Yro培養(yǎng)液：酵母浸膏10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，加三蒸水900ml溶解，定容至 1000ml，高壓滅菌（121°C，15min)后4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0034] PBS緩沖溶液（PH7. 2):氯化鈉8. 0g、氯化鉀0. 4g、磷酸氧二鈉0. 133g、磷酸二氧 鉀〇. 〇6g、碳酸氧鈉0. 35g，加三蒸水1000ml溶解后，高壓滅菌（121°C，15min)，4°C保存?zhèn)?用。
[0035] 4、XTT法測定白樺脂酸體外抗白念珠菌生物被膜活性
[0036] XTT還原法的基本原理：四氮唑鹽能夠在電子耦合劑甲萘醌的作用下，通過具有 線粒體活性的酵母細(xì)胞轉(zhuǎn)化為具有特殊顏色的甲月替四氮唑鹽。
[0037] 4. 1培養(yǎng)條件
[0038] 實(shí)驗(yàn)前用接種圈從4°C保存的SDA培養(yǎng)基上挑取白念珠菌SC5314單克隆，接種 至lml的YH)培養(yǎng)液中，于30°C，200rpm震蕩培養(yǎng)，活化16h，使真菌處于指數(shù)生長期后期。 取該菌液至1. 5ml玻璃管中，離心棄除上清液，用lmlPBS緩沖液吹打混勻，離心棄除上清 液，重復(fù)用PBS緩沖液洗一次，用lmlRPMI1640培養(yǎng)液吹打混勻，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，以 RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)整菌液濃度至106cells/ml，將菌液接種到96孔板1-11號孔，37°C恒 溫箱中靜置培養(yǎng)90min。
[0039]4. 2對生物被膜的影響
[0040] (1)對白念珠菌生物被膜增殖的抑制效果
[0041] 取無菌96孔板，于每排11號孔加RPMI1640培養(yǎng)液150y1作為陽性對照；2-10 號孔各加RPMI1640培養(yǎng)液150y1 ; 1號孔分別加RPMI1640培養(yǎng)液297y1和白樺脂酸 3y1或RPMI培養(yǎng)液297y1和氟康唑藥液3y1或RPMI1640培養(yǎng)液298. 8和AmB藥液 1. 2y1。1-10號孔10級倍比稀釋，使各孔的白樺脂酸最終藥物濃度分別為64、32、16、8、4、 2、 1、0. 5、0. 25 和 0? 125ymol/L，F(xiàn)LC最終藥物濃度分別為 1024、512、256、128、64、32、16、8、 4、和 2ymol/L，AmB最終藥物濃度分別為 16、8、4、2、1、0. 5、0. 25、0. 0625 和 0? 03125ymol/ L，各孔中DMS0含量均低于1 %。取出培養(yǎng)90min的生物被膜板，用PBS換成溶液洗3次， 取配好的含藥物培養(yǎng)液100U1加入到被模板對應(yīng)的孔中，12號孔不培養(yǎng)生物被膜作為陰 性對照。各藥敏板于37°C繼續(xù)靜置培養(yǎng)24h
[0042] (2)對白念珠菌成熟生物被膜的抑制作用
[0043] 培養(yǎng)24h之后，取無菌96孔板，于每排11號孔加RPMI培養(yǎng)液150ml作為陽性對 照；2-10號孔各加RPMI1640培養(yǎng)液150y1 ;1號孔分別加RPMI1640培養(yǎng)液297y1和 白樺脂酸3y1或RPMI培養(yǎng)液297y1和氟康唑藥液3y1或RPMI1640培養(yǎng)液298. 8和 AmB藥液1. 2y1。1-10號孔10級倍比稀釋，使各孔的白樺脂酸最終藥物濃度分別為64、 32、16、8、4、2、1、0. 5、0. 25 和 0? 125ymol/L，F(xiàn)LC最終藥物濃度分別為 1024、512、256、128、 64、32、16、8、4、和 2ymol/L，AmB最終藥物濃度分別為 16、8、4、2、1、0. 5、0. 25、0. 0625 和 0. 03125ymol/L，各孔中DMS0含量均低于1 %。取出培養(yǎng)24h的生物被膜板，用PBS清洗3 次，取配好的含藥物培養(yǎng)液l〇〇ml加入到被模板對應(yīng)的孔中，12號孔作為陰性對照不培養(yǎng) 生物被膜。各藥敏板于37°C培養(yǎng)。
