白樺脂酸在制備抗真菌生物被膜藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)藥化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，是白樺脂酸在制備抗真菌生物被膜藥 物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 生物被膜是一個(gè)微生物聚集群體，是微生物不可逆的與無(wú)活力生物或活組織表面 接觸，由自身產(chǎn)生的細(xì)胞外基質(zhì)包裹著活細(xì)菌細(xì)胞形成的微生態(tài)結(jié)構(gòu)。生物被膜可形成于 自然環(huán)境中，也可形成于人類(lèi)宿主體內(nèi)，它具有保護(hù)微生物細(xì)胞，抵抗各種理化刺激，調(diào)節(jié) 基因表達(dá)等作用。在日常生活和工業(yè)生產(chǎn)中，細(xì)菌生物被膜普遍存在，絕大多數(shù)細(xì)菌為了 生產(chǎn)，聚集形成生物被膜，從而可以生長(zhǎng)在各種物體表面的保護(hù)膜中。早在1991年有研宄 表明，細(xì)菌生物被膜具有三維結(jié)構(gòu)，細(xì)菌含量不到1/3,而絕大部分是細(xì)菌分泌的粘性物質(zhì)。 生長(zhǎng)在細(xì)菌生物被膜上的細(xì)菌在其生物學(xué)特性上，與浮游菌有明顯的不同。浮游菌易獲得 營(yíng)養(yǎng)和氧氣，也易于排出代謝物，故繁殖快；而被膜細(xì)菌由于胞外多糖基質(zhì)的屏障難以獲得 營(yíng)養(yǎng)供給而代謝緩慢。微生物產(chǎn)生生物被膜是一種重要的耐藥機(jī)制，在植入性器材，比如各 種人工假體、血管內(nèi)插管等常常發(fā)生真菌生物被膜感染，微生物形成生物被膜之后，耐藥性 可發(fā)生極為顯著的變化，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，白色念珠菌形成生物被膜之后，對(duì)唑類(lèi)抗真菌藥物的 MIC大大增加，是游離細(xì)胞的128倍以上。如何防治和克服生物被膜耐藥問(wèn)題，已成為臨床 醫(yī)學(xué)亟需客服的難題。
[0003] 白樺脂酸（Betulinicacid，BA)是一種五環(huán)三貓類(lèi)化合物，在自然界中廣泛存在， 在白樺樹(shù)皮中含量尤為豐富，1995年P(guān)isha發(fā)現(xiàn)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中白樺脂酸都能誘導(dǎo)黑色素瘤 細(xì)胞的凋亡。此外，研宄表明該類(lèi)化合物具有顯著的抗腫瘤和抗HIV活性。白樺脂酸結(jié)構(gòu) 如下所示。
[0005] 中國(guó)期刊《華中科技大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版）》，2010年10月第39卷第5期刊登的論 文《白樺脂酸抑制鼻咽癌細(xì)胞CNE-1生長(zhǎng)及其機(jī)制探討》，公開(kāi)了白樺脂酸對(duì)鼻咽癌細(xì)胞的 抑制作用，MTT結(jié)果顯示：小劑量的白樺脂酸即對(duì)鼻咽癌CNE-1細(xì)胞有抑制生長(zhǎng)作用。中國(guó) 期刊《中國(guó)藥學(xué)雜志》，2012年5月第47卷第9期刊登的論文《白樺脂酸抑制食管鱗狀細(xì)胞 癌增殖及相關(guān)機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研宄》，研宄抗腫瘤藥物白樺脂酸對(duì)人食管鱗癌細(xì)胞的抑制作用 及抗腫瘤作用機(jī)制，結(jié)果顯示：白樺脂酸能抑制人食管鱗癌KYSE170細(xì)胞的生長(zhǎng)，這一作用 可能是通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、阻滯細(xì)胞停留在S期來(lái)實(shí)現(xiàn)的。中國(guó)期刊《吉林大學(xué)學(xué)報(bào)》，2009 年5月第40卷第3期刊登的論文《白樺脂酸體外抗腫瘤的活性和機(jī)制》，公開(kāi)了白樺脂酸對(duì) 腫瘤細(xì)胞（人宮頸癌細(xì)胞HeLa，人乳腺癌細(xì)胞MCF-7,ZR)的生長(zhǎng)具有抑制作用，細(xì)胞生長(zhǎng) 抑制率隨劑量的增加而增加。黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)2012年6月博士學(xué)位論文《白樺脂酸誘導(dǎo) 人宮頸癌HeLa細(xì)胞凋亡及機(jī)制的研宄》公開(kāi)了白樺脂酸有明顯的抑制宮頸癌HeLa細(xì)胞生 長(zhǎng)的作用，并誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制可能與誘導(dǎo)caspase-3、CytoC蛋白的過(guò)度表 達(dá)，開(kāi)放線粒體凋亡通路有關(guān)。
