專利名稱：Pufa增補劑的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及在人和動物飲食中供應多不飽和脂肪酸(PUFA)。更具體地，本發(fā)明涉及供應n-6與n-3族多不飽和脂肪酸，特別是n-6脂肪酸花生四烯酸(ARA)和n-3脂肪酸二十二碳六烯酸(DHA)，二者比例保持平衡。
本發(fā)明在部分程度上基于下列發(fā)現(xiàn)，n-6與n-3族的最佳平衡能夠?qū)】狄约奥约膊〉念A防都起到重要作用。其主要原因是這兩族脂肪酸競爭相同的用于從其C18前體生成長鏈成員的酶。其結果是，一族成員過剩趨向降低另一族的量，現(xiàn)有技術組合物會出現(xiàn)這種情況。而且，這兩族成員在有些情況下可能對身體的重要機能具有不利影響，例如血液凝固和免疫應答。
前言在飲食中提供C18 n-6脂肪酸亞油酸在技術上是相對容易的，因為這種脂肪酸富含在一般的植物油中，例如玉米油和大豆油。含有C18n-3脂肪酸α-亞麻酸的植物油也是可以利用的，例如菜子油，但是由于穩(wěn)定性較低，使用起來不太容易。這通常導致在現(xiàn)代飲食中n-6族相對n-3族過剩。
因此，關于在很多懷疑有相對缺乏的情況下應當補充n-3脂肪酸存在分歧。一般，這一點不能通過提供C-18前體來實現(xiàn)，因為它轉(zhuǎn)化為C20與C22衍生物的效率是很低的。因此，一致的意見是，應當提供C20與C22 n-3脂肪酸(EPA和DHA)本身。
在很多情況下，這種補充作用背后的原理是削弱長鏈n-6脂肪酸ARA的作用。已經(jīng)顯示，加入從魚油或微生物(藻類)油衍生的n-3PUFA的確降低ARA水平。在魚油的情況下，即使魚油含有少量ARA也是如此。
這種ARA含量的降低不總是可取的。本發(fā)明因此尋求提供這樣的制劑，它們可以提高動物的DHA和/或EPA狀態(tài)，并且不會對ARA水平產(chǎn)生不利影響，或者相反，增加ARA且不影響DHA和/或EPA狀態(tài)。
以前已經(jīng)描述過含有ARA與n-3PUFA的制劑在供應嬰兒配方PUFA中的用途。其背后的原理是人母乳含有適量ARA和DHA，據(jù)認為它們對嬰兒發(fā)育是有用的。
相形之下，關于成人營養(yǎng)品，還沒有這樣的天然PUFA來源，盡管ARA和DHA都可以作為人飲食中的成分找到。不過，由于多種原因，這些PUFA水平似乎是次優(yōu)的。此外，不同人群具有不同的PUFA水平，這一點可能影響適合的劑量。由于自然界沒有模型，需要確定所用PUFA的相對量，本發(fā)明尋求解決這一問題，提供PUFA的各種制劑和比例，適合于某些應用。
現(xiàn)有技術M.Makrides等《歐洲化學營養(yǎng)雜志》50352-357(1996)涉及評價改變DHA的內(nèi)部攝取(從0至1.3g DHA/天)對母乳脂肪酸的作用的研究。哺乳期母親飲食中的DHA對母乳DHA具有強特異性和劑量依賴性作用，但是不影響ARA水平。該研究采用藻類油，可從MartekCorporation，USA得到，商標名為NEUROMINSTM。
WO-A-92/12711(Martek)涉及含有ARA與DHA的油摻合物，例如ARA∶DHA之比為3∶1至2∶1，特別涉及在嬰兒配方中提供這些PUFA，其水平相當于人母乳(ARA水平為0.5至0.6％)。
目前，大量含有PUFA的組合物市場有售。EFANATALTM是膠囊劑，每天服用兩粒，每日攝取DHA 125mg、ARA 8.6mg和GLA 40mg。膠囊含有一種油，其主要基于魚油。申請人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，它降低體內(nèi)ARA水平，因為在膠囊中DHA含量相對ARA含量而言太高了。因此這種產(chǎn)品事實上是一種降低ARA、而不是增加ARA的組合物，盡管它含有ARA。下文提供這種產(chǎn)品與本發(fā)明產(chǎn)品之間的比較。
EFAMARINETM也是膠囊劑，主要含有魚油和月見草油，每天服用兩粒，每日攝取EPA 34mg、DHA 22mg和GLA 68mg。
EFALEXTM是油摻合物，每天兩次服用一茶匙(5ml)，每茶匙提供DHA100mg、GLA 21mg、ARA 8mg和百里香油6mg。
