溫敏型膠原基復(fù)合止血凝膠及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及了溫敏型膠原基復(fù)合止血凝膠及其制備方法，屬于生物醫(yī)用材料制備領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]外科及創(chuàng)傷手術(shù)中廣泛出血與滲血給人類生命造成極大的危險(xiǎn)，單靠機(jī)體生理性止血遠(yuǎn)不能達(dá)到快速有效的止血效果，因此引入外源性物質(zhì)以加速傷口止血非常必要。止血材料一直是生物材料領(lǐng)域的研宄熱點(diǎn)，尤其是可吸收性止血材料，目前國內(nèi)外主要的可吸收止血材料包括纖維蛋白膠、明膠、膠原、氧化纖維素、殼聚糖及藻酸鈣等，這些上市產(chǎn)品多以海綿、纖維、粉狀、膜狀等劑型出現(xiàn)，雖然這些產(chǎn)品的止血效果能夠滿足一般創(chuàng)傷快速止血的需求，但臨床上創(chuàng)傷傷口的形式、形狀多變又復(fù)雜，這些產(chǎn)品由于再塑性較差，并不能完全滿足于患者的不同傷口部位、大小、滲出液量等，而且在手術(shù)操作中這些材料極易黏附在手套、手術(shù)器械等的表面上造成手術(shù)的不便。
[0003]近年來，水凝膠因其可塑性強(qiáng)，又可維持創(chuàng)傷傷口濕潤的外部環(huán)境，并促進(jìn)多型核白血球與巨噬細(xì)胞的活化，可自體清創(chuàng)，有效地抑制創(chuàng)傷傷口細(xì)菌生長，與組織接觸時(shí)可發(fā)生反復(fù)的水合作用，連續(xù)吸收傷口的滲出物，同時(shí)也可提供傷口冷卻及鎮(zhèn)靜效果，因此其受到了研宄者廣泛地關(guān)注，尤其是膠原類水凝膠因其本身優(yōu)良的生物相容性、誘導(dǎo)細(xì)胞增殖能力等被大量應(yīng)用于創(chuàng)傷敷料、止血材料、組織工程支架材料等。Christophe Helary等針對(duì)目前膠原水凝膠容易收縮和機(jī)械性能較差等問題，試圖通過增加膠原濃度來改善其性能，其使用濃縮膠原制備了膠原水凝膠，一定程度上增強(qiáng)了材料的凝膠強(qiáng)度、力學(xué)性能，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，濃縮膠原水凝膠可至少存在體內(nèi)30天，能夠促進(jìn)細(xì)胞迀移、新血管形成，并無嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，可作為真皮替代物進(jìn)行了研宄(Christophe H., Isabelle B.,Aicha A., et al.Concentrated collagen hydrogels as dermal substitutes [J].B1materials, 2010, 31: 481 - 490)。日本清水慶彥等也公開了一種膠原水凝膠，其先將膠原與一定比例的聚谷氨酸充分混合，攪拌均勻后，向混合溶液直接加入一定體積的水溶性碳化二亞胺水溶液，經(jīng)5-120S后制備成為膠原水凝膠，該水凝膠具有成膠速度快、黏結(jié)力好、生物相容性良好等特點(diǎn)，可應(yīng)用于生物體膠黏劑、止血材料等非成型性醫(yī)用材料(清水慶彥，滝本行延.膠原凝膠.專利申請(qǐng)?zhí)?98805532.5)。國內(nèi)吳霞、但衛(wèi)華等也通過反復(fù)凍融法成功制備了膠原-PVA復(fù)合水凝膠，經(jīng)研宄，材料降解性能良好，細(xì)胞毒性為O?I級(jí)，是一種優(yōu)良的體表創(chuàng)傷敷料(吳霞，但年華，林海，胡楊，但衛(wèi)華.膠原-PVA復(fù)合水凝膠的制備[J].生物醫(yī)學(xué)工程與臨床，2012，16 (4): 309-313)。
[0004]然而，目前看來，膠原水凝膠仍存在以下問題:
(1)黏性較差，大多需外層敷料固定使用，機(jī)械強(qiáng)度、凝膠強(qiáng)度也有待改善；
(2)膠原本身具備一定凝膠特性，但常規(guī)條件下遠(yuǎn)不能快速成為凝膠，大多需對(duì)其進(jìn)行交聯(lián)改性以增強(qiáng)材料的凝膠性能，但目前還未見膠原的良生物型交聯(lián)劑，多會(huì)對(duì)膠原生物活性產(chǎn)生影響； (3)常規(guī)反復(fù)凍融法制備膠原水凝膠，制備周期長、材料脆硬，極大程度地限制了材料的應(yīng)用。
