，隨后加入30ML由重量％比率為20:40:40的磷脂 酰絲氨酸、磷脂酰膽堿和磷脂酰乙醇胺組成的磷脂囊泡。將30PL稀釋的樣品和校準品轉移 至FX/磷脂混合物。將平板密封，輕輕混合，并在37°C溫育20-23小時。將40ML 5 mM的 S-2765溶液（DiaPharma)加入所有孔中。將平板密封，并在37°C溫育6小時。在微量培養(yǎng) 板讀數(shù)器中在405 nm讀出吸光度。通過將樣品的FX活化水平與F7校正曲線進行對比，確 定樣品的活性。
[0123] 大鼠PK研究-動物、研究方案（制品的注射、血液和制品的取樣、ELISA、數(shù)據分 析、動物的處死）。
[0124]將0?lmg/kg 的蛋白（F7、V2、VI、dV2 和 dVl)靜脈內地施用進 Sprague Dawley 大 鼠中。在施用后lmin開始取血漿樣品，并通過FVII ELISA進行分析。
[0125] HemA-PK 研究 將1.0mg/Kg的蛋白（F7、dVl)靜脈內地施用進HemA小鼠中。在施用后5min開始取血 漿樣品，并通過FVII ELISA和sTF-PT測定進行分析。
[0126] 對血漿樣品的FVII ELISA 材料 使用針對FVIIa的單克隆抗體。此外將一種單克隆抗體生物素化。使用經純化的FVIIa 變體（野生型或去唾液酸化的）作為測定校準品和測定對照品。封閉緩沖液是在30mM Tris pH 7. 2、60mM NaCl、0. 03%吐溫-20中的l%(w/v)酪蛋白。測定稀釋緩沖液（ADB)是 0? l%(w/v)酪蛋白、50mM Tris pH 7.2、0?謹 NaCl、0.05%吐溫-20。測定洗滌緩沖液是PBS + 0. 05%吐溫-20。免疫測定平板是Greiner Microlon高結合平板（#655061)?？股鞍祖溇?素-辣根過氧化物酶（SA-HRP)得自 R&D Systems。HRP 底物 Ultra-TMB 得自 ThermoFisher Pierce。空白小鼠血衆(zhòng)商業(yè)地（Bioreclamation)或通過內部來源得自⑶1或HemA小鼠。 所有其它材料（酪蛋白、Tris、NaCl、吐溫-20、PBS、硫酸）具有試劑級質量。
[0127] 用于FVIIa夾心免疫測定的方法 在4°C用0. lml/孔的針對FVIIa的抗體（ll^g/ml在PBS中）包被96-孔測定平板過 夜。將平板抽吸并用〇. 2ml/孔的封閉緩沖液在室溫在旋轉（150rpm)下封閉至少2小時。 封閉以后，用4 x 0.3ml/孔的洗滌緩沖液洗滌孔。將FVIIa樣品或標準品在ADB中1:20 稀釋至5%血漿的終濃度，并在室溫在旋轉下溫育0. lml/孔至少1. 5小時。一式三個孔地 測量所有標準品、對照品和樣品。如前所述洗滌平板以后，加入生物素化的針對FVIIa的抗 體（42ng/ml在ADB中，0. lml/孔），并將平板在室溫在旋轉下溫育至少1小時。將平板洗 滌，隨后與抗生蛋白鏈菌素-HRP (在ADB中1:1000) -起溫育，在室溫在旋轉下溫育至少1 小時。最終的平板洗滌以后，用0. lml/孔的Ultra-TMB使孔顯影，用0. 05ml/孔的2M硫酸 停止反應。在0D-450nm讀出停止的反應物，并將數(shù)據分析和校準。測定的定量下限（LLO? 通常是在100%血漿中的15-30 ng/ml FVIIa。
[0128] 用于測量rFVIIa活性的、基于可溶性組織因子（sTF)的改進的PT測定 進行凝血酶原時間（PT)測定以測量HemA小鼠摩體血漿樣品中的人rFVIIa的活性。
