專利名稱：一種產(chǎn)生功能性免疫球蛋白超家族蛋白的方法
發(fā)明簡述人類免疫系統(tǒng)的特異性和反應性受MHC(在人HLA中)分子控制。HLA的功能是對免疫T細胞選擇和呈遞抗原肽。可以認為免疫系統(tǒng)是通過MHC視孔觀察世界，任何一種合理的免疫操作途徑都必須考慮到MHC。這類合理的途徑應該具有多種科研、實用或臨床的價值。為了開發(fā)這些可能性，我們設計了一種方法，以新穎并且簡便、可靠和價廉的方式產(chǎn)生高純度的重組MHC分子。這些重組分子作為肽結合劑和T細胞激活劑具有充分的功能活性?？梢允顾鼈儤嫵啥N不同的形式a)作為完全成熟的肽填充部分，它非常穩(wěn)定并具有極強的T細胞激活性，b)作為部分成熟的無肽部分(“空”MHC分子)，它具有合理的穩(wěn)定性和肽易接受性。應該注意到，后一種結果修正了當前關于“空”MHC分子就是不存在的，或者至少是極不穩(wěn)定的錯誤概念。
我們已知的產(chǎn)生重組或非重組MHC的所有其它方法，都更加麻煩并且/或者只能得到具有局限功效和純度的產(chǎn)品。MHC分子的復雜性和不良穩(wěn)定性導致要產(chǎn)生肽易接受性純MHC分子將非常因難，因而要產(chǎn)生預定的純肽-MHC復合物也非常困難。作為出自天然來源的天然分子，MHC分子的產(chǎn)物是緩慢和低產(chǎn)率的。并且只能用很麻煩的方法純化它們，導致制備物中MHC被大量不同的肽預先占據(jù)了，并且有時還污染了其它MHC單倍型，最終結果是非常受污染的制備物。
產(chǎn)生MHC分子的難題綜合起來是MHC基因座的極端多態(tài)性。在人類群體中存在400個以上不同的HLA-A、HLA-B和HLA-C等位基因，并存在200個以上HLA-D等位基因。這種多樣性當然具有免疫學目的，但是對于產(chǎn)生MHC是一種實際障礙，因為需要產(chǎn)生許多不同的MHC，并且需要對它們單獨地最優(yōu)化、確認、鑒定和儲存等。
重組表達系統(tǒng)可能具有多種優(yōu)點。可能獲得較高的產(chǎn)率和設計簡便的純化方案，并且可能用一個特定的肽對其分子作同質(zhì)性標記。但是這種方法的主要障礙是，正確折疊的MHC結構是由三個成分(重鏈、輕鏈(β-2-微球蛋白β2m)和肽)組成的相當復雜的結構。只有三個成分都在一起時MHC方能獲得充分的穩(wěn)定性。特別是不存在其它兩個成分時重鏈極不穩(wěn)定。因此，很難制備、操作和貯存沒有β2m和肽的分離的重鏈，因而也很難產(chǎn)生MHC分子，它可容易地結合實驗者選擇的任何一種肽。因為其有限的穩(wěn)定性，分離的MHC分子會迅速聚集并被丟失，導致最終產(chǎn)率非常差。
本專利申請描述了大量產(chǎn)生具有所需任何等位基因特異性的重組MHC分子的一般方法。此方法還首次獲得了真正的空MHC分子，并具有相當?shù)姆€(wěn)定性，結果表明這些空分子的結合特征不同于過去產(chǎn)生的MHC所具有的結合特征。合理的預期是，這些空分子與生理性MHC結合有更多的關系，因為它們反映出重新結合狀態(tài)，而以前使用的MHC分子已反映出更多的人工交換反應。除了改進MHC質(zhì)量之外，這種新穎的制備方案還簡便可靠，容易適合于大部分(可能是全部)MHC分子，并且對于完整功能的純MHC分子具有高產(chǎn)率。這些重組分子是非常有效的，因為可對它們檢測出小至2-4ng分離MHC重鏈的肽結合活性，并且可檢測出小至150ng肽/MHC的T細胞結合能力。它們具非常的親和活性，類似于對天然存在的分子所測定的親和性，具有更快的結合速率并可充分地結合(即沒有內(nèi)源性肽)。我們已能夠儲存這種分子并使它們保持數(shù)個月活性。此含義既有分析證明又有治療證明。
