藥乳過氧化物酶的情況下的抑制率。 這些結(jié)果表明乳凝集素或乳凝集素的分解物顯示出抗炎效果。
[0060] 實(shí)施例4
[0061](抗炎用膠囊劑的制備）
[0062] 按如表4所示的比例混合原料，并由常規(guī)工藝造?；旌衔锶缓竽z囊化，從而制備 抗炎用膠囊劑。
[0063][表 4]
[0064]
[0065] 實(shí)施例5
[0066] (抗炎用片劑的制備）
[0067] 按如表5所示的比例混合原料，并由常規(guī)工藝將混合物成形為坯塊（compact) (lg)，接著制徒，從而制備抗炎用片劑。
[0068][表 5]
[0069]
[0070] 實(shí)施例6
[0071] (抗炎用液狀營(yíng)養(yǎng)組合物的制備）
[0072] 將實(shí)施例樣品1 (50g)溶解在去離子水（4, 950g)中，并將溶液加熱至50°C。其后， 用 TK均質(zhì)機(jī)（TK R0B0 MICS，由 PRIMIX Corporation 制造）以 6,000rpm攪拌溶液 30 分鐘， 從而制備具有39g/5kg的乳凝集素含量的乳凝集素溶液。將乳凝集素溶液（5.0kg)與酪蛋 白（5. 0kg)、大豆蛋白（5. 0kg)、魚油（1.0kg)、紫蘇子油（3. 0kg)、糊精（17. 0kg)、礦物質(zhì)混 合物（6. 0kg)、維生素混合物（1.95kg)、乳化劑（2. 0kg)、穩(wěn)定劑（4.0kg)和香料（0.05kg) 混合。將混合物放入200-mL滅菌袋（retort pouches)并用滅菌爸（第1型壓力容器，型 號(hào)：RCS-4CRTGN，由Hisaka Works, Ltd.制造）在121°C滅菌20分鐘，從而制備抗炎用液體 狀營(yíng)養(yǎng)組合物（50kg)。
[0073] 實(shí)施例7
[0074](抗炎用飲料的制備）
[0075] 將脫脂奶粉（300g)溶解在去離子水（409g)中，并將實(shí)施例樣品3(lg)溶解在 溶液中。將溶液加熱至50°C并用超分散機(jī)（ULTRA-TURRAX T-25,由IKA Japan制造）以 9, 500rpm攪拌30分鐘。將所得混合物與麥芽糖醇（100g)、酸化劑（2g)、還原淀粉糖漿 (20g)、香料（2g)和去離子水（166g)混合。其后，將混合物放入100-mL玻璃瓶并在95°C滅 菌15秒然后密封，從而制備10瓶抗炎用飲料（各100mL)。
[0076] 實(shí)施例8
[0077](狗用抗炎用飼料的制備）
[0078] 將實(shí)施例樣品1 (2kg)溶解在去離子水（98kg)中，并將溶液加熱至50°C。其后，用 TK均質(zhì)機(jī)（MARK II 160,由PRIMIX Corporation制造）以3, 600rpm攪拌溶液40分鐘，從而 制備具有1.56g/100g的乳凝集素含量的乳凝集素溶液。將乳凝集素溶液（10kg)與大豆粉 (soybean lees) (12kg)、脫脂奶粉（14kg)、大豆油（4kg)、玉米油（2kg)、棕櫚油（23.2kg)、 玉米淀粉（14kg)、小麥粉（flour) (9kg)、麩（2kg)、維生素混合物（5kg)、纖維素（2. 8kg)和 礦物質(zhì)混合物（2kg)混合，并在120°C將混合物滅菌四分鐘，從而制備抗炎用飼料（100kg)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種抗炎劑，其包含乳凝集素和/或乳凝集素的分解物作為活性成分。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗炎劑，其中所述乳凝集素和/或乳凝集素的分解物源于牛 乳。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的抗炎劑，其中所述乳凝集素的分解物由乳凝集素用蛋白 酶分解來制備。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的抗炎劑，其中所述蛋白酶為選自由胰蛋白酶、胰酶制劑、胰凝 乳蛋白酶、胃蛋白酶和木瓜蛋白酶組成的組中的至少一種。5. -種抗炎用飲食品、抗炎用營(yíng)養(yǎng)組合物或抗炎用飼料，其包括根據(jù)權(quán)利要求1至4任 一項(xiàng)所述的抗炎劑。6. -種生物體內(nèi)的炎癥改善方法，其包括經(jīng)口攝取根據(jù)權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)所述的 抗炎劑。7. -種包含乳凝集素和/或乳凝集素的分解物作為活性成分的抗炎劑的使用方法，所 述方法包括將所述抗炎劑用于患有炎癥的患者。
【專利摘要】本抗炎劑包含乳凝集素和/或用蛋白酶處理乳凝集素而獲得的分解物作為活性成分。由于具有哺乳類的乳作為原料，該抗炎劑可簡(jiǎn)單且經(jīng)濟(jì)地生產(chǎn)并可日常安全地?cái)z取。
【IPC分類】A61K35/20, A23K1/16, A23L1/30, A61P29/00, A61K38/00, A23K1/00
【公開號(hào)】CN105025915
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201480013137
【發(fā)明人】浦園浩司, 高橋朋樹, 水野友葵, 吉岡孝一郎, 小林敏也, 加藤健
【申請(qǐng)人】雪印惠乳業(yè)株式會(huì)社
【公開日】2015年11月4日
【申請(qǐng)日】2014年3月7日
【公告號(hào)】WO2014136932A1