益生菌雙層微膠囊及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及益生菌雙層微膠囊及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 目前，各種益生菌的保健作用得到普遍認(rèn)可。在治療腹瀉等胃腸道疾病中，益生菌 制劑廣泛使用，起到了重要的輔助治療作用。據(jù)實(shí)際應(yīng)用顯示，該種制劑對(duì)儲(chǔ)存環(huán)境有嚴(yán)格 要求，尤其是需密封冷藏，使用者一旦忽視所述的儲(chǔ)存條件，容易使藥品失效。研究顯示，益 生菌對(duì)氧氣極為敏感，對(duì)上消化道內(nèi)的低PH(如胃酸等）的抵抗力較差，因此長(zhǎng)時(shí)間不良方 式貯存，再經(jīng)過(guò)口服后，能以活性狀態(tài)定植腸道的菌數(shù)量不多，其產(chǎn)品也存在著保存性差、 隨保存時(shí)間延長(zhǎng)活菌數(shù)急劇下降等缺點(diǎn)，使益生菌的有效應(yīng)用受到了極大的限制。
[0003] 微膠囊是利用天然或合成的高分子材料（統(tǒng)稱囊材），將囊心物包埋成微小致密 的囊。常用的微膠囊壁材主要有海藻酸鹽等碳水化合物類物質(zhì)。微膠囊包埋技術(shù)可顯著提 高益生菌耐氧和抗胃酸能力，使其以活性狀態(tài)到達(dá)腸道，進(jìn)而發(fā)揮相應(yīng)的功效。研究顯示， 即使是以傳統(tǒng)海藻酸鈉單層膠囊包埋益生菌，因其微觀的eggbox結(jié)構(gòu)儲(chǔ)有大量水，卻無(wú)法 防止水分蒸發(fā)，因此，仍存在易過(guò)度失水導(dǎo)致長(zhǎng)時(shí)間貯藏后變形干硬、隨保存時(shí)間延長(zhǎng)活菌 數(shù)下降的缺點(diǎn)，等等。
[0004] 本申請(qǐng)的發(fā)明人擬提供益生菌雙層微膠囊及其制備方法，使產(chǎn)生較好的耐酸性與 腸溶性，且比傳統(tǒng)單層囊具有更好的貯存穩(wěn)定性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目地是提供一種益生菌雙層微膠囊。
[0006] 本發(fā)明的進(jìn)一步目地是提供益生菌雙層微膠囊的制備方法。
[0007] 本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷進(jìn)行了改進(jìn)，鑒于大多數(shù)益生菌對(duì)O2及上消化道 內(nèi)低PH較為敏感，為提高益生菌對(duì)外界不良環(huán)境的耐受程度，并改善傳統(tǒng)單層囊易失水導(dǎo) 致菌體死亡的問(wèn)題，本發(fā)明對(duì)傳統(tǒng)單層膠囊包埋益生菌增加第二層膜防止失水，制得益生 菌雙層微膠囊。
[0008] 本發(fā)明采用高壓均質(zhì)乳化法，以雙歧桿菌為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，先用海藻酸鈉與氯化鈣交 聯(lián)包裹形成耐酸的保護(hù)層，再用殼聚糖與氯化鈣交聯(lián)形成防失水的雙層微膠囊；結(jié)果表明， 制得的雙層微膠囊具有較好的耐酸性與腸溶性，比傳統(tǒng)單層囊具有更好的貯存穩(wěn)定性。
[0009] 本發(fā)明的益生菌雙層微膠囊，益生菌雙層微膠囊，包括活性成分和膠囊壁，其特征 在于，所述的膠囊壁包括保護(hù)層和防失水層，所述的保護(hù)層是采用海藻酸鈉與氯化鈣交聯(lián) 包裹形成耐酸的保護(hù)層，所述的防失水層是采用殼聚糖與氯化鈣交聯(lián)形成防失水層。
[0010] 本發(fā)明采用高壓均質(zhì)乳化法，以海藻酸鈉、殼聚糖為囊材與氯化鈣交聯(lián)成雙層膜， 以雙歧桿菌為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，設(shè)計(jì)L9(34)正交實(shí)驗(yàn)，制得最佳雙層型微膠囊。
[0011] 更具體的，本發(fā)明提供了制備益生菌雙層微膠囊的方法，其特征在于，其包括步 驟：
[0012] 1，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)確定各因素的水平范圍，
[0013] 2,再通過(guò)L9 (34)正交實(shí)驗(yàn)，篩選最佳雙層型微膠囊；
[0014] 3,得到最佳配方后進(jìn)行性質(zhì)綜合實(shí)驗(yàn)，包括模擬耐胃酸、腸溶、貯藏實(shí)驗(yàn)，并進(jìn)行 對(duì)照，證實(shí)其性質(zhì)。
[0015] 本發(fā)明中，采用菌粉與壁材原料混合，加去離子水，以200Bar高壓均質(zhì)乳化 lOmin。所得乳液快速滴入CaCl2溶液（固化液）靜置固化20min。收集洗滌膠囊后植入殼 聚糖與CaCl2溶液成膜20min，再次收集洗滌即得雙層型微膠囊微膠囊；
[0016] 其中，微膠囊包埋產(chǎn)率的測(cè)定：包埋產(chǎn)率=微膠囊菌數(shù)/加入菌數(shù)X100% ;
[0017] 微膠囊菌數(shù)測(cè)定：將微膠囊溶于2.OMol/L磷酸鹽緩沖液（pH=7. 0)的破壁液中，待 完全溶解后計(jì)數(shù)。
[0018] 本發(fā)明中，進(jìn)行了微膠囊制備的單因素實(shí)驗(yàn)：
