Sirt1激活劑及其應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)藥生物領域，具體涉及一種Sirtl激活劑組合物及其在促進間充質 干細胞成骨轉化方面的應用。
【背景技術】
[0002] 在各種物種中發(fā)現(xiàn)的SIR2的同源蛋白質統(tǒng)稱為Sirtuins家族（Michishita，Park 等人，2005)。哺乳動物中Sirtuins家族有7個成員（Sirtl-Sirt7)，其中Sirtl與Sir2的 同源性最高。Sirtl通過與不同的組蛋白（Vaquero，Scher等人，2004)和非組蛋白底物相 互作用（Luo，Nikolaev 等人，2001 ;Vaziri，Dessain 等人，2001 ;Langley，Pearson 等人， 2002 ;Smith 2002 ;Yeung，Hoberg 等人，2004 ;Nemoto, Fergusson 等人，2005)，對細胞的生 存、凋亡、代謝等都發(fā)揮重要作用。人Sirtl基因位于10q22. 1，長約33kb，翻譯后的蛋白質 分子量大小約為60ku，不存在剪切變異體，具有NAD依賴的脫乙?；富钚浴Ｔ摰鞍讖V泛 存在于機體的各種體細胞及生殖細胞中。研宄發(fā)現(xiàn)，Sirtl蛋白能延長酵母、果蠅和線蟲等 低等生物的壽命。在小鼠和人等高等動物中，它參與調(diào)控惡性腫瘤生成及化療耐藥、應激應 答、細胞代謝和老化等多種生命活動，從而作為治療惡性腫瘤、糖尿病、血管老化以及帕金 森等疾病的潛在靶點而引起廣泛關注。
[0003] 目前，Sirtl激活劑首先在天然植物中發(fā)現(xiàn)，例如，白藜蘆醇、槲皮素和紫鉚因；其 中，白藜蘆醇是天然發(fā)現(xiàn)的活性最強的Sirtl激活劑。隨著人們對Sirtl靶點認識的深入， 人工合成Sirtl激活劑開始得到重視，相繼開出了 SRT1720、SRT1460和SRT2183等Sirtl 激活劑。
[0004] 骨髓或脂肪來源的間充質干細胞（MSC)具備以下優(yōu)勢：1)取材方便，易于分離培 養(yǎng)擴增；2)具有免疫調(diào)節(jié)能力，同種異體移植MSCs可誘導免疫耐受；3)遺傳背景穩(wěn)定，適 合作基因治療的載體細胞；4)具有多向分化潛能，可分化為骨、軟骨、脂肪、內(nèi)皮、神經(jīng)和胰 島樣等多種細胞。這些優(yōu)勢使其成為組織和細胞工程理想的種子細胞。
[0005] 移植能夠進行骨生成分化的干細胞或者定向于骨生成分化的細胞是治療骨相關 疾?。ㄌ貏e是當所述治療需要新骨產(chǎn)生時）的有前景的途徑。先前已使用骨髓干細胞 (BMSC)和間充質干細胞（MSC)治療骨疾?。℅angji 等，2005，Expert Opin Biol Ther(5): 437-42)。然而，盡管可以將這些相對未分化的干細胞進行移植，但是它們并不定向分化為 骨生成譜系，因此這樣移植的干細胞中有相當大的比例最終可能不會形成期望的骨組織。 因此在干細胞相關的骨相關疾病的治療中，需要成骨誘導劑的參與。截至目前，并未發(fā)現(xiàn) Sirtl激活劑作為成骨誘導劑的應用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的一個目的是提供一種Sirtl激活劑組合物，其由白藜蘆醇和淫羊藿苷組 成，白藜蘆醇與淫羊藿苷的重量比為10 :1~1〇〇。
