一種自組裝核酸納米管制劑及制備方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種生物制劑，特別涉及一種包含SiRNA的管狀核酸納米制劑及制備 方法和應用。
【背景技術】
[0002] 開發(fā)通用的藥物載體是納米醫(yī)學最重要的研宄主題。以前的研宄已經報道了許多 藥物遞送系統(tǒng)，例如：合成的高分子聚合物、陽離子脂質體、碳納米管、環(huán)糊精材料、納米粒 子、病毒衣殼等。這些遞送系統(tǒng)的有效性已被清楚的演示，然而，它們大多數(shù)都是非自然或 者外生性分子，缺乏組織特異性及具有潛在毒性。近來在DNA結構方面的研宄使得它能進 一步運用于生物學領域。DNA是人體內的自然組分，它相對穩(wěn)定，且能進行生物降解，不產生 免疫原性。因此，自組裝的DNA納米結構在疾病基因治療領域具有巨大的潛力。
[0003] 肺動脈高壓（PAH)是慢性肺部疾病的嚴重并發(fā)癥，臨床療效差，病死率高。肺血管 的異常增殖和重構是其病理基礎。以前的研宄表明，肺動脈平滑肌細胞的異常增殖和凋亡 抵抗在肺高壓形成中發(fā)揮關鍵作用，近來的研宄證實自噬對哺乳動物細胞具有強大的調控 機制。自噬在肺血管疾病發(fā)病機制中扮演關鍵作用。
[0004] 哺乳動物雷帕霉素蛋白（mTOR)，一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是細胞應對生理 條件及環(huán)境壓力時調控自噬及生長的關鍵成分。哺乳動物雷帕霉素蛋白已被證實與腫瘤 的發(fā)生、發(fā)展，心血管疾病，自身免疫性疾病，代謝紊亂和老年性疾病等多種疾病密切相關。 因此，靶標哺乳動物雷帕霉素蛋白在治療多種疾病中提供了一種創(chuàng)新策略。研宄表明哺 乳動物雷帕霉素蛋白激活可以抑制自嗤，相反，抑制mTOR則誘導自嗤。小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)，可高效、特異地抑制革El基因翻譯過程，實現(xiàn)革El基因的表達下調。 因此，如何設計開發(fā)臨床適用的針對肺動脈高壓治療的siRNA遞送系統(tǒng)仍然具有巨大的挑 戰(zhàn)。

【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種自組裝核酸納米管制劑及制備方法和應用，該制劑使 siRNA雙螺旋化，并自組裝進入納米管系統(tǒng)，使siRNA不易被核酸酶降解，形成復合納米 管結構，充分發(fā)揮了納米粒子易被細胞攝取的優(yōu)點，顯著增強了對細胞的轉染效率。因此 siRNA進入細胞結構穩(wěn)定，保持原有生物活性。該制劑對肺動脈平滑肌細胞的轉染效率顯著 提高，能有效調控肺動脈平滑肌細胞的自噬，抑制肺動脈平滑肌細胞的異常增殖，可用于制 備治療肺動脈高壓的藥物。
[0006] 申請人發(fā)明了一種通過控制時間和溫度交聯(lián)四條DNA單鏈形成的納米管系統(tǒng)，將 功能基因 mTOR siRNA通過特定的摩爾比反應綁定到納米管結構上形成納米復合體制劑。核 酸納米載體由于具有較高的可編程性、較好的生物穩(wěn)定性和生物相容性，不會導致細胞異 常轉化或死亡，而且具有納米粒子特殊的結構和表面電荷，能較好的被細胞攝取，并將釋放 交聯(lián)系統(tǒng)中的siRNA，使其具有較高的轉染效率及生物學效應。
[0007] 本發(fā)明的技術方案是：
[0008] -種自組裝核酸納米管制劑，該制劑包括DNA-RNA交聯(lián)構成管狀的自組裝納米制 劑。
[0009] 所述的管狀自組裝納米制劑由序列SEQ ID NO :1所示的mTOR siRNA、序列如SEQ ID NO :2所示的L、序列如SEQ ID NO :3所示的M、序列如SEQ ID NO :4所示的S和序列如 SEQ ID NO :5所示的S'，通過單鏈核酸分子堿基互補配對合成。
[0010] 所述的管狀自組裝納米制劑中mTOR siRNA、L、M、S、S ^的摩爾比為 6 : 1 : 3 : 3 : 3〇
[0011]自組裝核酸納米管制劑的制備方法，有以下步驟：
[0012] 1)取mTOR siRNA、L、M、S、的凍干干粉，分別加 H2O稀釋，混勾，分別得到mTOR siRNA、L、M、S、S'溶液；
[0013] 2)取L、M、S、溶液在pH 8. 0的TAE-Mg2+緩沖液中化合合成核酸納米管溶液， 將步驟1)所得的mTOR SiRNA添加進入核酸納米管溶液，放置30min，得到自組裝核酸納米 管制劑。
