包含雙重血管生成素-2/Dll4結(jié)合物和抗VEGF-R藥劑的藥物組合的制作方法
【專利說明】包含雙重血管生成素-2/DI 14結(jié)合物和抗VEGF-R藥劑的藥 物組合 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及包含雙重血管生成素-2/D114結(jié)合物和抗VEGF-R藥劑的藥物組合，所 述藥物組合用于治療像癌癥、眼病等的疾病。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 當(dāng)腫瘤達(dá)到大約Imm3的臨界尺寸時(shí)，腫瘤變得依賴于血管生成，用于維持以氧和 營養(yǎng)物進(jìn)行的血液供應(yīng)以允許進(jìn)一步生長。如US 2008/0014196中所概述，血管生成牽涉 于包括實(shí)體腫瘤和轉(zhuǎn)移的許多病癥的發(fā)病機(jī)理中。
[0004] 在腫瘤生長的情況下，血管生成似乎對從增生轉(zhuǎn)變到瘤形成來說至關(guān)重要，并且 對提供營養(yǎng)用于腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移來說至關(guān)重要（Folkman等，Nature339-58, 1989)，這 允許腫瘤細(xì)胞獲得相較于正常細(xì)胞的生長優(yōu)勢。因此，抗血管生成療法已變成對于一些類 型腫瘤的重要治療選擇。這些療法已集中于通過中和VEGF(阿瓦斯?。ˋvastin))或它 的受體（Sutent和索拉非尼（Sorafinib))來阻斷VEGF途徑（Ferrara等，Nat Rev Drug Discov. 2004 年 5 月；3 (5) : 391-400.)。
[0005] 如例如US2008/0014196和W02008/101985中所述，血管生成牽涉于包括實(shí)體腫瘤 和轉(zhuǎn)移以及眼部疾病的許多病癥的發(fā)病機(jī)理中。最重要的促血管生成因子之一是血管內(nèi)皮 生長因子（VEGF)，也稱為VEGF-A或血管通透性因子（VPF)。VEGF屬于包括胎盤生長因子 (PIGF)、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E 以及 VEGF-F 的基因家族。人 VEGF 的單個(gè)基因的 mRNA的選擇性剪接產(chǎn)生至少六種亞型（VEGF121、VEGF145、VEGF165、VEGF183、VEGF189以及 VEGF206)，VEGF165是最豐富的亞型。
[0006] 已鑒定出與VEGF相互作用的兩種VEGF酪氨酸激酶受體（VEGFR)，即VEGFR-I (也 稱為FIt-I)和VEGFR-2 (也稱為KDR或FIK-1)。VEGFR-I對VEGF的親和力最高，而VEGFR-2 對 VEGF 的親和力稍微較低。Ferrara (Endocrine Rev. 2004, 25:581-611)提供 VEGF 的詳 細(xì)描述，正常過程和病理過程中VEGF與它的受體的相互作用和它的功能可見于Hoeben等 Pharmacol. Rev. 2004, 56:549-580 中。
[0007] VEGF已被報(bào)道是正常血管生成和異常血管生成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)物（Ferrara和 Davis-Smyth，Endocrine Rev. 1997, 18:4-25 ;Ferrara J. Mol. Med. 1999,77:527-543)。相 較于促進(jìn)血管形成的過程的其它生長因子，VEGF在它對血管系統(tǒng)內(nèi)的內(nèi)皮細(xì)胞具有高特異 性方面是獨(dú)特的。
[0008] VEGF mRNA由大多數(shù)人腫瘤過度表達(dá)。在腫瘤生長的情況下，血管生成似乎對從 增生轉(zhuǎn)變到瘤形成來說至關(guān)重要，并且對提供營養(yǎng)用于腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移來說至關(guān)重要 (Folkman等，1989, Nature 339-58)，這允許腫瘤細(xì)胞獲得相較于正常細(xì)胞的生長優(yōu)勢。因 此，抗血管生成療法已變成對于一些類型腫瘤的重要治療選擇。這些療法已集中于阻斷 VEGF 途徑（Ferrara 等，Nat Rev Drug Discov. 2004 年 5 月；3 (5) :391-400)。
[0009] 對VEGF和它在血管生成和不同過程中的作用的解釋已提供治療性干預(yù)的潛在新 目標(biāo)。VEGF的功能受到小分子的抑制，這些小分子阻斷或防止VEGF受體酪氨酸激酶的活化 (Schlaeppi 和 Wood, 1999, Cancer Metastasis Rev.，18:473-481)，并且因此干擾 VEGF 受 體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。含有細(xì)菌或植物毒素的細(xì)胞毒性綴合物可抑制VEGF對腫瘤血管生成的 刺激作用。VEGF-DT385毒素綴合物（融合或化學(xué)綴合到VEGF165的白喉毒素結(jié)構(gòu)域）例如 有效地抑制體內(nèi)腫瘤生長。腫瘤生長抑制還可通過由逆轉(zhuǎn)錄病毒遞送Flk-I突變體或可溶 性VEGF受體來實(shí)現(xiàn)。