發(fā)明概述本發(fā)明在第一方面涉及包含ARA的食用制劑，其量適合于每天釋放150mg至1g的(ARA)劑量。
優(yōu)選地，該制劑適合于每天釋放200至900mg的ARA，例如200至700mg/天，最佳為250至400或500mg/天。
食用制劑包括飲食增補劑和(藥物)制劑和制品，例如片劑、丸劑和膠囊劑。它們另外包括(固體或液體)食品，例如乳制品(人造奶油、奶油、乳、酸奶)、面包、蛋糕；飲品，例如飲料(茶、咖啡、可可、巧克力飲料)、果汁、軟飲料(例如泡沫飲料)；甜食；油性食品(小吃、色拉調(diào)味品、蛋黃醬)、湯、調(diào)味汁、富含碳水化合物的食品(米飯、面條、意大利面食)、魚類食品、嬰兒食品(例如嬰兒配方，呈液體或粉末)、寵物食品和速食品或微波食品。
ARA可以來自任何適當?shù)膩碓?。它可以來自天?例如植物或海產(chǎn))來源，或者可以來自微生物來源，例如真菌、細菌或酵母。
適合的真菌是毛霉目，例如被孢霉屬、腐霉屬或蟲霉屬。優(yōu)選的ARA來源是高山被孢霉或Pythium insidiosum。適合的商業(yè)上可得到的ARA油包括來自DSM/Gist-brocades，Wateringseweg，P.O.Box l，2600 MA，Delft，The Netherland的OPTIMARTM和來自MartekCorporation，6480 Dobbin Road，Columbia，MD 21045，USA的ARASCOTM。
除了ARA以外，還可以提供一種或多種其它PUFA。這可以是除ARA以外的另一種n-6 PUFA(例如C18、C20或C22脂肪酸)，或者它可以是一種n-3脂肪酸(例如C18、C20或C22脂肪酸)，特別是EPA和/或DHA。每種可以用在本發(fā)明中的PUFA可以是游離脂肪酸、脂肪酸酯(例如甲基或乙基酯)的形式，后者例如磷脂或甘油三酯。
如果制劑包含一種n-3脂肪酸，優(yōu)選地它是EPA或DHA。如果它是DHA，那么制劑優(yōu)選地適合于釋放與ARA相同的劑量，例如每天400至600mg的DHA。或者，或另外，如果制劑包含EPA，那么它優(yōu)選地適合于每天釋放150mg至1g的EPA，例如250至500mg EPA/天。
如果制劑每天服用(食入或攝取)一次，那么它可以含有150mg至1g ARA。如果每天兩次，那么制劑可以含有75mg至0.5g ARA，每天三次則含量為50mg至330g ARA等，更頻繁給藥則按此比例。同樣的計算結果也適用于可能存在的其它PUFA，例如DHA。
如果制劑包含一種以上PUFA，那么每種PUFA的量可以用相對比例表示。例如，如果另外提供一種n-3 PUFA，那么ARAn-3 PUFA(例如DHA或EPA)之比可以是1∶5至5∶1，優(yōu)選為2∶1至1∶3，最佳為1∶1至1∶2?？梢詫UFA的相對量進行平衡，以便補充、增加(或者至少不顯著降低)PUFA水平，因個體條件而異。
優(yōu)選地，PUFA以油的形式存在。它可以是純凈的油、精制(例如化學和/或酶學處理)或濃縮的油。這種油可以包含10至100％PUFA，但是含量也可以是20至45％，最佳為30至45％的所需PUFA，例如ARA，如果是微生物油的話。當然，這種油可以含有在這些百分濃度內(nèi)的一種或多種PUFA。油可以是從單一細胞或微生物來源衍生的單一的油，或者它可以是來自這些或其它(例如植物或海產(chǎn))來源的兩種或多種油的摻合物或混合物。油可以含有一種或多種抗氧化劑(例如生育酚、維生素E、棕櫚酸鹽)，其濃度例如為50至800ppm，例如100至700ppm。適合于制備PUFA的方法描述在國際專利申請PCT/EP97/01446(WO-A-97/36996)、PCT/EP97/01448(WO-A-97/37032)和PCT/US92/00517(WO-A-92/13086)中。
本發(fā)明在第二方面涉及包含ARA和DHA的(藥物)組合物，ARA∶DHA之比為1∶1至1∶2。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)PUFA的這種比例可提供良好的平衡，能夠增加體內(nèi)DHA水平，并且不會因DHA含量過高而降低ARA水平。DHA可以來自天然(例如海產(chǎn))來源或來自微生物來源(例如來自藻類)。
