實施方案中，在塑模內(nèi)基質(zhì)與細胞被采用(類似于用于水泥的鋼筋)和/或在塑模插入之前基質(zhì)與成纖維細胞可以被利用。
[0030]在本發(fā)明的某些方面中，在具有特定條件的室內(nèi)，生成軟骨細胞，和產(chǎn)生軟骨。所述室可以調(diào)節(jié)一種或多種以下參數(shù):例如，溫度，介質(zhì)pH，氣體交換，機械刺激，p02, PCO2，濕度，和營養(yǎng)物質(zhì)擴散。在特定的實施方案中，灌注系統(tǒng)可在室中，以提供不變的營養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)和有效的去除廢產(chǎn)物。例如，可能提供了一種或多種機械應(yīng)力的組合，如以間歇性的基礎(chǔ)，包括細胞和組織變形，壓縮和剪切力，流體流動，和在流體靜力壓的變化。在某些方面，這些條件可以在室內(nèi)產(chǎn)生。
[0031]1.本發(fā)明利用的細胞
[0032]在本發(fā)明的某些實施方案中，可以使用任何細胞，只要細胞能夠分化為軟骨細胞或軟骨細胞樣細胞。然而，在【具體實施方式】中，例如，細胞是成纖維細胞，如皮膚成纖維細胞，肌腱成纖維細胞，韌帶成纖維細胞或滑膜成纖維細胞。自體細胞可以被利用，雖然在替代實施方案中，同種異體細胞被利用；在【具體實施方式】中，同種異體細胞已針對疾病被檢測，被認為適合人類傳播。在本發(fā)明的某些方面，細胞或多種細胞是自體的，雖然在替代實施方案中，細胞是同種異體的。在細胞不是自體的情況下，在本發(fā)明中使用之前，細胞可以通過本技術(shù)領(lǐng)域標準方法處理以消除潛在的有害物質(zhì)，病原體，等。
[0033]用于利用自體HDFs作為細胞源的手段的理論如下:1)例如HDFs可以是非侵入性地從打孔活組織檢查獲得，小至3.0mm直徑的圓形皮膚標本；2)來自另一個供體污染的風險(如乙型肝炎病毒，人類免疫缺陷病毒，克雅氏病，等)是不存在的。；3)在特定培養(yǎng)條件下HDFs可以在培養(yǎng)物中容易地擴增，并且分化成軟骨細胞樣細胞。例如，其他的成纖維細胞群體可以被使用，如肌腱或韌帶成纖維細胞。在一個實施方案中，自體成纖維細胞是優(yōu)選的。本發(fā)明的某些方面可以使用商業(yè)購買的HDFs，如從實驗室(如級聯(lián)的生物制劑(Cascade B1logies))商業(yè)購買的HDFs。細胞可以是成人HDFs或新生兒HDFs。例如，新生兒包皮成纖維細胞是一種非常方便的細胞來源。這些細胞在商業(yè)上被使用，都是容易獲得的，并且容易生長。
[0034]根據(jù)本發(fā)明，從個體的皮膚組織打孔活組織檢查出毫米)收獲自體的HDFs。在實驗室，采用剪刀分割開皮下的脂肪和深真皮。剩余組織可以被切碎，和在0.25%胰蛋白酶中在4°C孵育過夜。然后，真皮的和表皮的片段可以是分離的，例如機械地分離。所述活組織檢查的所述真皮的片段可以被切碎，并且所得碎片可以被使用以啟動外植體培養(yǎng)。從外植體收獲的成纖維細胞可以是在37°C在8%的二氧化碳中生長在含有10%小牛血清的達爾伯克MEM(Dulbecco’s MEM) (DMEM)中。在特定方面，這些細胞可被擴增，之后分化為軟骨細胞。
[0035]在特定方面，軟骨細胞樣分化可應(yīng)用機械應(yīng)變力促進人皮膚的成纖維細胞的。在所述發(fā)明的特定實施方案，在從成纖維細胞分化之后，所得體內(nèi)細胞包括一定的生化標志物的表達，其指示I型和II型膠原蛋白和蛋白聚糖。
[0036]在特別方面，人類皮膚成纖維細胞的軟骨細胞樣分化可能發(fā)生在體內(nèi)，其中所述椎間盤的微環(huán)境有助于的軟骨細胞分化。在特定實施方案中，在所述盤中流體靜力學的負載，缺氧，細胞與細胞和殘留的軟骨細胞的相互作用和在椎間盤中的其他生化環(huán)境可以促進從成纖維細胞分化為軟骨細胞。在發(fā)明特定的實施方案，在細胞移植之后，所述椎間盤細胞中的細胞將是纖維細胞和軟骨細胞的組合，其產(chǎn)生纖維的和軟骨的組織，伴有I型和II型膠原和/或諸多蛋白聚糖的生化標志物，它們被發(fā)現(xiàn)在軟骨的和纖維的組織中。