[0129]簡而言之，將 50ML 含有在 aPIT 緩沖液（0? 15 M NaCl, 0? 05 M Tris pH 7. 5， 0? 1%BSA)中的10%的HemA小鼠血漿和50%的人FVII-缺陷血漿（George King Inc)的樣 品與50ML sTF-PT試劑混合，并在37°C溫育30秒。sTF-PT試劑由1體積的2剛重組人可 溶性的TF (sTFi 221)和1體積的8剛磷脂囊泡（PS2°:PC4°:PE4°)組成。通過加入50ML 25 mM 0&(]12開始凝固，并在STA凝固分析儀（Diagnostica Stago Inc)上記錄凝固時間。標準品 由200-0. 78 ng/mL的系列稀釋2倍的rFVIIa (wt-rFVII或修飾的rFVIIa變體）組成。
[0130] 去唾液酸化的V2在血友病A (HemA)小鼠中的效力 急性尾巴切割效力研究 為了確定失血，用異氟烷麻醉小鼠，并將尾巴放在15 ml塑料試管內的37-38°C溫熱的 0.9%鹽水中10 min。用解剖刀離尖端4 mm切割尾巴，并立即放回單獨的預溫熱的含有10 ml鹽水的15 ml塑料試管中。讓小鼠自由地流血40 min。在尾巴切割損傷之后5分鐘或 之前15-和30-分鐘，靜脈內地施用去唾液酸化的V2和F7。通過在血液收集之前和之后將 試管稱重，通過重量分析法量化失血。
[0131] 尾靜脈橫斷效力（TVT)研究 通過在尾靜脈橫斷損傷之前1小時或之后5 min的尾靜脈注射，給HemA小鼠施用去 唾液酸化的V2或F7。使用適當?shù)穆樽?。?11解剖刀直刀片橫斷尾靜脈，并啟動計時 器。然后讓小鼠返回它的單個清潔籠，該籠具有放在4X8英寸加熱墊的頂部上的白紙墊層 (Versi-Dri ? )。在接下來的9小時中每小時和在24小時時間點監(jiān)測動物活動狀態(tài)。在監(jiān) 測表上記錄表現(xiàn)出減少的活動水平征象的任何小鼠，且立即將表現(xiàn)出過度失血征象的任何 小鼠安樂死。
[0132] 在HemA小鼠血漿中的凝血酶-抗凝血酶（TAT)測定 試劑： (1)捕獲抗體：抗凝血酶多克隆抗體，得自Enzyme Research Labs，目錄號 TAT-EIA-C. ; (2)檢測抗體：HRP-綴合的抗-AT-III多克隆抗體，得自Enzyme Research Labs，目錄號 TAT-EIA-D，（3)測定稀釋劑：得自 Enzyme Research Labs，目錄號 TAT-EIA-D， (4) HRP 底物：Amplex Red，Invitrogen，目錄號 A12216，（5) a -凝血酶：得自 Enzyme Research Labs，目錄號HT_1002a，在-8CTC保存，（6) AT-III :得自 Enzyme Research Labs， 目錄號HAT，在-80°C保存，（7) BSA :得自Sigma，目錄號A-7030 ; (8) AT-III缺陷型血漿： 購自 Enzyme Research Labs，目錄號：AT_DP，在-8CTC保存。