最后，所描述的方法已成功地用于其它(非-MHC)分子如CD3復合體成分。實際上，所公開的方法可應用于設計產(chǎn)生任何蛋白質(zhì)(重組的或非重組的，在原核生物內(nèi)或真核生物內(nèi))，其中在制備的某一階段蛋白質(zhì)通過變性或解析疊成為溶劑化物(其目的可能是解除蛋白質(zhì)的聚集，為了純化蛋白質(zhì)等)，以后必須實施恢復/再折疊步驟。因此，本方法可能具有非常大的應用范圍。我們推測，特別是它可能用于免疫球蛋白超家族的所有成員，包括抗體、MHC和T細胞受體。它可能用于產(chǎn)生包含至少一個半胱氨酸的所有分子。
存在二種MHC亞型，MHC I類和MHC II類。這二種亞型對應于二個T淋巴細胞亞群1)CD8＋細胞毒T細胞，它通常識別由MCH I類分子呈遞的肽，殺滅受感染的或突變的細胞，以及2)CD4＋輔助T細胞，它通常識別由MHC II類分子呈遞的肽，調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)其它細胞的應答。MHC I類由非共價結合于12000 MW非糖基化蛋白(β鏈，也稱為β2-微球蛋白)的43000MW跨膜糖蛋白(α鏈)組成。MHC II類具有類似于MHC I類的整體結構，雖然功能區(qū)的分布不同。MHC II類由二個非共價結合的大約34000和29000MW的跨膜糖蛋白組成。對MHC I類和II類分子的詳細結構已在X-射線晶體學的水平進行了分析(Bjrkman等，1987)。MHC結構最引人注目的部分是其上部，它顯示出一個獨特的肽結合凹槽，由形成凹槽圍墻的二個α螺旋和形成凹槽底面的第八β-折褶的外套層組成。
MHC是非常多形性的，也就是說，人群中存在許多不同的版本(等位基因，同種異型)，但是每個個體只繼承了其中的一個或二個(一個來自父親，另一個來自母親)。MHC也是多基因的，即在基因組中存在幾個MHC編碼基因座，使之有可能同時表達幾個同種型。重要的是，大多數(shù)多形性殘基是指向對其大小、形狀和功能性起作用的肽結合凹槽(Mrtsumure等1992)。肽-MHC相互作用是特異性的，而雖然較寬，但可使許多無關的肽結合于每種MHC同種異型(Buus等1987)。這種多形性限定了肽結合的特異性，它的生物學結果是，群體中的每個個體培育和形成一套獨特的T細胞指令表。MHC特異性的產(chǎn)生從結構上，MHC的肽結合部位形成一個凹槽，還可細分成從A至F的多個口袋。肽-MHC結合能的大多數(shù)包含在結合肽的主鏈原子(包括MHC I類的未端)；其特點對所有的肽都是共同的(Matsumura等1992)。只有少量結合能包含在肽側鏈原子，但是認為這些相互作用可解釋MHC的特異性。這種機制可解釋MHC如何實現(xiàn)寬特異性及高親和性的肽結合。從功能上，MHC是通過“基元序列”的識別來實現(xiàn)其較寬的肽結合特異性(Sette等1987)。一個基元序列表示出肽結合所需要的重要結構要求，例如在錨定位置中特定氨基酸的存在和適當間隔。相當多的興趣已集中在理解MHC特異性和基元序列是如何產(chǎn)生的，以及鑒定各種MHC分子的特異性。這種努力的根本目的之一是能夠預測肽結合。從MHC的多形性(同為這點在結構和功能上已證明)可以推斷，每個MHC同種異型都具有其自己的特異性特征。迄今為止還只能夠經(jīng)過實驗描述這些特異性。對MHC特異性的描述和預測目前有二種根本不同的，但互補的方法用于測定MHC的肽結合特異性。