一種大孔改性蛋清細胞培養(yǎng)支架材料的制備方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及新型改性蛋清細胞培養(yǎng)支架材料的制備技術，特別涉及一種用P (MVE-alt-MAH)交聯(lián)劑交聯(lián)法制備得到的多個硬度梯度大孔改性蛋清細胞培養(yǎng)支架材料的方法。
【背景技術】
[0002]乙烯基甲醚/馬來酸酐共聚物P (MVE-alt-MAH)，又稱乙烯甲醚-馬來酸酐共聚物(甲基乙烯基醚/馬來酸酐共聚物，甲氧基乙烯/馬來酸酐共聚物)，是水溶性電解質聚合物，是人工合成化合物中少數(shù)幾種的對人體和動物無毒無害的物質。因產品具有良好的化學穩(wěn)定性、低毒性、生物相容性、絡合性、螯合性、粘合性、凝聚性、成膜性、兼有親水和疏水的獨特性能，該產品在現(xiàn)代工業(yè)中有廣泛的用途，可以起到分散劑、偶聯(lián)劑、穩(wěn)定劑、增稠劑、乳化劑、增溶劑、緩蝕劑、成膜劑和抗靜電劑的作用?？梢宰鳛榻宦?lián)劑，制備具有大孔結構的高分子材料。
[0003]組織工程支架材料是指替代細胞外基質使用的生物相容性醫(yī)學材料。除要考慮材料的組織相容性外，還要考慮力學相容性一粘彈性，合適的三維立體結構?？紫堵蕬撨_到90%以上，有較大的比表面積，有利于黏附細胞，容納細胞因子、營養(yǎng)物質，同時具有均勻分布和互相連通的孔結構，有利于細胞在整個支架體內部形成網(wǎng)絡分布，有利于代謝廢物的排出和血管神經的長入，保證再生組織具有三維有機結構。
[0004]蛋清含有細胞生長發(fā)育所需要的全部營養(yǎng)和信號成分，是一種以水作為介質，以蛋白作為分散相的膠體物質，約占雞蛋總重的60%?63%。其中的85%?89%為水分，而剩余的固形物中，約有80%的蛋白質，其力學性能及形貌有較大范圍的可改性調節(jié)。通過對蛋清培養(yǎng)支架材料采用不同方式改性，用于研宄不同的材料硬度和形貌微環(huán)境對細胞行為的影響。
[0005]P (MVE-alt-MAH)和蛋白質的酰胺化反應通過1_乙基_(3_甲基氨基丙基)碳酰二亞胺(EDC)/N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)作為活化劑和催化劑得以進行。以10mg/ml的EDC活化羧基15-20min，pH5.0，然后用10mg/ml NHS來激活反應15_20min。調節(jié)ρΗ7.2左右加入蛋白，37°C反應12h。偶聯(lián)時EDC反應的最佳條件是pH 4.5 (或者在4_6范圍之間)，使用精密PH試紙測定。反應時間6h以上，延長到12h會更好。反應完應把小分子量的脲除掉。
[0006]酰胺鍵偶合在弱堿條件下進行:1.稱NHS與反應容器中。(NHS穩(wěn)定性比EDC好)2.稱EDC。(這步要快，EDC在空氣中會受潮水解，盡量使用5倍Sulfo-NHS摩爾以上的量)3.加入PBS buffer ο 4.用NaHC0310%或者NaOH(IM)將pH調至中性反應。EDC/NHS是把兩種物質的_順2和-COOH交聯(lián)起來。COOH與EDC反應，反應后的物質再與NH 2反應，中間NHS是加速反應EDC很容易失活，半衰期只有120min，要注意馬上使用，并且防潮。
[0007]EDC起到了一個活化羧基的作用，EDC能夠和羧基反應形成一個中間物，然后這個中間物再與氨基作用，使得氨基和羧基反應形成相應的共價鍵。NHS的作用就是穩(wěn)定這個中間物，減少副反應的發(fā)生。
[0008]蛋白質化學交聯(lián)是一類重要化學修飾反應，所用交聯(lián)劑為含有雙功能基團的化學試劑。化學交聯(lián)型具有良好的力學性能和穩(wěn)定性。因為P (MVE-alt-MAH)天然安全無毒副作用，所以是目前研宄的熱點，可用于生物醫(yī)學組織工程高分子的交聯(lián)改性制備大孔支架材料。

【發(fā)明內容】

[0009]本發(fā)明的目的在于為了提供一種大孔改性蛋清細胞培養(yǎng)支架材料的制備方法，工藝簡單，周期短，且適用于批量生產。
[0010]本發(fā)明的另一個目的在于提供一種新型改性蛋清細胞培養(yǎng)支架材料，交聯(lián)度均勻，表面多皺褶或多大孔，形貌結構統(tǒng)一。
