負(fù)載神經(jīng)生長因子的絲蛋白納米纖維支架及制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種高取向納米纖維支架及其制備方法，特別涉及一種以負(fù)載神經(jīng)生長因子的絲蛋白為原料，制備的具有高取向、能誘導(dǎo)神經(jīng)元細(xì)胞生長的、且具有優(yōu)異力學(xué)性能的納米纖維支架及其制備方法，屬于復(fù)合材料領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]神經(jīng)再生問題是神經(jīng)科學(xué)界和醫(yī)學(xué)界在理論研宄和臨床實(shí)踐上感到十分困惑且尚未找到有效解決辦法的重大難題。目前，采用組織工程學(xué)的基本原理和方法，根據(jù)神經(jīng)再生的生物學(xué)特性，以具有良好生物相容性的載體物質(zhì)作為神經(jīng)導(dǎo)管修復(fù)周圍神經(jīng)損傷是取代傳統(tǒng)自體腓腸神經(jīng)、表皮神經(jīng)和前臂內(nèi)側(cè)皮神經(jīng)等異體移植修復(fù)的重要選擇。在構(gòu)建組織工程神經(jīng)導(dǎo)管時(shí)必須提供具有特定三維的管狀支架，作為神經(jīng)元細(xì)胞種植的基質(zhì)材料，使接種細(xì)胞能定位、粘附、局域化生長增殖，同時(shí)材料可使細(xì)胞在支架空間分布排列有序，分化具有特定功能并合成適當(dāng)?shù)募?xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrixc, ECM)，再者組織工程神經(jīng)導(dǎo)管支架移植機(jī)體內(nèi)時(shí)，支架材料還應(yīng)兼有力學(xué)支持等功能。
[0003]蠶絲在我國產(chǎn)量非常豐富，主要成分是蠶絲蛋白(Silk Fibroin)。蠶絲經(jīng)過脫膠、溶解、提純制得的再生絲素蛋白具有良好的生物降解性和生物相容性，并且無毒、無刺激，易于加工成各種形態(tài)，如膜、纖維、凝膠、三維海綿支架等。因此，運(yùn)用絲素蛋白作為組織工程支架材料已成為近年來的研宄熱點(diǎn)。例如，中國專利201310063606.5公開了一種以蠶絲為原料制備具有良好力學(xué)性能的絲素蛋白管狀材料以及制備方法。制備的絲素蛋白管的強(qiáng)度可有效滿足臨床實(shí)際縫合要求，可以應(yīng)用于血管、神經(jīng)導(dǎo)管、瘺管以及其他相關(guān)醫(yī)療領(lǐng)域。但蠶絲蛋白也有其內(nèi)在的缺陷，如絲蛋白的強(qiáng)力較小、易脆，且其對細(xì)胞缺乏識別和誘導(dǎo)作用。
[0004]靜電紡絲技術(shù)是制備三維管狀纖維材料比較簡單的方法。但作為神經(jīng)修復(fù)材料，必須能定向生長神經(jīng)元細(xì)胞，因此，通常要求支架材料具有取向結(jié)構(gòu)。但傳統(tǒng)上，靜電紡絲通常采用滾輪裝置收集三維管狀納米纖維材料，制備的三維管道無論在宏觀結(jié)構(gòu)還是在纖維取向的微觀形貌控制方面都具有很大的局限性，大大限制了電紡絲管狀納米纖維材料的應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種具有由高取向納米纖維構(gòu)成的、能誘導(dǎo)神經(jīng)元細(xì)胞生長的、且具有優(yōu)異力學(xué)性能的高性能神經(jīng)導(dǎo)管納米纖維支架材料。
[0006]本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種上述納米纖維支架的制備方法。
[0007]本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是:
一種負(fù)載神經(jīng)生長因子的絲蛋白高取向納米纖維支架，其特征在于:它以絲素蛋白為基材，以神經(jīng)生長因子作為誘導(dǎo)神經(jīng)元細(xì)胞生長的功能性材料。
[0008]本發(fā)明所述的一種負(fù)載神經(jīng)生長因子的絲蛋白高取向納米纖維支架的制備方法，包括以下步驟:絲蛋白溶液體系制備；神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)；絲蛋白與神經(jīng)生長因子以及神經(jīng)元細(xì)胞的共混紡絲體系制備；負(fù)載神經(jīng)生長因子的絲蛋白高取向納米纖維神經(jīng)導(dǎo)管支架制備。
[0009]上述絲蛋白溶液體系制備，其特征在于將纖維狀絲素蛋白加入一定質(zhì)量分?jǐn)?shù)的溴化鋰(LiBr)溶液中，溶解一段時(shí)間后過濾。將濾液裝入透析袋中，置于裝有一定體積的去離子水中進(jìn)行透析，透析一段時(shí)間后獲得低濃度的純絲素溶液。將裝有低濃度純絲素溶液的透析袋，在室溫條件下，用氣流促進(jìn)水分蒸發(fā)，獲得濃度較高的純絲素溶液，將絲素溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)調(diào)節(jié)為一定的數(shù)值。將絲素蛋白溶液置于燒杯中，用保鮮膜封口，室溫下放置一段時(shí)間形成絲蛋白溶液體系。