第三方面涉及包含0.1至3或5％ARA的食用制劑(例如食品)。優(yōu)選地，含量為0.5至1.5或2％，最佳為0.3至0.8％。第一方面內(nèi)容已經(jīng)討論了適合的食品。優(yōu)選的制備嬰兒配方的方法公開在國際申請PCT/EP97/01447(WO-A-97/35487)和PCT/EP/97/01449(WO-A-97/35488)中。
適合的制劑可以包括油類，例如用于口服。油可以服用其本身，或者它可以例如包封在一種外殼內(nèi)，因此可以是膠囊劑的形式。外殼或膠囊可以包含明膠和/或甘油。制劑可以含有其它成分，例如矯味劑(例如檸檬或酸橙矯味劑)。
本發(fā)明已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了在正常、健康、吃得好的個體(如果基于適當?shù)娘嬍?，通常預期他們不會受益)中提高PUFA水平的用途。不過，它也可以用于低PUFA水平或缺乏的個體。
因此，本發(fā)明在第四方面涉及ARA在婦女中的用途(例如用作飲食或營養(yǎng)增補劑或者用于藥物制備)，該婦女是a.妊娠的，年齡為15至20歲；b.妊娠的，年齡為40至60歲，例如50至55歲；c.妊娠的，懷有第四、第五個或以上的孩子；d.妊娠的，懷有雙胞胎、三胞胎或四胞胎；e.妊娠的，妊娠1至3個月；f.因體外受精(IVF)而妊娠，或者正在接受IVF治療(包括登記或參加IVF過程)但還沒有妊娠；g.妊娠的，妊娠20周或以上；h.妊娠的，并且是營養(yǎng)不良的、營養(yǎng)低劣或勉強的，患有營養(yǎng)不良或吸收障礙，或缺乏一種或多種必需脂肪酸(例如PUFA)；i.試圖妊娠的；j.妊娠的，用于促進子宮內(nèi)生長或胎兒健康；或者k.哺乳的，用于增加婦女母乳的ARA或EPA水平。
在(h)情況下，這些條件在西歐是相當罕見的，但是在非洲或有些亞洲國家(例如巴基斯坦)婦女可以見到。
對妊娠婦女來說，(j)中對胎兒的益處不總是可預測的或立即可見的，這是由于在流體在母親與胎兒之間的運輸上存在個體差異。胎盤與胎兒的聯(lián)系(臍帶)可以在大小和生理條件上是各不相同的，因此在過去，為母親補充PUFA沒有必然意味著胎兒也將接受到這些PUFA，從而同樣受益。
第五方面涉及ARA對50歲以上、優(yōu)選為超過65歲的人(男性或女性)的用途(用作飲食或營養(yǎng)增補劑)。
第六方面涉及ARA對妊娠或哺乳期的除人以外的哺乳動物的用途(用作飲食或營養(yǎng)增補劑)。
ARA優(yōu)選地每天攝取150至700mg，最佳為每天250至500mg。
本發(fā)明在第七方面涉及ARA在藥物制備中的用途，該藥物用于(有助于)預防、防止、改善或治療與例如血液中的異常或低水平n-3或n-6 PUFA有關的疾病或病癥。本發(fā)明因此發(fā)現(xiàn)了在具有低水平ARA的受治療者中的用途，例如那些不能或不能有效轉(zhuǎn)化亞油酸(LA)為ARA的受治療者。因此，適合的患者可能患有Δ6-去飽和酶機能障礙、無效或缺乏。
已經(jīng)建立起PUFA缺乏的(小鼠)模型，用于模擬營養(yǎng)不良的后果。這種模型已經(jīng)顯示出本發(fā)明制劑的有益效果，包括在妊娠期間，對母親和胎兒都是有益的。它還可以刺激胎盤轉(zhuǎn)移不足和子宮內(nèi)生長遲緩，并且顯示出本發(fā)明制劑補充個體(和胎兒，如果妊娠的話)營養(yǎng)的益處，如發(fā)明各方面所述。
申請人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，某些疾病或病癥、特別是神經(jīng)元疾病與低水平的體內(nèi)PUFA、特別是血液中低水平的ARA有關。因此認為，ARA或PUFA均衡給藥將能夠有助于預防、防止、改善或治療這些疾病或病癥。有關疾病包括神經(jīng)元疾病，例如精神分裂癥、囊性纖維變性、自發(fā)性免疫球蛋白A腎病、多發(fā)性硬化、色素性視網(wǎng)膜炎、Usher綜合征、乳糜瀉、黃斑變性、帕金森氏病、骨質(zhì)疏松癥、阿耳茨海默氏病或苯丙酮尿癥。