[0133] 緩沖劑 (1) TAT標準緩沖液：20 mM Tris-HCl，pH7.4,0. 15M NaCl，l mM EDTA，0.05 U/mL肝素； (2)包被緩沖液：1片的碳酸氫鹽+ 100ml dH20,在4°C保存；（3)封閉緩沖液：2%BSA-PBS ; (4)樣品稀釋緩沖液：加入 0? 1M HEPES，pH7. 4,0. 15M NaCl，1%BSA，0. 05% 吐溫 20,過濾和 等分，在-20°C保存；（5)底物緩沖液：向PBS緩沖液中加入50ML 5 mg/mL Amplex Red、 20W 3%H202?；旌?，在加入平板之前新鮮制備；（6) 1剛TAT標準儲備液的制備：將100ML 1. 36 mg/ml的人AT-III和5. 93ML 3. 28 mg/mL的人凝血酶加入419ML TAT緩沖液中，混 合，在37°C溫育10-20 min;(7) 60 nM TAT標準儲備液的制備：將50ML 1剛TAT復合物加 入783ML AT-III缺陷型血漿中，混合，等分成50ML/管形瓶，在-80°C保存。
[0134] 測定規(guī)程 1. 在碳酸氫鹽緩沖液中稀釋抗凝血酶pAb (捕獲抗體）（1:100稀釋度：對于一個 96-孔板，將110ML抗體加入11 mL碳酸氫鹽緩沖液中）。 2. 將100ML稀釋的包被抗體加入2HB Immulon 96-孔板上的每個孔中。輕輕敲平板 以確保所有液體覆蓋平板的底部。密封平板并在4°C溫育過夜。 3. 在自動化的平板清洗機中用300PL洗滌緩沖液洗滌4次。在最后一次洗滌以后，倒 置平板并在清潔紙巾上輕敲它。 4. 將150ML封閉緩沖液（2%BSA-PBS)加入每個孔中。密封平板并在室溫溫育1. 5小 時。 5. 在自動化的平板清洗機中用300PL洗滌緩沖液洗滌4次。在最后一次洗滌以后，倒 置平板并在清潔紙巾上輕敲它。 6. 將100ML標準品、樣品和質量控制（QC) -式三份地加入每個孔中，并在室溫溫育平 板2小時。 7. 在自動化的平板清洗機中用300PL洗滌緩沖液洗滌4次。在最后一次洗滌以后，倒 置平板并在清潔紙巾上輕敲它。 8. 將100ML HRP-檢測抗體（1/100,將110ML抗體加入11 mL綴合物稀釋劑中）加入 每個孔中。密封平板并在室溫溫育1小時。 9. 在自動化的平板清洗機中用300PL洗滌緩沖液洗滌4次。在最后一次洗滌以后，倒 置平板并在清潔紙巾上輕敲它。 10?將70ML Amplex Rd底物（新鮮制備）加入每個孔中。 11. 將平板在室溫置于暗處并溫育15-30 min。 12. 在 0D485nm/595nm 讀出平板。 13. 用4-參數(shù)曲線擬合繪制標準品；從每個ELISA板中的標準品計算得自對照和每個 樣品的濃度。
[0135] 去唾液酸化的V2在凝固活性的小鼠中的效力 進行急性尾巴切割研究以確定dV2在凝固活性的小鼠中的效力。用異氟烷麻醉凝固活 性的小鼠，并將尾巴放在15 ml塑料試管內的37-38°C溫熱的0.9%鹽水中10 min。靜脈內 施用5 mg/kg組織型纖溶酶原激活物（tPA)以后，用解剖刀離尖端50 mm切割尾巴，并放回 單獨的預溫熱的含有10 ml鹽水的15 ml塑料試管中。在尾巴切割損傷之后立即靜脈內地 施用去唾液酸化的V2和F7。讓小鼠自由地流血45 min。通過在血液收集之前和之后將試 管稱重，通過重量分析法量化失血。
