1] 4、營養(yǎng)型鑒定
[0112] 在 GMM(arg+/his+)平板上長出的單菌落 Pmet-GFP-Cps CIplO/BWP17 的營養(yǎng)型 為 arg-/his_/ura+，在 GMM(0· 67 % YNB，2 % 葡萄糖）平板上長出的單菌落 Pmet-GFP-Cps CIplO/vps4-/_ 的營養(yǎng)型為 arg+/his+/ura+。
[0113] 5、DBeQ 處理
[0114] (1)分別挑取營養(yǎng)型正確的單菌落Pmet-GFP-Cps CIplO/BWP17和單菌落 Pmet-GFP-Cps CIplO/vps4-/_到 5ml YH)培養(yǎng)基中，得到含有 Pmet-GFP-Cps CIplO/BWP17 的菌液和含有Pmet-GFP-Cps CIplO/vps4-/_的菌液，30°C、200rpm過夜培養(yǎng)。
[0115] (2)取 IOul 含有Pmet-GFP-Cps CIplO/BWP17 的菌液和含有Pmet-GFP-Cps CIplO/ vps4-/_的菌液分別加入到Iml GMM培養(yǎng)基（0. 67% YNB，2%葡萄糖并添加相應(yīng)的氨基酸） 中，分別得到培養(yǎng)體系1和培養(yǎng)體系2,30°C水浴4h。實(shí)驗(yàn)組和對照組設(shè)置如下：
[0116] 實(shí)驗(yàn)組1 :向培養(yǎng)體系1加入3ul IOmM DBeQ (DMS0溶解）處理，DBeQ終濃度為 30uM ；
[0117] 對照組1 :向培養(yǎng)體系1加入3ul IOmM DMSO處理，DMSO最終占體系總體積的3%0;
[0118] 對照組2 :培養(yǎng)體系1 ;
[0119] 對照組3 :培養(yǎng)體系2。
[0120] 6、檢測Cps的分布
[0121] 菌液離心，用適量CldH2O重懸沉淀，取2ul滴到載玻片上，壓上蓋玻片制成臨時(shí)裝 片，焚光顯微鏡下觀察Cps(GFP-cps)的分布。
[0122] 結(jié)果如圖4所示：對照組2即野生型白色念珠菌（圖4a)和對照組1(圖4c)中 的GFP-CPS可以正常進(jìn)入液泡，所以可見充滿綠色的圓形結(jié)構(gòu)（即充滿GFP-CPS的液泡）； 對照組3即vps4敲除菌株（圖4b)中，GFP-CPS不能進(jìn)入液泡并在有些液泡膜上有積聚， 所以形成綠色的環(huán)并且在部分環(huán)上有綠色的亮點(diǎn)；而實(shí)驗(yàn)組1即野生型白色念珠菌加人 30 μ M的DBeQ (圖4d)，可見部分細(xì)胞的液泡內(nèi)部為綠色，說明GFP-CPS可以進(jìn)入液泡，然而 在部分細(xì)胞中也可以看到液泡膜明顯形成一個(gè)綠色的環(huán)，顯示GFP-CPS不能徹底的定位到 液泡中。以上結(jié)果說明：DBeQ是通過抑制Vps4蛋白來抑制ESCRT系統(tǒng)功能。DBeQ可作為 ESCRT系統(tǒng)的小分子抑制劑，用于關(guān)閉細(xì)胞的ESCRT系統(tǒng)功能，從而擾亂膜轉(zhuǎn)運(yùn)體系，有利 于ESCRT系統(tǒng)缺陷下的細(xì)胞行為的研究，可作為一個(gè)細(xì)胞生物學(xué)工具用于關(guān)閉ESCRT系統(tǒng) 以研究細(xì)胞的各類功能。
[0123] 實(shí)施例3、DBeQ在抑制白色念珠菌菌絲生長中的應(yīng)用
[0124] 一、菌絲的誘導(dǎo)
[0125] 1、挑菌
[0126] 由于白色念珠菌BWP17野生型本身是arg-his-ura-缺陷型，文獻(xiàn)報(bào)道ura基因影 響出芽，為了排除ura的影響，我們選擇白色念珠菌BWP17URA3和白色念珠菌V4-/-URA3作 為實(shí)驗(yàn)對象，研究DBeQ在抑制白色念珠菌菌絲生長中的作用。
[0127] 分別挑取平板上的白色念珠菌BWP17URA3和白色念珠菌vps4-/-URA3單菌落（或 者-70°C甘油保存的菌株，加入到5ml YPD培養(yǎng)基中，分別得到白色念珠菌BWP17URA3的菌 液和白色念珠菌vps4-/-URA3的菌液，30°C、200rpm過夜搖菌。
[0128] 2、菌液的處理
[0129] 設(shè)置如下各組：
[0130] 第一組：向白色念珠菌BWP17URA3的菌液中加入3ul IOmM的DBeQ(DMS0溶解）， DBeQ最終濃度為30uM ;
[0131] 第二組：向白色念珠菌BWP17URA3的菌液中加入3ul DMSO, DMSO最終占體系總體 積的3%。；
[0132] 第三組：白色念珠菌BWPl 7URA3的菌液；
[0133] 第四組：白色念珠菌vps4-/-URA3的菌液。
[0134] 3、菌絲誘導(dǎo)
[0135] 使用20% serum誘導(dǎo)或Ph7誘導(dǎo)上述各組的菌液中菌絲的生長。具體步驟如下：
[0136] (1) 20% serum 誘導(dǎo)
[0137] 取IOul的菌液加入到800ul GMM培養(yǎng)基（添加相應(yīng)氨基酸）中，加入200ul小牛 血清，混勻，37°C水浴培養(yǎng)3h，得到誘導(dǎo)后的菌液。
[0138] (2)Ph7 誘導(dǎo)
[0139] 取IOul菌液分別加入到1000 ul Ph7的GMM培養(yǎng)基（添加相應(yīng)的氨基酸）中，混 勻，37°C水浴培養(yǎng)3h，分別得到誘導(dǎo)后的菌液。