第八方面涉及ARA與可選的DHA的用途，用于促進人或除人以外的雌性哺乳動物的泌乳和/或生殖效率或成功性或生育力。
本發(fā)明在第九方面涉及ARA與DHA的用途，(在食用制劑中)ARA∶DHA按一定比例可增加血液中的ARA水平。優(yōu)選地，ARA∶DHA之比為1∶5至5∶1，例如1∶1至1∶2。
本發(fā)明特別適用于具有低ARA水平的那些人，例如糖尿病患者、嗜酒者、藥物濫用者、吸煙者或者具有異?；虻兔庖咚交蛎庖呤軗p的受治療者。
第四至第九方面的用途包括ARA(和可選的DHA)本身或作為制劑對受治療者(個體，人或動物)的給藥方法，其中該受治療者需要這種給藥或者將從這種給藥中受益，或者包括在指定目的藥物的制備中的用途。如果必要的話，制劑可以排除GLA和/或DGLA。
ARA(和DHA，如果有的話)的劑量或含量優(yōu)選地是這樣的，它提高必需脂肪酸(EFA)充足指數(shù)(其定義是20∶4 n-6(ARA)水平除以20∶3n-9脂肪酸(蜜酒酸)(mead acid)水平)和/或EFA平衡指數(shù)(其定義是22∶6 n-3(DHA)水平除以22∶5 n-6水平)。這里，各水平包括在血液(例如在紅細胞內(nèi))、腦、胎盤、肝、腸、血漿或胎兒中的水平。
本發(fā)明在一方面上的優(yōu)選特性和特征同樣適用于另一方面，不過在細節(jié)上作必要的修改。
下列實施例僅供闡述本發(fā)明，不被解釋為限制性的。
實施例1至3含有平衡比例PUFA的組合物的制備本實施例描述n-6與n-3油的摻合，以便它們能夠包括在單一的膠囊內(nèi)。
組合物是這樣制備的，將一種富含n-6 PUFA的油與三種不同的富含n-3 PUFA的油混合。富含n-6 PUFA的油是從絲狀真菌高山被孢霉的發(fā)酵作用衍生的，含有大約40％ARA作為主要的脂肪酸。關于富含n-3 PUFA的油，三種不同的來源是高EPA(45％以上)低DHA(約10％)魚油(來自Pronova，Norway，商品名EPAXTM，產(chǎn)品編號EPAx4510TG)、高DHA(50％以上)低EPA(約20％)魚油(來自Pronova，相同品牌，產(chǎn)品編號EPAx2050TG)和從單細胞藻Crythecodiniumcohnii的發(fā)酵作用衍生的油，含有40％DHA作為主要脂肪酸，但是事實上缺乏EPA(來自Martek Corporation，Columbia，United Statesof America，商品名DHASCOTM)。
將油按適當?shù)牧炕旌?，得到所需量和比例的n-3與n-6 PUFA。這里，三種摻合物(實施例1至3)的ARA∶DHA之比為1∶1。在操作過程中，對氧化作用敏感的油用不含氧的氮氣層保護起來，不與環(huán)境中的氧接觸。隨后，這些油用于制備軟凝膠膠囊，每粒膠囊含有400mg ARA和400mg DHA。
實施例4向處于妊娠早期或晚期階段的妊娠婦女供應平衡的PUFA本實施例涉及在妊娠直至分娩(生產(chǎn))過程中第6與第15周之間或第20與第25周之間向妊娠婦女補充ARA和DHA的試驗。ARA來源是含有38％ARA的甘油三酯油，可從DSM/Gist-brocades，Delft，TheNetherlands得到，商品名為OPTIMARTM。這是一種由真菌高山被孢霉產(chǎn)生的油。關于DHA，采用食品級富含DHA的魚油或從藻類衍生的油，是從Martek Corporation得到的，商標名為DHASCOTM。
因此研究了母親在妊娠期間補充ARA和DHA，與沒有接受補充的對照組比較在生產(chǎn)時和隨后的哺乳期間所測量的母親脂肪酸狀態(tài)。測量包括母親的紅細胞ARA與DHA值、臍動脈與靜脈血管壁的ARA與DHA含量、母乳的ARA與DHA含量。
該研究是一例涉及10名妊娠婦女的對照研究。一個實驗組(五名婦女)每天接受一?；蚨嗔Ｄz囊(每粒250mg ARA)油(含有38％ARA)和每天一粒膠囊(每粒500mg DHA)油(含有25％DHA)。對照組接受等量安慰劑膠囊，以消除每日熱量攝取差異。實驗組和對照組的維生素E攝取是相等的，膠囊在早餐期間服用。
在試驗開始和妊娠結束時采集血樣。利用帶有火焰離子化的毛細管氣相色譜法測量紅細胞脂肪酸(按磷脂計)。