[0136] 結果 去唾液酸化的或去糖基化的蛋白的體外表征 通過LC-TOF MS，分析dV2的重鏈。分析表明，在重鏈上的N-聚糖在唾液酸酶處理以 后不含有唾液酸。Gla結構域的存在，使這樣的對輕鏈的分析復雜化。為了得到經處理的 分子的唾液酸含量的總圖像，進行了唾液酸焚光標記。該方法表明，在去唾液酸化過程中除 去了 V2上的大于99. 9%的唾液酸。圖7顯示了去唾液酸化的V2的唾液酸含量分析。利用 LC-TOF MS分析和唾液酸熒光標記。對dVl進行唾液酸含量分析，也得到類似的結果（數(shù)據 未顯示）。通過磷脂依賴性的Xa活化和磷脂依賴性的TGA測定，試驗了去唾液酸化的分子 的活性。PL-Xa和PL-TGA測定證實，去唾液酸化以后蛋白的活性沒有降低（參見圖9和圖 10)。圖9顯示了對去唾液酸化的蛋白的PL-FXa活化測定。使用磷酸-脂質FXa活化測定， 試驗了去唾液酸化的VI和V2 (dVl、dV2)的活性。與它們的未修飾的母體分子相比，兩種 去唾液酸化的蛋白在該測定中具有稍微較高的活性。圖10顯示了對去唾液酸化的蛋白的 PL-TGA測定。通過PL-TGA，dV2和dVl表現(xiàn)出與它們的未修飾的母體分子相比稍微增加的 活性。將結果標準化至F7。
[0137] PL-Xa測定一致地表明dV2和dVl與它們的未修飾的母體分子相比可測量的活性 增加。表達了低糖基化的wtFVIIa、V2和VI分子（圖11)，并作為粗表達提取物試驗了表 達和活性。圖11顯示了低糖基化的FVII變體的表達。針對FVII表達，分析了電穿孔后4 天的培養(yǎng)基樣品。使用抗-Gla結構域抗體的蛋白質印跡分析顯示變體的表達。當將表達 水平標準化時，N-聚糖位點的除去似乎不影響活性。圖12顯示了使用轉染上清液確定低糖 基化的FVII變體的"比活性"。通過Xa活化測定，測定了得自低糖基化的變體的2次瞬時 轉染的粗表達上清液的活性。當將通過ELISA測得的表達標準化時，沒有觀察到由N-聚糖 除去引起的活性的下降。如在該測定中預見到的，VI和F7蛋白具有類似的活性，而V2分 子由于它的TF-無關性而具有更低的活性。這通過在純化的低糖基化的V2 (僅具有2N-聚 糖（N322和N145)，被稱作pMB121)上進行的PL-TGA活性測定進一步證實。圖13顯示了在 純化的低糖基化的變體pMB 121上的PL-TGA測定。通過PL-TGA測定，pMB 1212顯示出與F7 相比增強的活性，類似于未修飾的V2。在肝細胞清除模型中試驗了這些分子的體外清除。 dV2在該模型中表現(xiàn)出與未修飾的V2相比顯著的清除（圖14)，而對于低糖基化的變體而 言觀察到清除的邊緣增加或無增加（圖15)。
[0138]大鼠 PK 和 HemAPK 在Sprague Dawley大鼠中的藥代動力學研究證實，如通過FVII ELISA測量的，去唾液 酸化的和低糖基化的蛋白比它們的未修飾的相應物顯著更快地清除。圖16顯示了大鼠藥 代動力學結果。如通過FVII ELISA測得的，去唾液酸化的V2和VI在Sprague Dawley大 鼠中的半衰期顯著短于它們的未修飾的母體分子。對于去唾液酸化的V2、去唾液酸化的VI 和PMB121 (低糖基化的V2)而言，這也適用。兩種去唾液酸化的分子的tl/2小于1 min， 而它們的親本蛋白的tl/2大約2. 5小時。低糖基化的V2分子pMB121的清除等同于F7的 清除，具有1. 6小時的tl/2。在HemA小鼠中的PK研究具有類似的結果，其中dV2和F7分 別具有大約3 min和2. 6小時的半衰期（圖17 (A))。通過sTF-PTT凝固測定證實短半衰 期（圖17⑶）。圖17顯示了 HemA PK結果。如通過A) FVII ELISA和B) sTF-PT測定所 測得的，去唾液酸化的V2在HemA小鼠中的半衰期顯著短于它的未修飾的母體分子。