[0005]綜上所述，本發(fā)明為了解決上述膠原水凝膠存在的問題，首先將膠原在中性條件下通過分子自組裝形成再生膠原纖維，接著使用谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶修飾再生膠原纖維溶液，使其分子鏈中脯氨酸大量轉(zhuǎn)化為羥脯氨酸，在不引入任何交聯(lián)劑的前提下，充分提高膠原本身的凝膠特性，再加入溫敏型凝膠泊洛沙姆407，該材料在常溫和低溫狀態(tài)下為液態(tài)，當(dāng)其被注入血管后，環(huán)境溫度轉(zhuǎn)變?yōu)?7°C左右時(shí)，其會(huì)迅速形成凝膠成為凝膠塞，從而阻止血液流動(dòng)，但泊洛沙姆407并不具有生理性止血活性，只是通過物理堵塞止血，再生膠原纖維的加入既可調(diào)節(jié)泊洛沙姆407的相變溫度，也可改變凝膠的電荷，使之更易形成凝膠塞，材料在體內(nèi)滯留時(shí)間更長，為手術(shù)的順利進(jìn)行提供更好的時(shí)間保障，又可充分發(fā)揮再生膠原纖維的生理性止血活性，加強(qiáng)止血效果?？梢?，本發(fā)明所述的膠原凝膠，完全摒棄了常規(guī)反復(fù)凍融法制備凝膠，在不引入任何交聯(lián)劑的條件下，充分利用膠原和泊洛沙姆407的強(qiáng)凝膠性能，最終制備成凝膠時(shí)間極短的膠原水凝膠。最終還加入了聚乙烯吡咯烷酮以提高水凝膠的親水性，加入止血藥物以進(jìn)一步提高材料的止血性能，是一種理想的膠原止血水凝膠材料。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足而提供的一種溫敏型膠原基復(fù)合止血凝膠。該水凝膠材料既具有優(yōu)良的生理性止血活性和溫敏性能，低溫或常溫為液態(tài)，37°C左右為凝膠態(tài)，又具備良好的生物降解性能和生物相容性等優(yōu)良性能，能夠快速有效止血、抗菌、保持創(chuàng)口濕潤、促進(jìn)創(chuàng)面愈合和修復(fù)，是理想的膠原止血水凝膠材料。
[0007]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
(1)羥化再生膠原纖維溶液的制備:取I?5重量份的I型膠原，4?10°C下攪拌將其溶解于100?500體積份的1mM鹽酸溶液中，待膠原完全溶解后，緩慢加入與鹽酸溶液同等體積的含有30?50mM Tris, 0.1?0.2M NaCl組成的pH值為8.0的Tris-NaCl緩沖液，4-10°C下充分?jǐn)嚢杈鶆?，制得再生膠原纖維緩沖原液；接著將上述再生緩沖原液靜置于25?37°C的恒溫培養(yǎng)箱中，培育0.5?5h，制得再生膠原纖維溶液；最后將濃度為50U/g?150U/g谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶加入到上述再生膠原纖維溶液中，4?10°C下充分?jǐn)嚢?0?24h，制備得到羥化再生膠原纖維溶液；
(2)溫敏型膠原基復(fù)合止血凝膠的制備:將0.5?5重量份的泊洛沙姆407和0.5?5重量份的聚乙烯吡咯烷酮加入到上述羥化再生膠原纖維溶液中，4?10°C下充分?jǐn)嚢??12h ;接著向上述混合液中加入0.5?2重量份的止血藥物，4?10°C下充分?jǐn)嚢?.5?2h，分裝入模具中，劑量為6?30KGy/h6°Co所產(chǎn)生的γ射線消毒滅菌，成型包裝，即為成品，產(chǎn)品低溫保存待用。
[0008]在上述的制備方法中，步驟(I)中的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶為市售，泰興市一鳴生物制品有限公司購買；步驟(2)中泊洛沙姆407為市售，武漢市合中生化制造有限公司購買；步驟(2)所得溫敏型膠原基復(fù)合止血凝膠的凝膠時(shí)間與膠原和泊洛沙姆407的配比直接相關(guān)，產(chǎn)品為液態(tài)，37°C左右可快速形成固體凝膠。
[0009]溫敏型膠原基復(fù)合止血凝膠的關(guān)鍵性能應(yīng)符合以下要求: 外觀:凝膠狀，表面光滑，無肉眼可見之雜質(zhì)；
水分含量:^Ξ 10% (wt)；
凝膠強(qiáng)度:100?500g/cm2;
重金屬含量:< 10 μ g/g(m/m)；
細(xì)胞毒性:細(xì)胞毒性反應(yīng)不大于I級(jí)；
無菌試驗(yàn):無菌；
致敏試驗(yàn):無遲發(fā)性超敏反應(yīng)；
皮內(nèi)反應(yīng)試驗(yàn):原發(fā)性刺激指數(shù)ΡΙΚ0.4 ；
凝膠時(shí)間:5?20s ;
止血時(shí)間:10?60s。
[0010]本技術(shù)與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點(diǎn):
(1)在不引入任何交聯(lián)劑的前提下，采用生化的方法充分提高膠原本身的凝膠特性，將膠原成纖維后制備成為再生膠原纖維，再生膠原纖維的凝膠性能明顯優(yōu)于膠原，使用谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶修飾再生膠原纖維溶液，使其羥基化，更加強(qiáng)了膠原本身的凝膠性能；
(2)充分利用膠原和溫敏型凝膠