發(fā)現(xiàn)在妊娠期間和生產(chǎn)時，經(jīng)過補充的婦女具有顯著更高水平的紅細胞DHA和ARA。這些高水平在哺乳期間顯著持續(xù)，在母親紅細胞和母乳中都明顯如此。發(fā)現(xiàn)母乳中的ARA水平已經(jīng)升高到0.8至1.0％ARA。另外，還發(fā)現(xiàn)新生兒血液中的ARA水平高于對照組。這項發(fā)現(xiàn)對處于最低限度營養(yǎng)條件下的母親及其孩子具有重要意義。
實施例5向老年人供應平衡的PUFA申請人意識到提高人群n-3 PUFA狀態(tài)的需要，尤其是老齡人群，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)諸如帕金森氏病和阿耳茨海默氏病等疾病與低PUFA狀態(tài)有關。認為其部分原因是Δ6-去飽和酶無效或缺乏。不過，需要進行護理，尤其是對老年人，因為ARA水平的降低可能對免疫系統(tǒng)施加負面影響。
按照實施例1制備制劑，含有DHA∶ARA之比為2∶1的n-3與n-6PUFA。將膠囊對健康組、老年男性和婦女(至少65歲)給藥，劑量為每天1g n-3 PUFA。
一個月后，評定受治療者紅細胞的PUFA狀態(tài)。發(fā)現(xiàn)在所有情況下，DHA水平都有增加，而ARA水平保持恒定，或者在有些情況下顯示輕微增加。因此，利用平衡的制劑提高患者的n-3 PUFA狀態(tài)而不危害ARA狀態(tài)是可能的。
實施例6向妊娠婦女供應PUFA制備兩種類型的含PUFA膠囊。第一種含有ARA，每粒500mg。它們每天服用一粒。ARA是以微生物油的形式提供的，從DSM/Gist-brocades，Delft，The Netherlands得到，商品名為OPTIMARTM。這些膠囊具有明膠衣，含有20mg維生素E。還制備了相似的膠囊，具有等量(500mg)的DHA，是以微生物油的形式存在的，從Martek Corporation，Columbia，United States of America得到(商品名為DHASCOTM)。這些膠囊也被設計成每天服用一粒。對妊娠婦女進行試驗，她們每天攝取一粒ARA膠囊，或每天攝取一粒ARA和一粒DHA膠囊。該研究選擇已經(jīng)發(fā)現(xiàn)具有較低血液ARA水平的婦女。因此測試了大量妊娠婦女的體內(nèi)ARA血液水平，得到許可后參加研究。第一組婦女是從15至20歲的少女。關于這些婦女，這是她們的第一次妊娠。由于早熟，發(fā)現(xiàn)她們受益于飲食中補充ARA和ARA加DHA。這兩種方案都增加了體內(nèi)ARA水平。
所研究的第二組妊娠婦女從40至50歲。在妊娠期間發(fā)現(xiàn)她們的體內(nèi)血液水平在兩種補充方案下都增加了。該研究所選擇的婦女有一半懷上的是她們的第四個孩子。
選擇三名各自懷有雙胞胎的婦女，每天補充一粒ARA膠囊和一粒DHA膠囊。發(fā)現(xiàn)她們的ARA體內(nèi)水平相對較低，這可能因為來自母親血液的ARA被兩個胎兒所吸收和消耗。向這些婦女補充ARA和DHA膠囊，發(fā)現(xiàn)血液ARA水平增加了。
實施例7向低PUFA含量的受治療者供應ARA和DHA使用與實施例6所述相同的膠囊，但是這次的ARA膠囊僅含有250mg ARA。這些膠囊可以每日服用一次或兩次，因患者及其條件而異。
該研究選擇了大量較低血液PUFA含量的人。低PUFA含量的原因不總是直接而明顯的。不過，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)大量疾病或不利狀況導致低PUFA水平，因此假定提供合適劑量的ARA或ARA∶DHA的平衡可以增加體內(nèi)ARA水平，這可以減輕一些疾病癥狀。人們認為有些疾病會導致前體向ARA本身的轉(zhuǎn)化效率不良，例如Δ6-去飽和酶的缺損或缺乏。申請人發(fā)現(xiàn)通常導致低PUFA水平的疾病包括囊性纖維變性、多發(fā)性硬化、乳糜瀉和骨質(zhì)疏松癥。另外，還發(fā)現(xiàn)因酒精中毒、藥物成癮而接受治療的患者或免疫受損的患者(AIDS患者)也具有低水平的PUFA。
因此進行了研究，每日服用一?；騼闪RA膠囊，使ARA∶DHA含量為l∶1或1∶2。在幾乎所有情況下，都發(fā)現(xiàn)服用這些膠囊(至少3周)的患者在試驗結束時增加了體內(nèi)ARA血液水平。