一種方法包括對已結合于給定同種異型MHC分子的肽進行測序(Buus等1988；Falk等1991)，而另一種方法包括測定哪些肽將會結合于此MHC(Buus等1986；Olsen等1994)。二種方法各有優(yōu)缺點。測序的方法使用非人工處理的肽-MHC復合物，但是此方法人為地規(guī)定重要的殘基、比較不重要的殘基和不重要的殘基，并且不能夠鑒別負相互作用的殘基。因此它最適合于鑒別最優(yōu)勢的正相互作用殘基。后一種方法是直接結合法，是定量的方法，它可將結合的與不結合的進行比較。此方法可以鑒別和定量正的以及負的相互作用殘基。因此如下結果可能不會令人意外與測序的方法(大約30％成功)相比較，直接結合法可獲得較好的可預測性(大約70％預測的肽確實結合了)(Kast等1994)。已經(jīng)證明，要準確地預測肽結合需要詳細地了解所研究MHC的精細特異性(有時稱為擴展的基元序列)(Paker等1994，Rupert等1993；Stryhn等1996)。但是，獲得如此詳細的基元序列需要非常多的人力和物力。目前，為了測定所需每種MHC分子的精細特異性，是對傾向于具有特殊序列或基元序列的大批肽進行常規(guī)分析(Parker等1994，Rupert等1993)。我們最近建立了一種基于肽文庫的方法，此方法可對所有功能上重要的MHC結合殘基給予準確、無偏見的和定量的描述(Stryhn等1996)。它是普遍運用的，因為對許多不同的MHC分子可以用相同的一套肽文庫進行尋址，并且試驗結合的測定法可被發(fā)展用于任何一種MHC分子。此方法簡便，可顯著地減少實驗安排和隨后的數(shù)據(jù)處理，因此便于繪制全部MHC I類特異性的完整圖譜。基于這種無偏向的肽文庫的方法也確實導致改進了對肽結合的預料(Stryhn等1996)。這種預測規(guī)則系統(tǒng)的成功暗示，基本上可將MHC I類的結合看作是獨立起作用的亞特異性排列的結果。重組MHC分子的產(chǎn)生其它的研究者已可用細菌作載體用于產(chǎn)生重組MHC分子(Parker和Wiley 1989)。但是這些MHC分子被包裹在細菌內(nèi)的包涵體中而不能為肽結合利用。包括使這些包涵體完全變性和還原的方案已被用于提取和溶解此重組MHC分子(Parker等1992，Parker等1992，Parker和Wiley1990)。這又使之需要在有還原/氧化劑如谷胱甘肽(GSH/GSSG)存在時在體外應用重折疊步驟。已加入了其它一些成分如L-精氨酸以便防止聚集和錯誤折疊。但是，體外折疊將面對在產(chǎn)生正確形成的二硫橋中的主要問題。MHC I類的重鏈包含4個半胱氨酸(在某些分子中是5個)。在這種重折疊過程中對于錯誤配對的二硫橋存在幾種可能性。已有報導應用這種方法功能性MHC I類的一般產(chǎn)率很低(大約10-20％)，并具有非常緩慢的功力學過程(Garboczi等1992)。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及一種我們發(fā)明的方法，是為了解決在聚集體如包涵體中表達的具有功能的免疫球蛋白超家族蛋白的問題。在本發(fā)明的方法中，功能性蛋白可能由在相同細胞中或在不同細胞中產(chǎn)生的幾個蛋白質(zhì)亞單位組成。在后一種情況下，此功能性蛋白質(zhì)可能正好是二種不同的蛋白質(zhì)，例如MHC I類蛋白的重鏈和β2微球蛋白，它可能是在折疊時或稍后被組合成。
