吸光值）：50 μ 1緩沖液+50 μ 1HHL+50 μ 1 緩沖液于37°C水浴5min，然后加入50μ 1緩沖液，37°C水浴30min，加入200μ 1、1Μ的HCl 終止反應(yīng)，再加入Iml乙酸乙酯萃取產(chǎn)物馬尿酸，振蕩15S，3500r/min離心5min，取0. 8ml 上清，90°C水浴干燥15min，重溶于0. 8ml蒸餾水中，228nm處檢測吸光值為ODC。
[0041] ACE 抑制率（％)= (ODA-ODB) AODA-ODC) X 100%
[0042] (2) a-葡萄糖苷酶抑制活性測定方法：
[0043] 2. 1 原理：此法以 PNPG (4-nitrophenyl-a-D-glucopyranoside, 4_ 硝基苯 基一a -D-吡喃葡萄糖苷）為底物，利用α -葡萄糖苷酶將其分解成PNP及葡萄糖，而 PNP在堿性條件下顯色的原理利用紫外分光光度計(jì)在405nm測定。當(dāng)加入α -葡萄糖苷酶 抑制物時(shí)，α-葡萄糖苷酶對PNPG的催化作用受到抑制，PNP的生成量會(huì)減少。通過測定加 入抑制劑前后的PNP紫外吸收值可以計(jì)算出抑制活性的大小。
[0044] 2. 2活性測定
[0045] 反應(yīng)體系
[0046] △:20(^1^緩沖液（201111腿2?04-1(0!1，其中含有6.411111%(：1 2.6!120)加20(^1^-葡 萄糖苷酶，37°C 維持 5min，加入 200μ L PNPG，37°C 維持 30min，加入(λ IM Na2C03400y L 終 止反應(yīng)，405nm檢測吸光度
[0047] Aci:將A中的200uL α -葡萄糖苷酶換成200uL緩沖液，其他同A操作
[0048] Β:200μ L 樣品加 200μ La -葡萄糖苷酶，37°C維持 5min，加入 200μ L PNPG，37°C 維持30min，加入0. IM Na2C03400 μ L終止反應(yīng)，405nm檢測吸光度
[0049] Btl:將B中的200uL α -葡萄糖苷酶換成200uL緩沖液，其他同B操作
[0050] 抑制率：[I- (ODb-ODbci) AODa-ODaci) ]X100%
[0051] ODa為不存在抑制劑時(shí)control組的吸光值
[0052] ODaq為control組的空白對照值
[0053] ODb為存在抑制劑時(shí)樣品組的吸光值
[0054] ODbq為樣品組的空白對照值
[0055] (3)酪氨酸酶抑制活性
[0056] 3. 1原理：酪氨酸酶又稱多酚氧化酶，是一種含銅的金屬酶，它廣泛存在于動(dòng)植物 體內(nèi)，是生物體合成黑色素的關(guān)鍵酶。酪氨酸酶催化反應(yīng)分為兩步，第一步能夠催化單酚羥 化成二酚，表現(xiàn)出單酚氧化活性，即以酪氨酸為底物生成多巴；第二步把二酚氧化成醌，表 現(xiàn)出二酚氧化活性，即以多巴為底物生成多巴醌。醌又在非酶促條件下形成最終的反應(yīng)產(chǎn) 物黑色素。
[0057] 3. 2酪氨酸酶單酚氧化活性抑制率的測定
[0058] At值的測定：100 μ L蜂花粉提取液加入600 μ L pH=6. 8PBS，再加入 250μ?).015% L-酪氨酸溶液，37°C水浴10min，最后加入50μ?25〇υ/ιΛ的酪氨酸酶溶液 37 °C反應(yīng)(反應(yīng)時(shí)間為
[0059] 3. 3確定的30min)，測定475nm處的吸光度。
[0060] A1值的測定：以同體積PBS緩沖液代替酪氨酸酶溶液，其他同At測定方法。
[0061] Ab值的測定：以同體積PBS替代樣品溶液，其他同At測定方法。
[0062] Atl值的測定：以同體積PBS替代樣品溶液，同時(shí)以同體積PBS緩沖液磷代替酪氨酸 酶溶液，其他同A t測定方法。
[0063] 抑制率（％)=[1- (At-A1)/ (Ab-A0)] X 100
[0064] At:樣品組吸光度值 [0065] A1:樣品組空白對照
[0066] Ab: control 組吸光度值
[0067] A。:control組的空白對照
[0068] (4)抗氧化能力測定方法
[0069] 4. IDPPH自由基清除能力
[0070] 2ml 蜂花粉提取液樣品 +2ml，0· ImM DPPH (2, 2-Diphenyl-l-Picryhydrazyl, 2, 2-二苯基-1-苦肼基自由基）振蕩混勻，室溫放置30min，于517nm檢測吸光度變化
[0071] 清除率 ％= (A_tMl-Asample)/A_tMl XlOO
[0072] 乙醇做 control
[0073] 4· 2羥基自由基清除能力
[0074] 0· 5ml，7. 5mM FeS04+0. 5ml，7. 5mMl，l〇-phenanthroline+2· 5ml，0· 2Μ、ρΗ7· 8 憐酸 緩沖液+〇. 5ml，30mM H202+0. 5ml樣品，于室溫放置5min，536nm檢測吸光度
[0075] 清除率：（As-A1) AA0-A1) X 100
[0076] A1相當(dāng)于blank,無樣品