實施例8嬰兒配方PUFA的供應制備固體(粉末狀)和液體嬰兒配方的嬰兒食品，含有0.5％ARA和0.5％DHA。由已經(jīng)決定不對孩子母乳喂養(yǎng)的母親在前三個月將該配方有規(guī)律地喂給嬰兒。作為對照，比較這些孩子與在相同時間階段內(nèi)接受母乳喂養(yǎng)的嬰兒的體內(nèi)ARA血液水平。發(fā)現(xiàn)接受奶瓶喂養(yǎng)的嬰兒的ARA水平相當于接受母乳喂養(yǎng)的嬰兒。
對比例9和10選擇大量進行母乳喂養(yǎng)的婦女進行對比試驗。一組婦女每天食入兩粒EFANATALTM膠囊(每日攝取DHA 125mg、ARA 8.6mg和GLA 40mg)。關于對比，對第二組婦女類似地給以所制備的膠囊(具有明膠/甘油外殼)，每粒膠囊含有150mg ARA(每日ARA攝取量為300mg ARA，每天2粒膠囊)。在該第二組中，還服用第三粒膠囊，每天一粒，每粒含有500mg DHA。
比較兩組哺乳婦女在生產(chǎn)后的ARA水平。還比較了母乳中的ARA水平。
在第一個EFANATALTM組中，涉及EFANATALTM消耗的試驗開始后僅兩周即發(fā)現(xiàn)ARA水平在血液中顯著降低，在母乳中有較小程度的降低。相形之下，發(fā)現(xiàn)每天服用兩粒ARA膠囊和一粒DHA膠囊的婦女的ARA水平在血液中增加，母乳水平也增加到0.7％以上。
實施例11通過補充ARA和DHA改善妊娠小鼠脂肪酸缺乏人和除人以外的哺乳動物在妊娠期間的一個主要問題是子宮內(nèi)生長遲緩的發(fā)生。這種狀況顯著危及嬰兒出生后的健康，并可持續(xù)到成年階段。即使在表面健康的婦女妊娠期間也可能發(fā)展為這種狀況，是難以預知的。一般假設這是由胎盤交換功能不良所導致的，例如因為胎盤過小或生理條件不良。
這種不可預知性阻礙了這種狀況的可靠動物模型的發(fā)展。原則上人們通過減少流經(jīng)臍靜脈的血液可以模擬不良的胎盤功能，例如用夾子限制它的直徑。這種方法的問題是它需要對妊娠動物進行手術，對胎兒和母親都可能產(chǎn)生不利影響，而且按照這種方式難以實現(xiàn)血流的均勻減少。因此一種不同的模型已經(jīng)發(fā)展起來。不良的胎盤功能轉(zhuǎn)化為減少對胎兒的必需脂肪酸(EFA)供應。在“自然”狀況下，這是由減少血流所導致的，不同于健康母親血液中的正常生理濃度。在本實施例中，我們已經(jīng)模擬了這種狀況，方法是降低母親血液中的必需脂肪酸濃度，但是通過胎盤的血流是正常的。為此，誘導妊娠小鼠的早期脂肪酸缺乏。在此階段，缺乏以生物化學參數(shù)表示，但是功能缺損是不明顯的。因此確保了在妊娠按正常方式進行的同時，限制了對胎兒的必需脂肪酸供應。
試驗中，將40只8-10周齡的雌性小鼠用規(guī)則小鼠飲食喂養(yǎng)1周。隨后分成8個實驗組RD 1至4和EFAD 1至4。RD組繼續(xù)接受規(guī)則小鼠飲食，含有6.5％脂肪。EFAD組接受缺乏必需脂肪酸的飲食。按照表1，數(shù)字1至4表示各種脂質(zhì)增補劑。ARA來自DSM，Delft，DHA來自Pronova(魚油)，如前面的實施例所述。
表1脂質(zhì)增補劑占總飲食脂質(zhì)的百分率。飲食含有3.8％至5.6％(g/g)脂質(zhì)。
RD(規(guī)則飲食)和EFAD(必需脂肪酸缺乏)飲食以及油增補劑的脂肪酸組成列在表2中。
表2脂質(zhì)部分的脂肪酸組成，以總脂肪酸的g％表示。
另外包括兩個對照組。一個組(RD 0)不接受任何脂質(zhì)補充。第二組接受與RD 0相同的飲食，但是充當非妊娠(NP)外類組(outgroup)。動物進食不受限制。
將實驗組按照下列時間表進行處理。
表3處理的時間表
用FolligonanTM和ChorulonTM(來自Organon，TheNetherlands)進行的激素處理誘發(fā)雌性小鼠排卵過速。這種操作以及與雄性小鼠的短暫接觸得到合理的妊娠可能性，但是沒有保證。用氣相色譜法測定妊娠小鼠及其胎兒的各種組織或切片的脂肪酸組成。利用本領域已知的方法進行各種組織的分級分離、勻化和提取。
平均來說，動物每天消耗3.9g飲食，各RD與EFAD組之間沒有顯著差異。PUFA的飲食劑量如表4所示。