[0007] 本發(fā)明研宄發(fā)現(xiàn)雖然淫羊藿苷具有較低的Sirtl激活活性，但是其與白藜蘆醇合 用時可以極大提高白藜蘆醇的Sirtl激活活性。
[0008] 在本發(fā)明的一個實施方案中，所述白藜蘆醇與淫羊藿苷的重量比為10 :2~6,優(yōu) 選為10 :3。
[0009] 經(jīng)本發(fā)明深入研宄發(fā)現(xiàn)，所述組合物還可以添加黃芩苷，從而使組合物獲得更好 的技術效果。所述組合物中，白藜蘆醇、淫羊藿苷和黃芩苷的重量比為10 :1~1〇〇 :1~10 ; 優(yōu)選為10 :3 :2。
[0010] 本發(fā)明的另一個目的是提供所述Sirtl激活劑組合物在作為成骨分化誘導劑的 應用。
[0011] 在本發(fā)明中，所述組合物可以作為成骨分化誘導劑添加到骨移植材料上，也可以 添加到體外細胞培養(yǎng)基中誘導骨髓間充質干細胞或脂肪間質干細胞向成骨方向轉化，從而 使上述干細胞作為種子細胞應用到骨組織工程或骨移植材料當中。所述組合物也可以作為 藥物用于骨質疏松癥的治療，并且也可聯(lián)合骨髓間充質干細胞移植來防治一些骨疾病。當 作為藥物進行使用時，優(yōu)選將組合物制備成口服制劑進行使用。
[0012] 在上述所述的醫(yī)藥用途中，對于給藥時間和給藥次數(shù)需要根據(jù)病情的具體診斷結 果而定，這在本領域技術人員掌握的技術范圍之內(nèi)。例如，將對小鼠的治療方案應用于人身 上，組合物對人的有效劑量可以通過該藥物對小鼠的有效劑量進行換算，這對于本領域的 普通技術人員來說是顯而易見的。
【具體實施方式】
[0013] 下面將進一步的詳細說明本發(fā)明。需要指出的是，以下說明僅僅是對本發(fā)明要求 保護的技術方案的舉例說明，并非對這些技術方案的任何限制。本發(fā)明的保護范圍以所附 權利要求書記載的內(nèi)容為準。
[0014] 實施例1 Sirtl激活劑組合物對骨髓間充質干細胞（BMSCs)中Sirtl蛋白表達的 影響
[0015] 骨髓間充質干細胞（BMSCs)的培養(yǎng)：將2月齡雄性大鼠脫頸處死后，在無菌取下雙 側股骨和脛骨，暴露骨髓腔，反復沖洗骨髓腔至平皿中，收集平皿中的培養(yǎng)液至離心管中， lOOOrpm，3min離心，棄上清液，再用含10% FBS的a -MEM培養(yǎng)液重懸細胞，當細胞密度達 80 %時，進行傳代培養(yǎng)，第4代細胞可用于實驗。以5 X 104個? mL，農(nóng)度接種于96孔細胞 培養(yǎng)板，每孔200 yL。試驗分為以下各組：
[0016]
[0017] 對照組僅添加不含任何藥物的培養(yǎng)基，每組設置6個復孔，在加入組合物3天后， 收集細胞，粉碎，離心取上清，采用ELISA試劑盒測定細胞內(nèi)Sirtl蛋白含量，具體結果如 下：
[0018]
[0019] 另外，采用MTT法測定了各組BMSCs的細胞活性，以考察組合物對細胞活性的影 響，具體結果如下：
[0020]

[0021] 從上述結果可以看出，所述sirtl激活劑組合物不僅可以極大提高BMSCs中的 Sirtl蛋白表達，并且可以促進BMSCs增殖。
[0022] 實施例2 Sirtl激活劑組合物誘導骨髓間充質干細胞（BMSCs)體外成骨分化的研 宄
[0023]BMSCs培養(yǎng)方法、分組及組合物用量同實施例1，另外添加了對比例組，對比例為 常規(guī)成骨誘導劑，具體為：終濃度為〇. 01M/L地塞米松，10mM/L的0 -甘油磷酸鈉和50mg/ L的維生素C。