[0010]上述神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)，其特征在于用含10%小牛血清、2mmol/L L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素和100 μ g /ml鏈霉素的RPMI1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)神經(jīng)元細(xì)胞，并置于5%CO2、飽和濕度、37°C培養(yǎng)箱內(nèi)，2?3天換液一次。神經(jīng)元細(xì)胞處于對數(shù)生長期，且存活細(xì)胞百分率均在95 %以上(臺盼藍(lán)拒染法)。
[0011]上述絲蛋白與神經(jīng)生長因子以及神經(jīng)元細(xì)胞的共混紡絲體系制備，其特征在于將上述制備的絲蛋白溶液與培養(yǎng)后的神經(jīng)元細(xì)胞以及神經(jīng)生長因子以一定的共混比例共混后置于燒杯中，用保鮮膜封口，室溫下放置一段時(shí)間形成絲蛋白共混紡絲體系。
[0012]上述負(fù)載神經(jīng)生長因子的絲蛋白高取向納米纖維神經(jīng)導(dǎo)管支架制備，其特征在于利用靜電紡絲技術(shù)，利用不同管徑的高速旋轉(zhuǎn)滾軸為收集裝置，通過特殊設(shè)計(jì)的“同相紡絲控制器”獲得高取向絲素基納米纖維神經(jīng)導(dǎo)管。
[0013]本發(fā)明的有益效果在于:
1.以絲素蛋白為基材，以神經(jīng)生長因子作為誘導(dǎo)神經(jīng)元細(xì)胞生長的功能性材料，利用靜電紡絲技術(shù)，通過特殊設(shè)計(jì)的同相紡絲控制器獲得高取向絲素基納米纖維，制備出具有優(yōu)良性能的絲素基納米纖維支架人工神經(jīng)移植物，相對于傳統(tǒng)的納米制備技術(shù)(冷凍干燥、氣體發(fā)泡、自組裝等)具有效率高、工序簡單、費(fèi)用低廉等優(yōu)點(diǎn)，且具有傳統(tǒng)納米技術(shù)很難實(shí)現(xiàn)的結(jié)構(gòu)上與性能上的可控性，且成型效果較好。
[0014]2.本發(fā)明一次性的通過共混紡絲技術(shù)將生物材料與細(xì)胞的復(fù)合體系直接紡成支架材料與細(xì)胞的復(fù)合體，相對于傳統(tǒng)的先制備支架材料，再在支架材料上進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，工序簡單。
【具體實(shí)施方式】
[0016]下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳述。
[0017]實(shí)施例1:
1.將80g蠶絲放入100ml濃度為0.05%的碳酸鈉水溶液中，升溫至100°C，煮沸30min，
重復(fù)煮3次以脫去蠶絲表面絲膠，將絲素?fù)瞥鲇谜麴s水沖洗干凈，將其平鋪于不銹鋼盤中成薄薄層狀，置于室溫下12h以上，得到干燥絲素。
[0018]2.將干燥絲素以1: 10的浴比分批加入濃度為45?60%的溴化鋰(LiBr)溶液中，置于76 ± 2°C的水浴鍋內(nèi)恒溫?cái)嚢?h以上，直至完全溶解。
[0019]3.將步驟2制得的絲素蛋白溶液倒入NWCO為3.5KDA的透析袋中，用去離子水透析72h，前24h換水7?8次，中間24h換水換水7?8次，最后24h換水5~6次，除去溶液中的溴化鋰(LiBr)小分子，用多層紗布過濾后制得濃度為4~5%的低濃度的純絲素蛋白溶液，用保鮮膜封口，室溫下放置一段時(shí)間形成絲蛋白溶液體系。
[0020]4.將步驟3制備的絲蛋白溶液用_20°C液氮冷凍至冰狀固態(tài)，然后在真空(5Pa)下冷凍干燥48h，使固態(tài)絲蛋白溶液脫水干燥。
[0021]5.用含10%小牛血清、2mmol/L L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素和100 μ g /ml鏈霉素的RPMI1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)神經(jīng)元細(xì)胞，并置于5% CO2、飽和濕度、37°C培養(yǎng)箱內(nèi)，2?3天換液一次。神經(jīng)元細(xì)胞處于對數(shù)生長期，且存活細(xì)胞百分率均在95%以上(臺盼藍(lán)拒染法)。
[0022]6.將步驟4制備的干燥絲蛋白與步驟5制備的培養(yǎng)后的神經(jīng)元細(xì)胞以及神經(jīng)生長因子(NGF)以質(zhì)量比為1:1.6:0.3的共混比例共混后，按30%濃度加入去離子水中室溫?cái)嚢?h以上直至完全溶解，用保鮮膜封口，室溫下放置一段時(shí)間形成絲蛋白共混紡絲原液。
[0023]7.將步驟6制得的絲蛋白共混紡絲原液，倒入靜電紡絲注射器。將靜電發(fā)生器的陽極與注射器金屬噴嘴相接，陰極與配備同相紡絲控制器的金屬滾筒的電刷相連，調(diào)節(jié)靜電發(fā)生器的靜電壓為20kv，紡絲距離為25cm，開啟靜電發(fā)生器和注射泵，調(diào)節(jié)注射泵流量為0.3mL/h，連續(xù)靜電紡絲4h，在滾筒上收集到負(fù)載神經(jīng)生長因子的絲蛋白高取向納米纖維神經(jīng)導(dǎo)管支架。
[0024]8.將步驟10制備的高取向納米纖維神經(jīng)導(dǎo)管支架從滾筒上取下，放入150mL無水甲醇(CH4O)中真空浸漬Ih后取出，真空干燥24h，得到負(fù)載神經(jīng)生長因子的絲蛋白高取向納米纖維支架。
[0025]實(shí)施例2:
1.將10g蠶絲生絲放入1250ml濃度為0.05%的碳酸鈉水溶液中，升溫