[0077] Atl 相當(dāng)于 control，無 H2O2
[0078] As樣品組
[0079] 4. 3鐵還原能力測定
[0080] 2ml蜂花粉提取液樣品+2ml，0. 2M，pH6. 6磷酸緩沖液+2ml，1%鐵氰化鉀，50°C， 20min，再加入 10%TCA，于 3000rpm 離心 10min，取 2ml 上清 +2ml 蒸饋水 +4ml, 0· l%FeCl3，室 溫放置10min，700nm檢測吸光度變化。
[0081] GSH做對照
[0082] 三、蜂花粉主要成分及活性測定結(jié)果
[0083] 油菜蜂花粉分別進(jìn)行主要成分和生物活性分析，結(jié)果見表1和表2。
[0084] 表1油菜蜂花粉提取物的主要成分分析結(jié)果(質(zhì)量含量）
[0085]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種蜂花粉提取物，其特征在于： 是由蜂花粉溶劑提取出的黃酮類化合物與蜂花粉溶劑提取剩余殘?jiān)牡鞍姿饷该?解蜂花粉活性肽混合而成，成為蜂花粉提取物。
2. -種權(quán)利要求1所述蜂花粉提取物的制備方法，其特征在于：首先用溶劑提取花粉 中的黃酮類化合物，再將提取剩余的殘?jiān)玫鞍姿饷该附庵苽浞浠ǚ刍钚噪?，然后將黃 酮類化合物和活性肽合并，成為蜂花粉提取物。
3. 按照權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于：蜂花粉提取物按照以下方法制備：干 燥的蜂花粉按照原料：溶劑=Ikg: 5?50L的比例加入溶劑，20-70°C提取1?10小時(shí)，提 取結(jié)束后過濾或離心將提取液與固形物分離分別進(jìn)行處理： (1) 提取液的處理方法：提取液經(jīng)真空濃縮，濃縮樣品用體積濃度40-70%乙醇溶解后 上大孔樹脂柱,先用2?10倍柱體積的去離子水淋洗，然后再用體積濃度40?90%乙醇洗 柱子并收集流分，將含乙醇洗脫劑洗脫的流分真空濃縮得到組分1 ; (2) 固形物處理方法：按照原料：溶液=Ikg :2?IOL的比例加入水或者緩沖液混合，pH 調(diào)整混合液在范圍2?10,再加入原料質(zhì)量的0. 001?3%的蛋白水解酶，于20?60°C酶 解1?48小時(shí)；酶解結(jié)束后將反應(yīng)體系溫度升至80-100°C保持10-60分鐘，使酶失活，然 后離心或過濾，收集濾液濃縮干燥得到組分2 ; 將組分1與組分2再次混合，得到蜂花粉提取物。
4. 按照權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于：蜂花粉提取所用的溶劑為：水、甲醇、 乙醇、乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷、環(huán)己烷、正己烷、石油醚中的一種或二種以上的溶劑 混合物。
5. 按照權(quán)利要求2或3所述的制備方法，其特征在于：固形物酶解中所用的蛋白水解 酶為：胃蛋白酶、胰蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶或中性蛋白 酶中的一種或二種以上。
6. 按照權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于：所述緩沖液為：磷酸緩沖液、 Tris-HCI緩沖液、或醋酸緩沖液中的一種。
7. 按照權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于：所述蜂花粉為油菜花粉、松花粉、玉 米花粉、茶花粉、板栗花粉、荷花花粉、蕎麥花粉、杏花份、桃花粉、向日葵花粉中的一種或二 種以上不同花粉混合物。
8. -種權(quán)利要求1所述蜂花粉提取物的應(yīng)用，其特征在于：權(quán)利要求1所述蜂花粉提 取物作為活性成份，用于藥物、功能食品或食品的制備中； 其可制備成任何形式， 例如口服劑型：粉劑、片劑、膠囊劑、軟膠囊劑、水性藥物、糖楽劑、II劑、丸劑、散劑、小 包、或顆粒劑； 外用局部制劑：乳膏、軟膏、乳液、凝膠、半固體膏、貼劑糊膏、噴霧劑或氣霧劑； 注射劑：溶液、懸劑、或乳劑。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種蜂花粉提取物的制備方法，具體地說先提取蜂花粉的黃酮類化合物、再用提取殘?jiān)苽浞浠ǚ壑械纳锘钚噪?，再將黃酮類化合和活性肽混合制備成為蜂花粉提取物。所制備的蜂花粉提取物同時(shí)兼?zhèn)浠钚噪暮忘S酮類化合物的活性。
【IPC分類】A61P9-00, A61P37-04, A61P3-10, A23L1-29, A61P13-08, A61K133-00, A61K36-31, A61K8-97, A61P39-06
【公開號】CN104546980
【申請?zhí)枴緾N201310495399
【發(fā)明人】鄒漢法, 靳艷
【申請人】中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所
【公開日】2015年4月29日
【申請日】2013年10月21日