[0024] 在加入組合物7天后，收集細胞，粉碎，離心取上清，采用常規(guī)試劑盒測定ALP活性 和骨鈣素含量，具體結果如下：
[0025]
[0026]
[0027] 在加入組合物孵育14天后，采用茜素紅法測定鈣結節(jié)數(shù)量，具體結果如下：
[0028]
[0029] 實施例3 Sirtl激活劑組合物對去卵巢大鼠骨質疏松癥的保護作用
[0030] 取雌性SD大鼠，體重200g左右，總體分為正常對照組、模型組、給藥組，每組10只 大鼠，各組用水合氯醛麻醉，從背側入路完整摘除雙側卵巢，正常對照組只進行手術不切除 卵巢，分層縫合切口。術后一天開始給藥，各給藥組劑量均為l〇mg/kg (給藥組分為四組，具 體重量比同實施例1中的組1-4和組7)，每天灌胃給藥一次，模型組和正常對照組給予等量 的生理鹽水。給藥12周后，處死大鼠取血及相關組織進行檢測。
[0031] 1、血清生化檢測
[0032] 采用全自動生化分析儀檢測各組大鼠血清鈣和血清磷的含量，結果如下：
[0033]
[0034]

[0035] 2、骨密度檢測
[0036] 采用雙能X射線吸收骨密度儀測定大鼠股骨及脛骨骨密度，結果如下：
[0037]
[0038] 本
【發(fā)明內(nèi)容】
僅僅舉例說明了要求保護的一些具體實施方案，其中一個或更多個技 術方案中所記載的技術特征可以與任意的一個或多個技術方案相組合，這些經(jīng)組合而得到 的技術方案也在本申請保護范圍內(nèi)，就像這些經(jīng)組合而得到的技術方案已經(jīng)在本發(fā)明公開 內(nèi)容中具體記載一樣。
【主權項】
1. Sirtl激活劑組合物，其由白藜蘆醇和淫羊藿苷組成，白藜蘆醇與淫羊藿苷的重量比 為 10 :1 ~IOOo2. 根據(jù)權利要求1所述的Sirtl激活劑組合物，其特征在于，所述白藜蘆醇與淫羊藿苷 的重量比為10 :2~6。3. 根據(jù)權利要求2所述的Sirtl激活劑組合物，其特征在于，所述白藜蘆醇與淫羊藿苷 的重量比為10 :3。4. 根據(jù)權利要求1所述的Sirtl激活劑組合物，其特征在于，所述組合物還可以添加黃 芩苷，所述組合物中，白藜蘆醇、淫羊藿苷和黃芩苷的重量比為10 :1~100 :1~10。5. 根據(jù)權利要求4所述的Sirtl激活劑組合物，其特征在于，白藜蘆醇、淫羊藿苷和黃 芩苷的重量比為10 :3 :2。6. 權利要求1-5任一項所述Sirtl激活劑組合物作為成骨分化誘導劑的應用。7. 權利要求1-5任一項所述Sirtl激活劑組合物在制備治療骨質疏松癥藥物中的應 用。
【專利摘要】本發(fā)明屬于醫(yī)藥生物領域，具體涉及一種Sirt1激活劑組合物及其在促進間充質干細胞成骨轉化方面的應用。其由白藜蘆醇和淫羊藿苷組成，白藜蘆醇與淫羊藿苷的重量比為10：1～100。在進一步地實施方案中，所述組合物還可以添加黃芩苷，從而使組合物獲得更好的技術效果。所述組合物中，白藜蘆醇、淫羊藿苷和黃芩苷的重量比為10：1～100：1～10；優(yōu)選為10：3：2。
【IPC分類】A61P19/10, A61K31/05, A61P19/08, A61K31/7048
【公開號】CN104958310
【申請?zhí)枴緾N201510268673
【發(fā)明人】張靜瑩
【申請人】大連大學
【公開日】2015年10月7日
【申請日】2015年5月22日