[0019] 實(shí)驗(yàn)通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)測(cè)定不同海藻酸鈉濃度（I. 5%、2. 5%、3. 5%)XaCl2:濃度（1%、 2%、3%)、乳糖濃度（4%、5%、6%)、殼聚糖濃度（0.1%、0.2%、0.3%)對(duì)微膠囊包埋產(chǎn)率的影響， 以確定正交實(shí)驗(yàn)水平范圍。
[0020] 本發(fā)明中，進(jìn)行了微膠囊制備的正交實(shí)驗(yàn)：
[0021] 在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，根據(jù)上述單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)部分因素的水平進(jìn)行調(diào) 整，采用L9(34)正交試驗(yàn)，以微膠囊的包埋產(chǎn)率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，選擇最佳配比。因素水平如表 1所示。
[0022] 表1:因素水平表
[0023]
[0024] 本發(fā)明中，進(jìn)行了雙層微膠囊性質(zhì)的綜合實(shí)驗(yàn)：
[0025] 在正交實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，篩選出的最佳配比微膠囊進(jìn)行性質(zhì)研究，為保證實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)準(zhǔn) 確，實(shí)驗(yàn)均在無(wú)菌環(huán)境下操作進(jìn)行；
[0026] (1)雙層囊的鏡下觀察：取微膠囊置于載玻片，鏡下觀察并拍照。
[0027] (2)雙層囊的耐酸性能：取微膠囊置于盛有模擬胃液中pHl. 2,37°C條件下180r/ min振蕩lh，每20min取樣稱量溶解質(zhì)量計(jì)算解囊率，并計(jì)算菌體存活率；Ih后人工解囊活 菌計(jì)數(shù)，并以普通菌液作空白對(duì)照；
[0028] 解囊率=現(xiàn)有質(zhì)量/原有質(zhì)量X100% ;
[0029] 活菌率=解囊后活菌數(shù)/包埋前活菌數(shù)X100%。
[0030] (3.)雙層囊的腸溶性能：取微膠囊置于模擬腸液中pH8. 0,在搖床上37°C、180r/ min進(jìn)行崩解，每20min取樣稱量溶解質(zhì)量計(jì)算解囊率，人工解囊后活菌計(jì)數(shù)，計(jì)算活菌率。
[0031] (4)單雙層囊貯藏對(duì)照實(shí)驗(yàn)：取微膠囊置入玻璃瓶中，敞開(kāi)式置于超凈工作臺(tái)48h 后人工解囊后活菌計(jì)數(shù)，計(jì)算活菌率。并以單層海藻酸鈉微膠囊以及普通菌液作空白對(duì)照。
[0032] 結(jié)果顯示，本發(fā)明針對(duì)傳統(tǒng)的單層囊易失水導(dǎo)致膠囊變形、菌體死亡的問(wèn)題，在單 層囊基礎(chǔ)之上增加殼聚糖膜防止失水制成雙層囊能提高益生菌的穩(wěn)定性。采用高壓均質(zhì) 乳化法，在海藻酸鈉濃度為3%，氯化鈣濃度為4%，乳糖濃度為3%時(shí)，殼聚糖濃度為0. 2%的 條件下，包埋產(chǎn)率最高，達(dá)到91. 2%，活菌率達(dá)89. 7%，所得雙層囊具有良好的耐酸性及腸溶 性，在模擬37°C胃酸中處理Ih后活菌率仍達(dá)78. 3%，在腸液中20min內(nèi)釋放完畢，保證了益 生菌以活性狀態(tài)定植腸道。
[0033] 本發(fā)明制得的雙層囊與單層囊貯存對(duì)照實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，具有良好的貯藏性能，雙 層囊在48h及15d的活菌率分別達(dá)到84. 6%和79. 6%，而單層囊僅有76. 2%和59. 7%，無(wú)包 埋組幾乎為0。相對(duì)于傳統(tǒng)的單層海藻酸鈉微膠囊，本發(fā)明的雙層囊有著顯著的防失水能 力，能克服因保存時(shí)間延長(zhǎng)菌體存活率下降的缺點(diǎn)，突破了這個(gè)應(yīng)用限制。本方法制得的微 膠囊采用的原料是食品行業(yè)普遍使用的原料，無(wú)生物毒性。本實(shí)驗(yàn)方法操作簡(jiǎn)單，原料成本 低，能明顯提高了菌體存活率，性價(jià)比較高。
[0034] 說(shuō)明書(shū)附圖
[0035] 圖1 :海藻酸鈉濃度對(duì)包埋率的影響。
[0036] 圖2 :殼聚糖濃度對(duì)包埋率的影響。
[0037] 圖3 :CaCl2濃度對(duì)包埋率的影響。
[0038] 圖4 :乳糖濃度對(duì)包埋率的影響。
[0039] 圖5 :雙層微膠囊外觀。
[0040] 圖6 :在胃液中的耐酸情況。
[0041] 圖7:菌體耐酸對(duì)照。
[0042] 圖8:48h后的單層囊。
[0043] 圖9 :48h后的雙層囊。
【具體實(shí)施方式】
[0044] 本實(shí)施例中，采用的主要試劑：海藻酸鈉（化學(xué)純）、無(wú)水氯化鈣（分析純）、市售 光明牌脫脂奶粉、乳糖（分析純）、殼聚糖（化學(xué)純）、胰酶、胃酶。以上試劑均為國(guó)產(chǎn)；
[0045] 主要儀器：PanDalOOO+高壓均質(zhì)機(jī)、T0MYSX-700高壓蒸汽滅菌鍋、上凈CA920超凈 工作臺(tái)、培英THZ-C恒溫振蕩器、0LYMPUSBX61、SZX12顯微鏡；
[0046] 主要溶液：
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