[0140] 4、制片
[0141] 12000rpm、Imin離心上述各組獲得的誘導(dǎo)后的菌液，并適量CldH2O重懸沉淀，取 2ul制成臨時(shí)裝片，鏡下觀察菌絲形態(tài)。
[0142] 二、菌絲的形態(tài)觀察
[0143] 第三組（白色念珠菌BWP17URA3)菌絲誘導(dǎo)的形態(tài)觀察結(jié)果如圖5所示，其中，圖 5a為白色念珠菌的酵母態(tài)；圖5b為單菌絲態(tài)菌絲（當(dāng)白色念珠菌的酵母態(tài)處于誘導(dǎo)條件 (37°(：，20%86^1111或？117)下會(huì)長出的菌絲） ；圖5(3為多菌絲態(tài)菌絲（當(dāng)單菌絲態(tài)菌絲不 能正常維持極性時(shí)，會(huì)出現(xiàn)兩根或多根菌絲）。
[0144] 菌絲誘導(dǎo)率的結(jié)果如圖6和圖7所示：第三組和第四組的菌絲誘導(dǎo)率的結(jié)果如圖 6所示：圖6a為使用pH誘導(dǎo)；圖6b為使用血清誘導(dǎo)，T為總萌發(fā)率；M為多菌絲率；S為單菌 絲率；T = M+S，從圖中可以看出，如果敲除Vps4基因，其誘導(dǎo)菌絲的比例明顯下降（下降約 40-50%)，其中，血清（serum)誘導(dǎo)的環(huán)境下出現(xiàn)較多的多菌絲態(tài)，表明其具有維持極性的 缺陷。第一組、第二組和第三組的菌絲誘導(dǎo)率的結(jié)果如圖7所示：圖7a為使用pH誘導(dǎo)；圖 7b為使用血清誘導(dǎo)，從圖中可以看出：加入30nM DBeQ可以對白色念珠菌的出芽率有20% 左右的抑制效率，多菌絲率有所上升但不明顯。說明DBeQ可以抑制白色念珠菌菌絲生長。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 式I所示的DBeQ在制備抗白色念珠菌的產(chǎn)品中的應(yīng)用；2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于：所述抗白色念珠菌是通過抑制白色念珠 菌的菌絲生長體現(xiàn)的。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于：所述抑制白色念珠菌的菌絲生長是 通過抑制化s4蛋白活性體現(xiàn)的。4. 式I所示的DBeQ在抑制白色念珠菌的菌絲生長中的應(yīng)用； 或式I所示的DBeQ在制備抑制白色念珠菌的菌絲生長的產(chǎn)品中的應(yīng)用。5. 式I所示的DBeQ在抑制化s4蛋白的AWase活性中的應(yīng)用； 或式I所示的DBeQ在制備抑制化s4蛋白的AT化se活性的產(chǎn)品中的應(yīng)用。6. 式I所示的DBeQ在抑制ESCRT系統(tǒng)功能中的應(yīng)用； 或式I所示的DBeQ在制備抑制ESCRT系統(tǒng)功能的產(chǎn)品中的應(yīng)用。7. 根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一所述的應(yīng)用，其特征在于：所述化s4蛋白來源于白色念珠 菌；所述白色念珠菌具體為白色念珠菌BWP17或白色念珠菌BWP17URA3 ;所述化s4蛋白的 氨基酸序列具體如序列表中序列2所示。8. -種抗白色念珠菌的產(chǎn)品，其活性成分為式I所示的DBeQ,所述產(chǎn)品的用途為如下 (1)-(4)中的至少一種： 1) 抗白色念珠菌； 2) 抑制白色念珠菌的菌絲生長； 3) 抑制化s4蛋白的AWase活性； 4) 抑制ESCRT系統(tǒng)功能。9. 權(quán)利要求7所述的產(chǎn)品在抑制白色念珠菌的菌絲生長中的應(yīng)用； 或權(quán)利要求7所述的產(chǎn)品在抑制化s4蛋白的ATPase活性中的應(yīng)用； 或權(quán)利要求7所述的產(chǎn)品在抑制ESCRT系統(tǒng)功能中的應(yīng)用。10. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的產(chǎn)品或權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于：所述化s4蛋 白來源于白色念珠菌；所述白色念珠菌具體為白色念珠菌BWP17或白色念珠菌BWP17URA3 ; 所述化s4蛋白的氨基酸序列具體如序列表中序列2所示。
【專利摘要】本發(fā)明公開了DBeQ在抑制白色念珠菌菌絲生長中的應(yīng)用。通過實(shí)驗(yàn)證明：DBeQ是一個(gè)白色念珠菌Vps4蛋白的有效抑制劑，DBeQ是通過對Vps4蛋白的抑制作用進(jìn)而對ESCRT系統(tǒng)產(chǎn)生影響，表現(xiàn)為白色念珠菌菌絲的生長受到了抑制。因此，DBeQ不僅可以作為進(jìn)一步開發(fā)抗白色念珠菌感染的基礎(chǔ)，還可以被開發(fā)為一種研究細(xì)胞功能的研究工具用于觀察細(xì)胞在ESCRT系統(tǒng)被抑制后的變化。
【IPC分類】A61P31/10, A61K31/517
【公開號】CN104997782
【申請?zhí)枴緾N201510333600
【發(fā)明人】楊冬, 李萬杰, 張亞慧, 周偉
【申請人】北京師范大學(xué)
【公開日】2015年10月28日
【申請日】2015年6月16日