一種蜂花粉提取物及其制備和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及蜂花粉提取物的制備方法，，具體地說(shuō)先提取蜂花粉的黃酮類化合物、 再用提取殘?jiān)苽浞浠ǚ壑械纳锘钚噪模賹ⅫS酮類化合和活性肽混合制備成為蜂花粉 提取物，所制備的蜂花粉提取物同時(shí)兼?zhèn)浠钚噪暮忘S酮類化合物的活性。本發(fā)明屬于生物 化工、制藥、食品等技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 蜂花粉是蜂蜜采集有花植物的花粉粒，在采集過(guò)程中加上蜂蜜自身的腺上分泌 物、唾液和花蜜而形成。蜂花粉是蜂群生長(zhǎng)和繁衍的主要營(yíng)養(yǎng)來(lái)源之一，具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià) 值。蜂花粉包含蛋白質(zhì)、碳水化合物、黃酮類化合物、微量元素、酶等多種營(yíng)養(yǎng)成分，因此蜂 花粉素來(lái)就有"天然微型營(yíng)養(yǎng)庫(kù)"等美譽(yù)。關(guān)于蜂花粉的生物活性研究表明，蜂花粉具有改 善心血管疾病、增強(qiáng)免疫力、降血糖、抗氧化、抗衰老、抑制前列腺疾病等功效。
[0003] 文獻(xiàn)1 (中國(guó)專利CN200810007853. 2)公開(kāi)用不同有機(jī)溶劑提取油菜蜂花粉的有 效部位，有效部位在預(yù)防酒精性肝損傷的新用途。文獻(xiàn)2(中國(guó)專利200610052876.6)公 開(kāi)了用酒精提取破壁蜂花粉活性組分，該活性組分具有降血脂的功能。文獻(xiàn)3 (中國(guó)專利 200810134816. 8)公開(kāi)了提取蜂花粉蛋白質(zhì)并用酶解法制備肽，蜂花粉肽具有血管緊張素 轉(zhuǎn)移酶抑制。文獻(xiàn)4 (中國(guó)專利201010295791. 7)公開(kāi)了從油菜蜂花粉中得到了一種具有 抗炎、鎮(zhèn)痛、抑菌活性的提取物的方法。文獻(xiàn)5 (中國(guó)專利201010169477. 4)公開(kāi)了一種從 蜂花粉中提取油脂類化合物的方法。文獻(xiàn)6 (中國(guó)專利201110364321. 6)公開(kāi)了一種從蜂 花粉中提取輔酶QlO的方法。文獻(xiàn)7 (中國(guó)專利200410073514. 6)公開(kāi)了從油菜花粉中制 備具有治療前列腺腫瘤的有效部位的方法。盡管目前關(guān)于蜂花粉活性組分提取的方法已有 很多，但是現(xiàn)有方法都是以蜂花粉中某種單一物質(zhì)為目標(biāo)產(chǎn)物。雖然提取得到的組分具有 較好的活性，但是卻在提取過(guò)程中損失了蜂花粉中其他的活性成分，使蜂花粉僅僅成為某 種成分的原料，而無(wú)法體現(xiàn)蜂花粉"全能營(yíng)養(yǎng)庫(kù)"的特點(diǎn)。未經(jīng)加工的蜂花粉作為功能性食 品或者藥物時(shí)使用時(shí)要達(dá)到理想的功效所需劑量較大。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 目前蜂花粉存在原藥直接使用所需劑量大、提取物活性成分單一無(wú)法體現(xiàn)蜂花粉 全效的問(wèn)題，至今為止還未見(jiàn)有關(guān)蜂花粉保留全效的制備方法。本發(fā)明人經(jīng)過(guò)研究發(fā)現(xiàn)蜂 花粉中的主要生物活性成分為黃酮類化合物以及肽類化合物，提出一種全新的蜂花粉提取 物制備方法，該技術(shù)濃縮黃酮類化合物、精制蜂花粉肽化合物，利用該技術(shù)制備的蜂花粉提 取物最大程度地保留了蜂花粉的生物活性，同時(shí)又大大降低了蜂花粉的有效劑量。
[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種蜂花粉提取物的制備方法。