[0011]本發(fā)明提供的技術方案如下:一種大孔改性蛋清細胞培養(yǎng)支架材料的制備方法，包括以下步驟:
[0012](I)配制質量百分比濃度為20%的P (MVE-alt-MAH)水溶液，取0.025?0.2g的P (MVE-alt-MAH)水溶液加入反應器皿中；
[0013](2)取質量百分比濃度為10%的碳酸氫鈉溶液，緩慢滴加到P (MVE-alt-MAH)水溶液中，調節(jié)PH為5-6，反應10-15min ;加入1-乙基_(3_甲基氨基丙基)碳酰二亞胺活化15-20min ;再加N-羥基琥珀酰亞胺反應15_20min ；1-乙基_(3_甲基氨基丙基)碳酰二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺的質量比為1:1;
[0014](3)調節(jié)pH7.2，再加入2mL雞蛋清進行交聯(lián)，充分振蕩或攪拌后靜置，25?37°C下充分交聯(lián)反應完全；
[0015](4)將步驟(3)得到的改性蛋清培養(yǎng)支架材料用注射器逐滴滴入PBS溶液，靜止12h，使其中的多余小分子脲吸出去除，重復若干次；
[0016](5)反應后，得到的改性蛋清細胞培養(yǎng)支架材料置于細胞超凈工作臺，紫外照射殺菌即獲得用于細胞培養(yǎng)的大孔改性蛋清培養(yǎng)支架材料。
[0017]第(5)步得到的大孔改性蛋清培養(yǎng)支架材料進一步制備成凍干粉末。
[0018]第⑷步重復若干次是指的用PBS溶液重復三次，每次12h洗滌去除多余及未交聯(lián)的小分子脲。
[0019]所紫外照射殺菌為超凈臺內紫外光照不超過30min。
[0020]根據(jù)權利要求1所述的大孔改性蛋清細胞培養(yǎng)支架材料的制備方法，
[0021]基于所述的大孔改性蛋清細胞培養(yǎng)支架材料的細胞培養(yǎng)方法，將大孔改性蛋清細胞培養(yǎng)支架移入六孔板中，向每孔加入0.4mL事先準備好的SK0V3卵巢癌細胞懸液，細胞濃度為5X104cellS/mL，細胞數(shù)量每孔不低于5X 14個；在培養(yǎng)過程中，小于等于7天的培養(yǎng)時間，采用連續(xù)追加培養(yǎng)液法進行培養(yǎng)；大于等于15天以上的培養(yǎng)期，則采用每3天各孔更新一半培養(yǎng)液的辦法進行換液。
[0022]所述的基于大孔改性蛋清細胞培養(yǎng)支架材料的細胞培養(yǎng)方法，所用的細胞懸液為SK0V3卵巢癌貼壁細胞。
[0023]所述的大孔改性蛋清細胞培養(yǎng)支架材料的制備方法得到的凍干粉末的應用，將制備好的大孔改性蛋清細胞培養(yǎng)支架材料凍干粉末添加到正在貼壁培養(yǎng)瓶或皿里，短期培養(yǎng)后用以實現(xiàn)材料和細胞的分離。
[0024]有益效果
[0025]本發(fā)明所述的大孔改性蛋清細胞培養(yǎng)支架材料的制備方法，可靈活使用。制備好的大孔改性蛋清細胞培養(yǎng)支架材料可進一步制成凍干粉末，添加到正在貼壁對數(shù)生長期的貼壁細胞培養(yǎng)瓶(皿)里，短期培養(yǎng)后，易于實現(xiàn)材料和細胞的分離，研宄材料對細胞行為的影響。
[0026]本發(fā)明所制備的新型改性蛋清細胞培養(yǎng)支架材料，硬度梯度容易控制，所形成的皺褶和孔洞利于細胞的黏附生長。各孔洞互為貫通，有利于營養(yǎng)和氧氣、代謝物的交換排出，也利于細胞向材料內部生長，提高細胞培養(yǎng)密度。制備過程簡單，材料經濟，易于實現(xiàn)，蛋清本身可以給細胞提供一定的營養(yǎng)支持，不涉及采用高溫高壓裝置，安全無毒副作用。
【附圖說明】
[0027]圖1是本發(fā)明實施例1、2、3、4、5獲得的大孔改性蛋清細胞培養(yǎng)支架材料的凍干掃描電鏡圖；本發(fā)明制備得到大孔改性蛋清細胞培養(yǎng)支架材料表面皺褶、多孔，形貌結構統(tǒng)一。其中，各圖顯示了 P(MVE-zlt-MAH)完全交聯(lián)后的蛋清的形貌變化。(a)0.2gP(MVE-zlt-MAH)處理；(b)0.15g P (MVE-zlt-MAH)處理；(c)0.1g P (MVE-zlt-MAH)處理；(d)0.05g P (MVE-zlt-MAH)處理；(e)0.025g P (MVE-zlt-MAH)處理。