[0044] 5、SMIC值測定
[0045] 白念珠菌生物被膜于37°C培養(yǎng)24h后，取出生物被膜板，用PBS緩沖液輕輕洗3 次，每孔加入200y1的XTT/menadione溶液，于37°C靜置避光孵育2-3h，取出生物被膜板， 吸取100U1的XTT/menadione溶液至無菌96孔板中，用InfiniteM200多功能酶標(biāo)儀于 490nm測定各孔0D值。與陽性對照空相比，以0D值下降80 %以上的最低濃度孔中的藥物 濃度為SMIC8Q。
[0046] 上述實(shí)驗(yàn)均平行操作5到6次，當(dāng)SMIC80值能準(zhǔn)確重復(fù)或只差一個(gè)濃度時(shí)才被接 受，并以較高濃度作為SMIC80值；當(dāng)SMIC80值相差兩個(gè)濃度以上時(shí)，則需重新實(shí)驗(yàn)，直到符 合要求為止。
[0047]表1
[0048] /n/v 對培養(yǎng)90min的生物被膜的對培養(yǎng)24h的生物被膜的 組分 < SMIC801H(umo!/L) SMK：80(fi(umol/L) 白樺脂酸__20__4X)_ 兩性霉素B__Z0__Z0_ 氟康哩__大于1024__大于1024_
[0049] 表1的結(jié)果顯示：白樺脂酸對白念珠菌生物被膜具有較強(qiáng)的抑制作用，當(dāng)白樺 脂酸的濃度為64、32、16、8、4、2ymol/L時(shí)，均具有較強(qiáng)的抑制白念珠菌生物被膜增殖的作 用，與兩性霉素效果相當(dāng)；當(dāng)白樺脂酸的濃度為64、32、16、8、4ymol/L時(shí)，均具有較強(qiáng)的抗 白念珠菌成熟生物被膜作用。
[0050] 以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人 員，在不脫離本發(fā)明方法的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和補(bǔ)充，這些改進(jìn)和補(bǔ)充也應(yīng)視為 本發(fā)明的保護(hù)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 白樺脂酸及其藥學(xué)上可接受的鹽在制備抗真菌生物被膜藥物中的應(yīng)用。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的真菌為白念珠菌。3. 白樺脂酸在制備抑制白念珠菌生物被膜形成的藥物中的應(yīng)用。4. 白樺脂酸在制備消除白念珠菌生物被膜的藥物中的應(yīng)用。5. -種抗真菌生物被膜的藥物組合物，其特征在于，包括有效量的白樺脂酸和藥學(xué)上 可接受的輔料或載體。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的藥物組合物，其特征在于，所述的真菌為白念珠菌。7. 根據(jù)權(quán)利要求1-4所述的應(yīng)用、權(quán)利要求5所述的藥物組合物，其特征在于，所述的 藥物為膏藥、乳劑、噴霧劑或膜劑。
【專利摘要】本發(fā)明涉及白樺脂酸及其藥學(xué)上可接受的鹽在制備抗真菌生物被膜藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種有效的抗白念珠菌生物被膜的方法，本發(fā)明所用化合物白樺脂酸在較低的濃度下具有抑制白念珠菌生物被膜生長，或抑制已成熟的生物被膜的作用，其最低有效濃度僅為2.0μmol/L。本發(fā)明不僅為白樺脂酸提供了一種新的用途，也為臨床上抑制真菌生物被膜的形成或破壞成熟的真菌生物被膜提供了有效的藥物。
【IPC分類】A01P3/00, A61P31/10, A61K31/56, A01N45/00
【公開號】CN104940211
【申請?zhí)枴緾N201510310440
【發(fā)明人】曹曉宏
【申請人】曹曉宏
【公開日】2015年9月30日
【申請日】2015年6月8日