[0006] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：
[0007] 選用干燥的蜂花粉，首先用溶劑提取花粉中的黃酮類化合物，再將提取剩余的殘 渣用蛋白水解酶酶解制備蜂花粉活性肽，然后將黃酮類化合物和活性肽合并，成為蜂花粉 提取物。
[0008] 蜂花粉提取物按照以下方法制備：干燥的蜂花粉按照原料：溶劑=Ikg: 5?50L的 比例加入溶劑，20-70°C提取1?10小時(shí)，提取結(jié)束后過(guò)濾或離心將提取液與固形物分離分 別進(jìn)行處理：
[0009] (1)提取液的處理方法：提取液經(jīng)真空濃縮，濃縮樣品用體積濃度40-70%乙醇溶 解后上大孔樹(shù)脂柱,先用2?10倍柱體積的去離子水淋洗，然后再用體積濃度40?90%乙 醇洗柱子并收集流分，將含乙醇洗脫劑洗脫的流分真空濃縮得到組分1。
[0010] (2)固形物處理方法：按照原料：溶液=Ikg :2?IOL的比例加入水或者緩沖液混 合，pH調(diào)整混合液在范圍2?10,再加入原料質(zhì)量的0. 001?3%的蛋白水解酶，于20? 60°C酶解1?48小時(shí)；酶解結(jié)束后將反應(yīng)體系溫度升至80-100°C保持10-60分鐘，使酶失 活，然后離心或過(guò)濾，收集濾液濃縮干燥得到組分2。
[0011] 將組分1與組分2再次混合，得到蜂花粉提取物。
[0012] 本發(fā)明干燥花粉提取所用的溶劑為：水、甲醇、乙醇、乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲 烷、環(huán)己烷、正己烷、石油醚中的一種或二種以上的溶劑混合物
[0013] 本發(fā)明固形物酶解中所用的蛋白水解酶為：蛋白水解酶為胃蛋白酶、胰蛋白酶、風(fēng) 味蛋白酶、菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶或中性蛋白酶中的一種或二種以上。
[0014] 本發(fā)明所述緩沖液為：磷酸緩沖液、TriS-HCI緩沖液、醋酸緩沖液、去離子水中的 一種。
[0015] 含有本發(fā)明的提取物的藥物、功能食品、食品可制備成任何形式，例如口服劑型： 粉劑、片劑、膠囊劑、軟膠囊劑、水性藥物、糖漿劑、酊劑、丸劑、散劑、小包、顆粒劑；局部制 齊IJ:乳膏、軟膏、乳液。凝膠。半固體膏、貼劑糊膏。噴霧劑。氣霧劑等；注射劑：溶液、懸劑、 乳劑。
[0016] 本發(fā)明的特點(diǎn)如下：
[0017] 1.本發(fā)明的技術(shù)工藝設(shè)計(jì)巧妙：首先提取蜂花粉中的黃酮類化合物，既濃縮了黃 酮類化合物又不影響后續(xù)工藝中生物活性肽的制備；生物肽制備的過(guò)程又是其濃縮的過(guò) 程，工藝最后又將這種活性組分按原藥的比例組合，不僅最大程度地保留了蜂花粉的生物 活性，而且減少了使用的有效劑量。
[0018] 2.工藝簡(jiǎn)單，效率高。本發(fā)明的提取過(guò)程中蜂花粉不需要破壁等特殊處理，生物活 性肽制備過(guò)程中不需要單獨(dú)提取蛋白質(zhì)，因此制備工藝簡(jiǎn)、效率高，易于實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化；提取 過(guò)程所使用溶劑易回收，有機(jī)溶劑殘留可控，具有綠色環(huán)保的特點(diǎn)。
[0019] 3.具有良好的應(yīng)用前景。蜂花粉的療效有悠久的歷史，但是由于通常所需劑量較 大、療效不顯著，因此在市場(chǎng)推廣中受到限制。現(xiàn)有的蜂花粉活性成分提取技術(shù)都僅僅是單 一組分的提取，無(wú)法體現(xiàn)蜂花粉原有多功效的特點(diǎn)。本發(fā)明的技術(shù)工藝克服了不僅現(xiàn)有技 術(shù)存在的缺陷而且，因此通過(guò)濃縮活性組分從而達(dá)到提高活性的目的，因此將在食品、保健 品、藥品、化妝品等領(lǐng)域有良好的應(yīng)用前景。