[0010] VEGF中和抗體，如A4. 6. 1和MV833已被開發(fā)以阻斷VEGF與它的受體結(jié)合， 并且已顯示臨床前抗腫瘤活性（Kim等Nature 1993, 362:841-844 ;Folkman Nat. Med. 1995, 1:27-31 ;Presta 等 Cancer Res. 1997, 57:4593-4599 ;Kanai 等 Int. J. Cancer 1998,77:933-936 ;Ferrara和 Alitalo Nat. Med. 1999,5:1359-1364 ;320, 340。對于治療性 抗 VEGF 方法試驗(yàn)的綜述，參見 Campochiaro 和 Hackett, Oncogene 2003, 22:6537-6548)。
[0011] 大多數(shù)臨床經(jīng)驗(yàn)已利用A4. 6. 1獲得，A4. 6. 1也稱為貝伐單抗（bevacizumab) (Avastillli ; Genentech, San Francisco, CA) 〇
[0012] 在小鼠中的近期研宄已顯示，作為Tie2受體的配體的血管生成素2 (Ang2)通過實(shí) 現(xiàn)如VEGF的其它血管生成因子的功能來控制血管重塑。Ang2主要由內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)，受缺 氧和其它血管生成因子強(qiáng)烈誘導(dǎo)，并且已被證明調(diào)節(jié)腫瘤血管可塑性，允許血管對VEGF和 FGF2作出反應(yīng)（Augustin 等，Nat Rev Mol Cell Biol. 2009年 3 月；10(3): 165-77)。與這 種作用一致，Ang2的缺失或抑制導(dǎo)致血管生成減少（Falc0n等，Am J Pathol. 2009年11月； 175 (5) : 2159-70.)。已報(bào)道患有結(jié)腸直腸癌、NSCLC和黑素瘤的患者具有升高的Ang2血清 濃度（Goede 等，Br J Cancer. 2010 年 10 月 26 日；103 (9) :1407-14 ;Park 等，Chest. 2007 年 7 月；132 (1):200-6 ;Helfrich 等，Clin Cancer Res. 2009 年 2 月 15 日；15 (4) :1384-92)。 在CRC癌癥中，Ang2血清水平與對抗VEGF療法的治療反應(yīng)相關(guān)。
[0013] Ang-Tie系統(tǒng)由2種受體（Tiel和Tie2)和3種配體（Angl、Ang2和Ang4)組成 (Augustin 等，Nat Rev Mol Cell Biol. 2009 年 3 月；10 (3) :165-77. hTie2、Angl 和 Ang2 是這個(gè)家族中研宄最詳盡的成員，Tiel是孤兒受體，并且Ang4對血管重塑的作用仍需要確 定。Ang2和Angl對Tie2結(jié)合和活化介導(dǎo)相反的功能。Ang2介導(dǎo)的Tie2活化導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì) 胞活化、周皮細(xì)胞解離、血管滲漏以及誘導(dǎo)血管萌芽。與Ang2相反，Angl信號傳導(dǎo)通過周 皮細(xì)胞的募集維持血管完整性，從而維持內(nèi)皮細(xì)胞靜止。
[0014] Ang2是Tie2受體酪氨酸激酶的分泌的66kDa配體（Augustin等，Nat Rev Mol Cell Biol. 2009年3月；10 (3) : 165-77)。Ang2由N-末端卷曲-螺旋結(jié)構(gòu)域和C-末端纖 維蛋白原樣結(jié)構(gòu)域組成，后者是Tie2相互作用所需的。Ang2主要由內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)，并且受 缺氧和包括VEGF的其它血管生成因子強(qiáng)烈誘導(dǎo)。Tie2見于內(nèi)皮細(xì)胞、造血干細(xì)胞和腫瘤細(xì) 胞上。已證明Ang2-Tie2調(diào)節(jié)腫瘤血管可塑性，允許血管對VEGF和FGF2作出反應(yīng)。