表4ARA和DHA的飲食劑量，以脂質(zhì)部分的百分率和每天攝取的mg表示。
首先，檢查EFAD是否真正誘發(fā)雌性小鼠血液中的生物化學相關性必需脂肪酸缺乏。各種脂肪酸的血液水平在相同飲食組的妊娠與非妊娠小鼠之間幾乎沒有差異，比較RD0和NP可以看出這一點(數(shù)據(jù)沒有顯示出來)。因此比較了這兩組，以提高比較的統(tǒng)計學強度，在妊娠與非妊娠動物之間存在顯著差異的情況除外。在那些情況下，采用妊娠個體的數(shù)值。結果如表5所示。
表5雌性小鼠紅細胞中的必需脂肪酸(EFA)水平。
EFAD導致必需脂肪酸水平顯著降低，花生四烯酸除外。不過，盡管花生四烯酸水平得以維持，仍然存在顯著的(n-6)必需脂肪酸缺乏。這一點從EFA充足指數(shù)可明顯看出，該指數(shù)是花生四烯酸(20∶4 n-6)與其非必需類似物蜜酒酸(20∶3 n-9)之比。后一種脂肪酸僅在這樣的情況下蓄積，即作為正常生物合成底物的必需脂肪酸不足在這種情況下，作為替代，非必需脂肪酸油酸(18∶1 n-9)延長和去飽和，導致生理PUFA n-9類似物的生成。從表5可明顯看出，該EFA充足指數(shù)在EFAD喂養(yǎng)小鼠中戲劇性地下降。
另一種指數(shù)表示n-3與n-6必需脂肪酸的正確平衡。該EFA平衡指數(shù)是DHA(22∶6 n-3)與花生四烯酸(22∶4 n-6)之比。該指數(shù)在EFAD組也明顯地降低。
因此這些數(shù)據(jù)顯示，EFAD飲食的確誘發(fā)明顯的生物化學EFA缺乏，這正是所需要的。
然后檢查向飲食中加入花生四烯酸和/或DHA是否減輕雌性小鼠紅細胞中的這種缺乏。首先將脂肪酸充足(RD)小鼠的對照數(shù)據(jù)列在表6中。
表6補充PUFA對脂肪酸充足的雌性小鼠紅細胞中的必需脂肪酸的影響。脂肪酸數(shù)據(jù)以RD組的百分率表示。
發(fā)現(xiàn)加入含有ARA或DHA的增補劑降低了其它PUFA的水平。相形之下，組合的增補劑改善PUFA狀態(tài)，即使對脂肪酸充足的小鼠也是如此。所用增補劑導致ARA狀態(tài)輕微降低，引起EFA平衡指數(shù)升高。這可能是由所選擇的比例而引起的，DHA∶ARA大約為2∶1。驚人的是，增補劑還提高了EFA充足指數(shù)，即使這些小鼠顯然不是脂肪酸缺乏的也是如此。
然后研究補充PUFA是否導致EFAD喂養(yǎng)動物血細胞中的必需脂肪酸狀態(tài)的改善。
表7補充PUFA對脂肪酸缺乏的雌性小鼠紅細胞中的必需脂肪酸的影響。脂肪酸數(shù)據(jù)以RD組的百分率表示。
表7顯示，EFAD小鼠對PUFA增補劑的反應相當強烈，尤其是它們的DHA狀態(tài)。沒有跡象表明補充ARA會降低DHA狀態(tài)，不過反之的確正確加入DHA增補劑導致ARA狀態(tài)明顯降低。另外明顯的是，加入PUFA特定地恢復PUFA水平，而C-18脂肪酸水平很少受影響。有趣的是，組合的增補劑是唯一導致EFA充足指數(shù)完全恢復的。
最后研究提高母鼠血液中PUFA狀態(tài)是否會改善胎兒的狀態(tài)。為此我們選擇胎兒頭部作為最相關的隔室定量地說，腦(和其它神經(jīng)組織)的生長是依賴于PUFA供應的最重要的過程。
RD喂養(yǎng)的母鼠胎兒數(shù)據(jù)如表8所示。
表8向EFA充足的母鼠補充PUFA對小鼠胎兒頭部中必需脂肪酸的影響。RD組的脂肪酸數(shù)據(jù)以mol-百分率表示。實驗組的脂肪酸數(shù)據(jù)以RD組的百分率表示。
數(shù)據(jù)顯示，增補劑導致RD喂養(yǎng)的小鼠胎兒頭部中的PUFA濃度發(fā)生適度改變。驚人的是，組合的增補劑顯著改善EFA充足指數(shù)，這一點與單獨的增補劑相反。另外，兩種含有DHA的增補劑都導致EFA平衡指數(shù)顯著提高。
表9向EFA缺乏的母鼠補充PUFA對小鼠胎兒頭部中的必需脂肪酸的影響。脂肪酸數(shù)據(jù)以RD組的百分率表示。EFAD＋AA/MCT組不包含妊娠的雌性小鼠。