[0028]圖2蛋清P (MVE-zlt-MAH)交聯(lián)后流變學變化特征?？梢钥闯?，隨交聯(lián)劑量增加，支架材料的粘彈性總體有增大的趨勢。2mL蛋清P(MVE-zlt-MAH)交聯(lián)后流變學變化特征。(a) 0.2g P (MVE-zlt-MAH)處理；(b)0.15g P (MVE-zlt-MAH)處理；(c)0.1g P (MVE-zlt-MAH)處理；(d)0.05g P (MVE-zlt-MAH)處理；(e)0.025g P (MVE-zlt-MAH)處理。
[0029]圖3.SK0V3卵巢癌細胞在P (MVE-zlt-MAH)交聯(lián)蛋清支架材料中的生長狀態(tài)倒置光學顯微照片，可以看出該制備支架材料可以較好地支持細胞生長。SK0V3卵巢癌細胞在P(MVE-zlt-MAH)交聯(lián)蛋清支架材料中的生長3天后的倒置光學顯微照片。(a)0.2gP (MVE-zlt-MAH)處理蛋清中的 SK0V3 ； (b)0.15g P (MVE-zlt-MAH)處理蛋清中的 SK0V3 ；(c)0.1g P (MVE-zlt-MAH)處理蛋清中的 SK0V3 ; (d) 0.05g P (MVE-zlt-MAH)處理蛋清中的SK0V3 ； (e)0.025g P (MVE-zlt-MAH)處理蛋清中的 SK0V3。
【具體實施方式】
[0030]以下實施例所采用的原料來源說明:P (MVE-alt-MAH)購自南京晚晴化學試劑有限公司；新鮮的雞蛋清購自超市；無菌超純水取自無菌超純水自制系統(tǒng)；所用到的6孔板為無菌潔凈。
[0031]以下實施例在取溶液及蛋清等液體時，采用“毫升”為單位，即ml。溶質的質量為“克”，即go
[0032]一種新型改性蛋清細胞培養(yǎng)支架材料的制備方法，其特征在于包括以下步驟:
[0033](I)選用10mL燒杯，將20克P (MVE-alt-MAH)加入到80mL超純水中，加熱90°C攪拌2h以上，充分溶解至無色透明。配制成20%溶液。分別取20% P (MVE-alt-MAH)溶液ImL,0.75mL、0.5mL、0.25mL、0.125mL,即 0.2 克、0.15 克、0.I 克、0.05 克、0.025 克，于 6 孔板中；
[0034]P (MVE-alt-MAH)交聯(lián)劑質量不設零克。加熱攪拌2h以上，無色透明溶液為其充分溶解特征。比較適應的溶解溫度為90°C，磁子攪拌轉速為300-400r/m。不宜超過6h，否則可能發(fā)黃，影響觀察。除6孔板外，其它燒瓶、燒杯、培養(yǎng)皿等容器也可以代替進行。
[0035](2)取10 %的碳酸氫鈉溶液，緩慢滴加到6孔板中，調P (MVE-alt-MAH)的pH為5，反應10-15min ;加1-乙基_(3_甲基氨基丙基)碳酰二亞胺(EDC)，活化15_20min ;再加N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，反應15-20min ；
[0036]中和時要緩慢，一滴一滴的加，防止氣泡溢出。pH為5-6均可。EDC/NHS要現(xiàn)用現(xiàn)加，質量比1:1。要充分攪拌和振蕩。促進反應均勻充分。
[0037](3)調節(jié)pH7.2左右，加2mL新鮮的雞蛋清進行交聯(lián)，充分振蕩或攪拌后靜置，室溫下25-37°C反應12-24h，使其充分交聯(lián)完全；
[0038]此反應實際上6h左右即可發(fā)生完全，但考慮到材料試劑的不均一性，放置24h基本上可以保證交聯(lián)充分。
[0039](4)將步驟(3)得到的改性蛋清培養(yǎng)支架材料用注射器逐滴滴入PBS溶液，靜止12h，使其中的多余小分子脲吸出去除，重復三次；
[0040](4)反應后，得到的改性蛋清細胞培養(yǎng)支架材料置于細胞超凈工作臺，紫外照射30min,保證培養(yǎng)支架材料的無菌狀態(tài)，加入事先準備好的SK0V3卵巢癌細胞懸液，即可獲得用于細胞培養(yǎng)的多個硬度梯度大孔蛋清培養(yǎng)支架材料。在培養(yǎng)過程中，短期培養(yǎng)，如7天左右，可連續(xù)追加培養(yǎng)液培養(yǎng)；長期培養(yǎng)，如15天以上，每3天各孔更新一半培養(yǎng)液的辦法進行換液。
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