【具體實(shí)施方式】
[0020] 實(shí)施例1
[0021] 一、蜂花粉提取物制備方法
[0022] 以油菜花粉為原料，按照以下工藝制備蜂花粉提取物：
[0023] 取干燥的蜂花粉1000克，加入體積濃度70%乙醇5L，20°C提取10小時(shí)，提取結(jié)束 后過(guò)濾將提取液與固形物分離分別進(jìn)行處理：
[0024] (1)提取液的處理方法：提取液經(jīng)真空濃縮干燥，濃縮樣品用體積濃度70%乙醇溶 解后上大孔樹(shù)脂柱，先用5倍柱體積的去離子水淋洗，然后再用體積濃度70%乙醇洗柱子并 收集流分，將70%乙醇所洗的組分真空濃縮干燥得到組分1。
[0025] (2)固形物處理方法：固形物按照原料：溶液=Ikg: IOL的比例加入水，pH調(diào)整混 合液在范圍2,再加入原料質(zhì)量的0. 2%的胃蛋白酶，于40°C酶解48小時(shí)；酶解結(jié)束后將反 應(yīng)體系溫度升至90°C保持20分鐘，使酶失活，然后離心或過(guò)濾，收集濾液濃縮干燥得到組 分2。
[0026] 將組分1與組分2再次混合，得到油菜蜂花粉提取物。
[0027] 二、蜂花粉提取物成分及活性測(cè)定方法
[0028] 1，油菜蜂花粉提取物的主要成分測(cè)定方法：
[0029] (1)蛋白質(zhì)含量測(cè)定：凱氏定氮法；
[0030] (2)多糖含量測(cè)定：硫酸-苯酚法；
[0031] (3)黃酮類化合物含量測(cè)定：硝酸鋁比色法；
[0032] (4)酌·酸測(cè)定：Foiln-ciocalteu 法。
[0033] 2,油菜蜂花粉提取物的生物活性測(cè)定方法：
[0034] (I) ACE抑制活性測(cè)定方法：
[0035] ACE在37°C、PH8. 3的條件下催化分解血管緊張素 I的模擬底物Hippuryl-L-His tidyl-L-Leucine (HHL)產(chǎn)生馬尿酸，該物質(zhì)在228nm處有特征紫外吸收峰。當(dāng)加入ACE抑 制物時(shí)，ACE對(duì)HHL的催化作用受到抑制，馬尿酸的生成量會(huì)減少。通過(guò)測(cè)定加入抑制劑前 后的馬尿酸紫外吸收值可以計(jì)算出抑制活性的大小。
[0036] 反應(yīng)體系
[0037] 緩沖液為 0· 05M，PH8. 3 硼酸鹽緩沖液；底物為 Hippuryl-L-Histidyl-L-Leucine (HHL)，MW429. 47,用上述緩沖液配成 5mM ;ACE (angiotensin-converting enzyme)用上述 緩沖液配成〇. lU/ml。
[0038] ODA (對(duì)照組，為不存在抑制劑但存在酶時(shí)的吸光值）：50 μ 1緩沖液 +50ulHHL+50y 1緩沖液于37°C水浴5min，然后加入50μ I ACE，37°C水浴30min，加入 200μ 1、1M的HCl終止反應(yīng)，再加入Iml乙酸乙酯萃取產(chǎn)物馬尿酸，振蕩15S，3500r/min離 心5min，取0. 8ml上清，90°C水浴干燥15min，重溶于0. 8ml蒸餾水中，228nm處檢測(cè)吸光值 為 0DA。
[0039] ODB (樣品組，為存在抑制劑和酶時(shí)的吸光值）：50 μ 1蜂花粉提取液 +50 μ 1HHL+50 μ 1緩沖液于37 °C水浴5min，然后加入50 μ 1ACE，37 °C水浴30min，加入 200μ 1、1M的HCl終止反應(yīng)，再加入Iml乙酸乙酯萃取產(chǎn)物馬尿酸，振蕩15S，3500r/min離 心5min，取0. 8ml上清，90°C水浴干燥15min，重溶于0. 8ml蒸餾水中，228nm處檢測(cè)吸光值 為 0DB。
[0040] ODC (空白組，為不存在抑制劑和酶時(shí)的