[0139] HemA效力模型 在HemA小鼠中試驗了 dV2的效力。使用HemA尾巴切割模型，證實lmg/kg (靜脈內推 注）的劑量的dV2是有效的。通過對比，在該模型中，F(xiàn)7的有效劑量是2. 5mg/kg (靜脈內 推注）。這些結果證實，dV2比F7更有效（圖18 (A))。該模型也用于證實，dV2的效力比 F7的效力更快地清除（圖18 (B))。圖18顯示了在HemA小鼠中的去唾液酸化的V2效力 研究的結果。使用dV2的研究證實，該分子在HemA尾巴切割模型中A)比F7更有效且B) 具有比F7更快的效力清除。
[0140] 使用更靈敏的TVT模型，也證實了 dV2與F7相比更快的效力清除，并確認了有效 劑量。圖19顯示了在TVT HemA模型中的dV2效力研究。使用具有較高靈敏度的效力模型 (TVT)的TVT研究證實了 dV2具有比F7更快的效力清除。在HemA小鼠中在施用后30和 60min進行的凝血酶-抗凝血酶（TAT)測量（作為致血栓性的標志物）表明dV2的顯著更 低的水平。圖20顯示了 TAT測量結果。在HemA小鼠中，與F7的有效劑量（2. 5mg/kg)相 比，在它的有效劑量（lmg/kg)施用的dV2產生了更少的凝血酶-抗凝血酶（TAT)。該數(shù)據 與效力數(shù)據一起提示，dV2具有比F7更有利的治療指數(shù)。
[0141] 在凝固活性的小鼠中的效力 在tPA治療的、凝固活性的小鼠中試驗了 dV2的效力。使用尾巴切割模型，證實了 dV2 在0. 3-lmg/kg (靜脈內推注）的劑量是有效的。通過對比，在該模型中，F(xiàn)7的有效劑量是 5mg/kg (靜脈內推注）。這些結果證實，dV2比F7更有效（圖21)。圖21顯示了在tPA治 療的、凝固活性的小鼠中的去唾液酸化的V2效力研究的結果。
[0142] 去唾液酸化的野生型因子VII (dWT Vila)的清除和效力 使用得自Novo Nordisk的NovoSeven?作為起始因子VII材料，并如上所述使用可溶 性唾液酸酶將該起始多肽去唾液酸化，如上所述生產去唾液酸化的野生型因子VII (dWT Vila)。發(fā)現(xiàn)dWT Vila具有>99%的純度、低內毒素，且不具有可檢測的唾液酸。另外，質譜 法分析表明唾液酸的選擇性除去。
[0143] 使用如上所述的Biophen FVII產色測定和改進的PT測定，分析了該dWT Vila材 料的活性，并與野生型因子VII進行了對比。這些分析中的每一個表明dWT Vila具有與野 生型因子VII多肽幾乎相同的活性。
[0144] 還使用人組織因子敲入（TFKI)小鼠模型分析和對比了 dWT Vila和野生型因子 VII (1 mg/kg)的清除。如在圖22中所示，dWT Vila的半衰期顯著短于野生型因子VII， 且清除（ml/h/kg)快了超過40倍。
[0145] 使用TFKI小鼠和上述的尾巴切割方法，研究了 dWT Vila相對于野生型因子VII的 效力。簡而言之，將5 mg/kg tPA靜脈內地注射進小鼠中，隨后離尖端50 mm剪切尾巴。然 后以在l-6mg/kg范圍內的劑量靜脈內地注射野生型因子VII (NovoSeven?)或dWT Vila。 然后從尾巴收集血液45分鐘，在收集階段中每6分鐘破壞不穩(wěn)定的凝塊。如在圖23中所 示，令人驚訝地發(fā)現(xiàn)dWT Vila比野生型因子VII明顯更有效。更具體地，3 mg/kg劑量的 dWT Vila造成了與6 mg/kg劑量的野生型因子VII相比減少的失血。鑒于該分析的結果， 確定2 mg/kg dWT Vila是6 mg/kg野生型因子VII的生物等價劑量。