[0006] 但是，關(guān)于白樺脂酸的抗真菌生物被膜作用，目前還未見(jiàn)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的主要目的是提供白樺脂酸的新的藥理用途。
[0008] 本發(fā)明的再一的目的是，提供一種抗真菌生物被膜的藥物組合物。
[0009] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：
[0010] 白樺脂酸及其藥學(xué)上可接受的鹽在制備抗真菌生物被膜藥物中的應(yīng)用。
[0011] 所述的鹽為鹽酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽、醋酸鹽等；所述的真菌為白念珠菌。
[0012] 所述的白樺脂酸結(jié)構(gòu)如下所示：
[0014] 白樺脂酸在制備抑制白念珠菌生物被膜形成的藥物中的應(yīng)用。
[0015]白樺脂酸在制備消除白念珠菌生物被膜的藥物中的應(yīng)用。
[0016] 所述的藥物為膏藥、乳劑、噴霧劑或膜劑。
[0017] 為實(shí)現(xiàn)上述第二個(gè)目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：
[0018] 一種抗真菌被膜的藥物組合物，包括有效量的白樺脂酸和藥學(xué)上可接受的輔料或 載體。
[0019] 所述的真菌為白念珠菌。
[0020] 所述的藥物為膏藥、乳劑、噴霧劑或膜劑。所述的藥物用于抑制真菌生物被膜的生 長(zhǎng)增殖，或用于抑制已形成的真菌生物被膜。
[0021] 本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于：
[0022] 本發(fā)明提供了一種有效的抗白念珠菌生物被膜的方法，本發(fā)明所用化合物白樺脂 酸在較低的濃度下具有抑制白念珠菌生物被膜生長(zhǎng)，或抑制已成熟的生物被膜的作用，其 最低有效濃度僅為2.0ymol/ml。本發(fā)明不僅為白樺脂酸提供了一種新的用途，也為臨床上 抑制真菌生物被膜的形成或破壞成熟的真菌生物被膜提供了有效的藥物。
【具體實(shí)施方式】
[0023] 下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明作詳細(xì)說(shuō)明，但是應(yīng)理解所述實(shí)施例僅是范例， 不對(duì)本發(fā)明構(gòu)成任何限制。應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明 技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改或替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0024] 實(shí)施例1白樺脂酸對(duì)白念珠菌生物被膜的作用
[0025] 1、藥物
[0026] 白樺脂酸：購(gòu)自上海一研生物科技有限公司；氟康唑：購(gòu)自Sigma公司；兩性霉素 B:購(gòu)自Sigma公司；XTT購(gòu)自Sigma公司；二甲亞砜（DMSO)購(gòu)自Sigma公司；PBS溶液購(gòu)自 Sigma公司
[0027] 白樺脂酸用DMSO溶解，使用前經(jīng)0. 22ym的過(guò)濾器過(guò)濾除菌，-20°C避光保存； 兩性霉素B與氟康唑分別溶解于DMSO溶液中。XTT用滅菌的PBS緩沖溶液配成.5mg/ml 的飽和溶液，經(jīng)0. 22ym的過(guò)濾器過(guò)濾除菌；menadione用100%丙酮配成10M溶液，XTT、 menadione于-80°C保存。實(shí)驗(yàn)前先將藥液取出并于保溫箱中梯度融化。
[0028] 2、實(shí)驗(yàn)用菌株
[0029] 白念珠菌SC5315,購(gòu)自ATCC。實(shí)驗(yàn)菌株于沙堡葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（SDA)劃板活化， 于30°C培養(yǎng)48h后，挑取單克隆再次劃板活化，取第二次所得單克隆置于SDA平板，用上述 方法培養(yǎng)后于4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0030] 3、培養(yǎng)液的配置
[0031]RPMI1640 液體培養(yǎng)液：RPMI1640(GibcoBRL) 10g、NaHC032. 0g、嗎啡丙磺酸 (MOPS，Sigma) 34. 5g，加三蒸水900ml溶解，NaOH調(diào)pH至7.0,三蒸水定容至1000ml， 0. 22ym微孔濾膜過(guò)濾除菌，分裝后于4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0032] 沙堡葡萄糖瓊脂固體培養(yǎng)基（SDA):蛋白胨10g，葡萄糖40g，瓊脂18g，加三蒸水 900ml溶解，加入2mg/ml氯霉素水溶液50ml，調(diào)整pH至7. 0,以三蒸水定容至1000ml，高壓 滅菌（121°C，15min)后子4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0033]