[0014] 核酸納米管溶液的合成為：將化合溶液于95°C放置5min，65°C放置30min，50°C放 置 30min，37°C 放置 30min，然后 22°C 放置 30min。
[0015] 所述自組裝核酸納米管制劑中mTOR siRNA、L、M、S、S ^的摩爾比為 6 : I : 3 : 3 : 3〇
[0016] 自組裝核酸納米管制劑在制備治療肺動脈高壓的藥物中的應用。
[0017] 本發(fā)明所述管狀核酸納米制劑分子量為1，314, 655。
[0018] 本發(fā)明所述管狀核酸納米制劑通過單鏈核酸分子堿基互補配對（adenine簡寫A， 代表腺嗓呤；cytonine簡寫為C，代表胞喃啶；guanine簡寫為G，代表鳥嗓呤；thymine簡寫 T，代表胸腺嘧啶；uracil簡寫為U代表尿嘧啶；其中A可以與T或U互補配對，G和C互補 配對）進行納米組裝。四條單鏈DNA合成納米管作為骨架位于中央，SiRNA位于納米管的兩 端，單一功能性管狀核酸納米結構可靶向遞送六個SiRNA的DNA納米粒子（參見圖1)。與 其它的藥物運輸載體相比較，自組裝的裝載siRNA的納米管制劑具有以下優(yōu)點：1)核酸是 生物相容性材料且易于功能化修飾，應用其作為藥物載體可以降低細胞毒性。2)核酸分子 標記方法多樣，對示蹤研宄藥物的途徑和機理提供了較大的便利。3)合成過程簡單，核酸的 變性和復性容易受溫度的控制，其自組裝具有較強的可操控性。4)裸露siRNA進入細胞容 易被核酸酶降解，自組裝納米管納米制劑中的siRNA與DNA結合，提高siRNA穩(wěn)定性，具有 一定的緩釋作用；5)在管狀核酸納米制劑的基礎上，具有核酸的基本性質，可以繼續(xù)與目 前國內外報道的藥物運輸載體結合，如類脂、脂質體、合成多聚體等，有利于細胞的攝取。
[0019] 本發(fā)明所述管狀核酸納米制劑在介導SiRNA的靶向表達或遞送方面具有較好的 優(yōu)勢，將 mTOR siRNA(SEQ ID N0:1)、L(SEQ ID N0:2)序列、M(SEQ ID N0:3)序列、S(SEQ ID NO :4)序列和V (SEQ ID NO :5)序列先交聯(lián)，將siRNA包裹于納米管納米結構內，siRNA 與DNA單鏈結合，提高siRNA的穩(wěn)定性，使其不易被核酸酶降解。管狀納米載體的特殊結構 和表面電荷在轉染試劑的輔助作用下，較易被細胞攝取，使siRNA進入細胞發(fā)揮作用。
[0020] 本發(fā)明所述管狀核酸納米制劑，在核酸與X-tremeGENE siRNA Transfection reagent使用量降低為1比1，使用50nM納米制劑，對肺動脈平滑肌細胞的轉染效率仍然較 高，達到75%，同時證實用DNA攜帶siRNA可以保護siRNA生物學活性并發(fā)揮作用；申請人 通過實驗，其結果表明該自組裝核酸納米材料可顯著降低mTOR的mRNA和蛋白表達水平，可 增強肺動脈平滑肌細胞的自噬，從而有效抑制細胞的異常增殖。本發(fā)明所述制劑在基因研 宄和治療中具有巨大的潛力。
[0021] 為讓本發(fā)明的上述和其它目的、特征和優(yōu)點能更明顯易懂，下文特舉較佳實施例， 并配合附圖，作詳細說明如下。
【附圖說明】
[0022] 圖1管狀核酸納米制劑結構圖；
[0023] 圖2管狀核酸納米制劑結構原子力顯微鏡掃描圖；
[0024] 圖3管狀核酸納米制劑PAGE圖；
[0025] 圖4A激光共聚焦觀察不同劑量轉染試劑對管狀核酸納米制劑細胞攝取的影響；
[0026] 圖4B IPP分析激光共聚焦觀察管狀核酸納米制劑的細胞攝?。?br>[0027] 圖4C統(tǒng)計分析流式細胞儀檢測不同劑量轉染試劑對管狀核酸納米制劑的細胞轉 染效率；
[0028] 圖5A激光共聚焦觀察不同劑量管狀核酸納米制劑細胞轉染攝?。?br>[0029] 圖5B IPP分析激光共聚焦觀察管狀核酸納米制的細胞攝??；
[0030] 圖5C統(tǒng)計分析流式細胞儀檢測不同劑量管狀核酸納米制劑轉染細胞的平均熒光 密度，并與單獨mTOR siRNA轉染細胞的平均熒光密度進行比較；
[0031] 圖6不同時間點PASSMC細胞mTOR mRNA表達水平及半定量分析；
[0032] 圖7不同時間點PASMC細胞mTOR蛋白表達水平及半定量分析；
[0033] 圖8不同時間點PASMC細胞LC3B及PCNA蛋白表達水平及半定量分析；
[0034] 圖9檢測管狀核酸納米制劑對PASMC細胞的生長抑制。
【具體實施方式】
[0035] 下面結合【具體實施方式】對本發(fā)明作進一步詳細的說明。
[0036] 一 .材料
[0037] PASMC細胞購自美國模式培養(yǎng)物研宄所；
[0038] 胎