[0146] 還通過上述的凝血酶-抗凝血酶（TAT)方法研究了 dWT Vila和野生型因子VII (NovoSeven?)的造成全身凝固的能力。用生物等價劑量的dWT Vila (2 mg/kg)和野生型 因子VII (6 mg/kg)處理小鼠，然后通過ELISA測量TAT復合物的形成。如在圖24中所示， 野生型NovoSeven?因子VII產生了比dWT Vila顯著更高的TAT水平。鑒于dWT Vila僅 產生基線TAT水平的事實，該實驗提示該劑量的dWT Vila不產生可觀察的全身凝固，盡管 事實上該多肽與野生型因子VII -樣有效。
[0147] 此外，還在？6(：13血栓形成模型中研究了 dWT Vila和野生型因子VII (NovoSeven?)的造成血栓形成的能力。在血栓形成研究開始之前15分鐘，用生物等價劑量 的dWT Vila (2 mg/kg)和野生型因子VII (6 mg/kg)處理小鼠。然后通過施用3.25%FeCl3 溶液開始血栓形成，然后用Doppler測量血栓形成30分鐘。將得到的血流量數(shù)據繪制在 血流量相對于時間的圖上，然后計算對照樣品的曲線下面積的百分比，以確定每個因子VII 治療組中由血栓形成造成的血流量的減小。如在圖25中所示，野生型NovoSeven?因子VII 產生了顯著減小的血流量（平均約40%)，而dWT Vila幾乎沒有顯示出血流量的減?。ㄆ骄?>90%)。該實驗證實，給定劑量的dWT Vila產生了與野生型因子VII相比極大地減小的血 栓形成。
[0148] 通過使用SN-17c三肽發(fā)熒光底物（HTI)檢查這些肽對可溶性組織因子（sTF)的 表觀結合親合力，進一步研究了 dWT Vila相對于野生型因子VII的活性和效力。如在圖26 中所示，該分析證實，dWT Vila (dF7)和野生型因子VII (F7)對sTF具有等同的表觀結合 親和力。但是，如在圖27中所示，在通過有sTF-因子VII復合物（0.5 nM因子VII [dWT Vila或野生型]，125 nM sTF)存在下滴定因子X濃度來檢查這些肽的活化因子X的能力 的實驗模型中，dWT Vila和野生型因子VII的Michaelis Menten動力學證實，dWT Vila (dF7)可以比野生型因子VII (F7)更有效地（大約2倍）活化因子X。該數(shù)據提示，dWT Vila與它的野生型相應物相比能夠在每個因子VII活性部位將更多的因子X轉化成因子 X&〇
[0149] 討論 關于開發(fā)對于急性出血的治療而言是有效的、但是具有降低的致血栓性的治療藥物， 存在未得到滿足的醫(yī)學需求。具有短半衰期的有效因子VII多肽可以潛在地產生適合用于 急性出血中的具有較大治療窗的分子。
[0150] V2和VI是兩種因子Vila變體（圖1- 3)。這些變體含有對它們的Gla結構域的 突變，所述突變增加它們對活化的血小板的親和力，且在V2的情況下，導致組織因子無關 性。兩種變體還具有2個另外的N-糖基化位點，這導致與野生型因子Vila相比延長的半 衰期，即對于血友病的治療而言有利的特性。但是，它們作為急性出血的治療劑的用途可以 受益于半衰期的縮短。該修飾可以降低脫靶效應的風險，且由此增加它們的治療指數(shù)。我 們在這里已經證實，存在于V2和VI的碳水化合物鏈上的唾液酸的除去導致所述分子