[0037]I1.所述發(fā)明的示例性方法的實施方案，包括修復(fù)損傷的軟骨的方法
[0038]在所述發(fā)明的實施方案，存在分化細胞的方法，包括成纖維細胞(例如，人)分化為離體軟骨細胞樣細胞。方法可以包括為個體遞送成纖維細胞入塑模以產(chǎn)生期望的軟骨形狀的步驟。成纖維細胞可以被暴露于缺氧條件和/或機械應(yīng)變，之后離體產(chǎn)生軟骨和體內(nèi)遞送。
[0039]機械應(yīng)力/應(yīng)變是軟骨形成的重要因素。本方法使用機械應(yīng)變。在一些實施方案中，該方法是在其他類型的壓力存在下，包括間歇流體靜力壓，剪切流體應(yīng)力，等等。在一些實施方案中，該方法是在存在或不存在低的氧張力，生長因子，在基質(zhì)中培養(yǎng)，等等的情況下發(fā)生。
[0040]成纖維細胞可從供體來源(同種異體)或自體皮膚活組織檢查獲得?？梢员皇褂玫氖?，從皮膚分離細胞和在培養(yǎng)物中擴增它們，和在某些情況下，細胞不受操縱或最低限度操作(例如，暴露于血清，抗生素，等)。
[0041]在本發(fā)明的具體方面，細胞被誘導(dǎo)以分化成軟骨細胞或軟骨細胞樣細胞。這種分化發(fā)生在體內(nèi)的遞送之前。在本發(fā)明的具體實施方案中，機械應(yīng)力，低氧，或其他條件刺激HDFs的軟骨形成分化。
[0042]在本發(fā)明的一些方法中，在獲得成纖維細胞之后，可以擴增一定量的細胞，雖然在其他實施方案中，在沒有任何先前擴增的情況下，成纖維細胞被用于軟骨生成。技術(shù)人員認識到，在培養(yǎng)物中的細胞需要營養(yǎng)，和可以將介質(zhì)，如FBS(胎牛血清)提供給細胞。在某些情況下，可以防止污染或感染(例如，通過添加抗生素)。在產(chǎn)生軟骨細胞之前，例如，可以用DMEM培養(yǎng)基洗滌細胞以去除FBS和抗生素，并且細胞可用于產(chǎn)生軟骨。例如，懸浮液可能含有少量的介質(zhì)，其包括緩沖液，氨基酸，鹽，葡萄糖和/或維生素。成纖維細胞的體外生長可以包括至少一天或多天的生長，之后離體使用以用于軟骨生成。在某些情況下，細胞可以被檢測或監(jiān)測，以確保至少有一些細胞分裂。不分裂的細胞可能會被移除。
[0043]在本發(fā)明的實施方案中，例如從接受治療的個體中獲得成纖維細胞，從另一個個體(例如，包括尸體或活供體)得到成纖維細胞，或從商業(yè)上得到成纖維細胞。可以進行皮膚活組織檢查，在一些實施方案中可以操縱皮膚活組織檢查。例如，可以消化皮膚組織過夜以獲得成纖維細胞，培養(yǎng)細胞以擴增，并將它們提供至系統(tǒng)以產(chǎn)生軟骨。在遞送至個體之前，細胞可傳代一次或更多次，這取決于所需的細胞數(shù)，例如，包括1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，或更多次。傳代可以在一天或多天的過程中出現(xiàn)，例如，所述過程包括2，3，4，5，6，7，8，9，或10天，或1，2，3，4，或更多周。在一些實施方案中，例如，細胞傳代5-7天。
[0044]II1.支持實施方案
[0045]在某些情況下，與軟骨的一種或多種支持體結(jié)合的通過本發(fā)明的方法產(chǎn)生的軟骨在體內(nèi)提供至個體。支持體是可生物降解或不可生物降解的和/或可吸收或不可吸收的，這取決于需要。在支持體是可吸收的情況下，支持體材料可以是本技術(shù)領(lǐng)域中的任何材料，包括生物聚合物。可吸收聚合物的例子是，丙交酯基聚合物，其包括合成聚酯，如聚丙交酯及乙交酯與ε-己內(nèi)酯的共聚物。在支持體是非吸收性的情況下，支持體材料可以是本