胎兒的脂肪酸缺乏甚至比母鼠更為嚴重。PUFA增補劑顯著改善EFA充足指數(shù)，幾乎恢復至RD水平。這可能是由于增補劑中的花生四烯酸劑量相對較低，因為EFA平衡指數(shù)甚至更高于RD喂養(yǎng)的母鼠胎兒。這暗示了PUFA有效地結合到胎兒頭部中。事實上，在增補劑中包含花生四烯酸增加了其濃度，盡管尚未達到RD水平。這一點強調(diào)了平衡補充的必要性。適當?shù)钠胶饽軌蛲ㄟ^實驗方法加以評價。
權利要求
1.包含花生四烯酸(ARA)的食用制劑，其量適合于釋放150mg至1g/天的ARA劑量。
2.根據(jù)權利要求1的制劑，適合于釋放250至500mg/天的ARA。
3.根據(jù)權利要求1或2的制劑，另外適合于釋放二十二碳六烯酸(DHA)。
4.根據(jù)任意前述權利要求的制劑，適合于釋放400至600mg/天的DHA劑量。
5.根據(jù)任意前述權利要求的制劑，其中ARA∶DHA之比為1∶5至5∶1，例如為1∶1至1∶2。
6.包含150至700mg ARA的食用制劑，打算每天攝取一次。
7.包含75至350mg AEA的食用制劑，它是食品或營養(yǎng)增補劑。
8.根據(jù)任意前述權利要求的制劑，它是食品或營養(yǎng)增補劑。
9.根據(jù)任意前述權利要求的制劑，它是藥物組合物。
10.包含ARA和DHA的藥物組合物，ARA∶DHA之比為1∶1至1∶2。
11.包含0.1至5％ARA的食品。
12.ARA作為婦女飲食或營養(yǎng)增補劑的用途，該婦女是a.妊娠的，年齡為15至20歲；b.妊娠的，年齡為40至60歲，例如50至55歲；c.妊娠的，懷有第四、第五個或以上的孩子；d.妊娠的，懷有雙胞胎、三胞胎或四胞胎；e.妊娠的，妊娠1至3個月；f.因體外受精(IVF)而妊娠，或者正在接受IVF治療但還沒有妊娠；g.妊娠的，妊娠20周或以上；h.妊娠的，并且是營養(yǎng)不良的、營養(yǎng)低劣或勉強的，患有營養(yǎng)不良或吸收障礙，或缺乏一種或多種必需脂肪酸；i.試圖妊娠的；j.妊娠的，用于促進子宮內(nèi)生長或胎兒健康；或者k.哺乳的，用于增加婦女母乳的ARA或EPA水平。
13.根據(jù)權利要求12的用途，其中攝取ARA 150至700、例如250至500mg/天。
14. ARA作為50歲以上、優(yōu)選為65歲以上的人的飲食或營養(yǎng)增補劑的用途。
15. ARA作為妊娠或哺乳期的除人以外的哺乳動物的飲食或營養(yǎng)增補劑的用途。
16. ARA在藥物制備中的用途，該藥物有助于預防、防止、改善或治療與血液中的異?；虻退絥-3或n-6 PUFA有關的疾病或病癥。
17.根據(jù)權利要求16的用途，其中該疾病或病癥是神經(jīng)元疾病，例如精神分裂癥、囊性纖維變性、自發(fā)性免疫球蛋白A腎病、多發(fā)性硬化、色素性視網(wǎng)膜炎、Usher綜合征、乳糜瀉、黃斑變性、帕金森氏病、骨質(zhì)疏松癥、阿耳茨海默氏病或苯丙酮尿癥。
18. ARA用于促進人或除人以外的雌性哺乳動物的泌乳和/或生殖效率或成功性、或生育力的用途。
19. ARA與DHA的用途，在食用制劑中按一定ARA∶DHA比例增加血液中的ARA水平。
20.根據(jù)權利要求19的用途，其中ARA∶DHA之比為1∶5至5∶1。
21.根據(jù)權利要求20的用途，其中ARA∶DHA之比為1∶1至1∶2。
22.根據(jù)權利要求19至21任一項的用途，用于糖尿病患者、嗜酒者、藥物濫用者、吸煙者或者免疫受損或具有異常免疫水平的人。
全文摘要
公開了包含花生四烯酸(ARA)的食用制劑,例如多不飽和脂肪酸(PUFA),例如藥物組合物或營養(yǎng)增補劑。它們適合于釋放150mg至1g/天的ARA,并且可以含有其它PUFA,例如二十二碳六烯酸(DHA)。DHA劑量為400至600mg/天,ARA∶DHA之比可以是1∶5至5∶1。還公開了包含ARA和DHA的藥物組合物,ARA∶DHA之比為1∶1至1∶2,它們作為包含0.1至5%ARA的食品。這些制劑可用于增加體內(nèi)ARA水平,例如用于妊娠婦女或患有與低ARA水平有關的疾病或病癥的人。
文檔編號A61P3/10GK1326344SQ99813303
公開日2001年12月12日 申請日期1999年10月15日 優(yōu)先權日1998年10月15日
發(fā)明者I·A·M·范沃特斯庫特, H·斯特里克斯特拉 申請人:Dsm公司