[0015] 在體外已顯示Ang2在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC)中充當(dāng)溫和的有絲分裂原 (mitogen)、化學(xué)趨化物（chemo-attractant)以及管形成的誘導(dǎo)物。Ang2誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞 中異位表達(dá)的Tie2的酪氨酸磷酸化，并且促進(jìn)下游信號傳導(dǎo)事件，如HUVEC中ERK-MAPK、 AKT和FAK的磷酸化。已描述了 Ang2在Angl誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞反應(yīng)中的拮抗作用。
[0016] 已顯示Ang2缺乏導(dǎo)致小鼠中嚴(yán)重的淋巴模式化缺陷（lymphatic patterning defect)。盡管Ang2的喪失對于胚胎血管發(fā)育來說不是必要的，但是Ang2缺陷型小鼠在視 網(wǎng)膜和腎中具有持久的血管缺陷。結(jié)合血管生成部位（例如卵巢）處的Ang2表達(dá)的動態(tài) 模式，這些發(fā)現(xiàn)表明Ang2通過實(shí)現(xiàn)如VEGF的其它血管生成因子的功能來控制血管重塑。
[0017] Ang2_Tie2系統(tǒng)在血管生成轉(zhuǎn)換和腫瘤血管生成后期階段期間發(fā)揮至關(guān)重要的作 用。Ang2表達(dá)在腫瘤相關(guān)的內(nèi)皮中強(qiáng)烈上調(diào)。已觀察到當(dāng)植入到Ang2缺陷型小鼠中，特別 是在腫瘤生長的早期階段期間植入時(shí)，腫瘤生長降低。以Ang2mAb治療性阻斷Ang2已在多 種腫瘤異種移植物模型中顯示出廣泛的功效。
[0018] Notch信號傳導(dǎo)途徑對于細(xì)胞-細(xì)胞通信是重要的，所述途徑涉及在胚胎發(fā)育期 間和在成年生物體中控制多種細(xì)胞分化過程的基因調(diào)節(jié)機(jī)制。Notch信號傳導(dǎo)在許多癌癥 中失調(diào)，例如在T細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病中和在實(shí)體腫瘤中（Sharma等2007, Cell Cycle 6 (8) : 927 - 30 ;Shih 等，Cancer Res. 2007 年 3 月 1 日；67 (5) : 1879-82) 〇
[0019] D114 (或Delta樣4或delta樣配體4)是Notch配體的Delta家族的一個(gè)成員。 D114的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域由N-末端結(jié)構(gòu)域、Delta/Serrate/Lag-2(DSL)結(jié)構(gòu)域以及一串八個(gè) 表皮生長因子（EGF)樣重復(fù)構(gòu)成?？傮w上，認(rèn)為EGF結(jié)構(gòu)域包含氨基酸殘基218-251 (EGF-1 ; 結(jié)構(gòu)域 1)、252-282 (EGF-2 ;結(jié)構(gòu)域 2)、284-322 (EGF-3 ;結(jié)構(gòu)域 3)、324-360 (EGF-4 ;結(jié)構(gòu)域 4)以及362-400 (EGF-5 ;結(jié)構(gòu)域5)，其中DSL結(jié)構(gòu)域在大致氨基酸殘基173-217處，并且 N-末端結(jié)構(gòu)域在hDl 14的大致氨基酸殘基27-172處（W0 2008/076379)。
[0020] 已報(bào)道，D114通過血管內(nèi)皮，尤其在動脈內(nèi)皮中展現(xiàn)高選擇性表達(dá)（Shutter等 (2000)Genes Develop. 14:1313-1318)。在小鼠中的近期研宄已顯示，D114受VEGF誘導(dǎo)并 且是限制血管萌芽和分枝的負(fù)反饋調(diào)節(jié)物。與這種作用一致，D114的缺失或抑制導(dǎo)致過 度血管生成（Scehnet等，Blood. 2007年6月1日；109 (11) :4753-60)。這種不受限制的 血管生成由于非生產(chǎn)性血管系統(tǒng)的形成而反常地減緩腫瘤生長，即使在對抗VEGF療法具 有抗性的腫瘤中也是如此（Thurston 等，Nat Rev Cancer. 2007 年 5 月；7 (5) :327-31 ;W0 2007/070671 ;Noguera-Troise 等，Nature. 2006 年 12 月 21 日；444 (7122))。此外，在多種 腫瘤類型的異種移植物模型中，相較于單獨(dú)的抗VEGF，VEGF和D114的組合抑制顯示提供 較優(yōu)的抗腫瘤活性（Noguera-Troise 等，Nature. 2006 年 12 月 21 日；444 (7122) : 1032-7 ; Ridgway 等，Nature. 2006 年 12 月 21 日；444 (7122) : 1083-7)。
[0021] 由于這些結(jié)果，D114被認(rèn)為是癌癥療法的有希望的靶標(biāo)，并且已描述處 于臨床（前）開發(fā)中的一些靶向D114的生物化合物：REGN-421 ( = SAR153192 ; Regeneron，