在一個實施方案中，本發(fā)明涉及一種產(chǎn)生功能性免疫球蛋白超家族蛋白的方法，此蛋白在有功能時具有至少一個二硫鍵，此方法包括如下步驟(ⅰ)提供一種包含編碼此蛋白質(zhì)基因的細菌細胞，此基因在該細胞中可表達，(ⅱ)在使此基因表達的條件下培育此細胞，(ⅲ)在不會改變細胞產(chǎn)生的二硫鍵的條件下從細胞中分離出此蛋白質(zhì)，并且任選地純化此蛋白質(zhì)，(ⅳ)使分離出的蛋白質(zhì)經(jīng)受折疊處理。
在本詳細說明和權利要求中當使用“a”或“an”時，這意指一個或幾個，即至少一個。
用名詞“功能性蛋白”意指能夠實現(xiàn)某些功能中至少一種功能的免疫球蛋白超家族蛋白，這些功能至少在相當程度上歸因于這種蛋白質(zhì)，例如通過體外檢測法所評估的。作為例子，“功能性MHC I類蛋白”被定義為包含重鏈、輕鏈(b2m)和肽的蛋白質(zhì)。為了使它在水溶液中能溶解可將重鏈截去。此肽是可結合于所述MHC蛋白的肽?？山柚诶缬葿uus等1986和Olsen等1994所描述的直接結合法發(fā)現(xiàn)這種肽。
“功能性MHC II類蛋白”意指包含二個重鏈(α和β鏈)和一個肽的復合體的蛋白質(zhì)。為了使此復合體可溶解于水溶液可將其重鏈截去。此肽是可以結合于所述MHC蛋白的肽?？山柚诶缬葿uus等1986和Olsen等1994所描述的直接結合法發(fā)現(xiàn)這種肽。
本發(fā)明特別優(yōu)選的實施方案是一些方法，其中的MHC蛋白是一種MHC I類蛋白，選自重鏈、與β2m組合的重鏈和功能成熟的MHC I類蛋白質(zhì)；或者是一種MHC II類蛋白，選自α/β二聚體和帶有肽的α/β二聚體。本發(fā)明的一個重要方面是一種方法，其中所形成的MHC蛋白是作為一種無肽的MHC蛋白被獲得。
“無肽的MHC I類蛋白”意指包含與輕鏈(b2m)結合的重鏈但不含肽的蛋白質(zhì)。這種蛋白質(zhì)還可被稱為“空”MHC I類蛋白。
“無肽的MHC II類蛋白”意指包含重鏈復合體但不含肽的蛋白質(zhì)。這種蛋白質(zhì)還可被稱為“空”MHC II類蛋白。
將根據(jù)MHC I類蛋白對本發(fā)明作例證性說明，但是可設想按相似的方式有可能產(chǎn)生所有的免疫球蛋白超家族蛋白(由二硫鍵結合確定的蛋白)，即包括選自如下種類的蛋白質(zhì)抗體、免疫球蛋白可變(V)區(qū)、免疫球蛋白恒定(C)區(qū)、免疫球蛋白輕鏈、免疫球蛋白重鏈、CD1、CD2、CD3、I類和II類組織相容性分子、β2微球蛋白(β2m)，淋巴細胞功能相關的抗原-3(LFA-3)和FcγRIII、CD7、CD8、Thy-1和Tp44(CD 28)、T細胞受體、CD4、多免疫球蛋白受體，神經(jīng)細胞粘附分子(NCAM)、髓鞘相關糖蛋白(MAG)，髓鞘質(zhì)P蛋白、癌胚抗原(CEA)、血小板衍生生長因子受體(PDGFR)、集落到激因子-1受體、αβ-糖蛋白、ICAM(細胞間粘附分子)，血小板以及白介素。本發(fā)明者已提供了關于幾種MHC I類分子、β2-微球蛋白、MHC II類分子、以及T細胞受體CD3鏈γ和ε的資料。
按照例如“分子克隆”(Sambrook，F(xiàn)ritsch和Maniatis，冷泉港出版社，1989)中所述的標準程序克隆編碼所需不同蛋白質(zhì)的cDNA。概括地說，可使用商品cDNA合成試劑盒(碰巧購自Pharmacia)從適合的細胞系合成cDNA。為了用于人，此細胞可從一組表達HLA的EBV轉化的人B細胞系得到，此B細胞系是來自第12屆國際組織相容性專題討論會的細胞系各單數(shù)據(jù)庫(“HLAHLA的基因多樣性，功能和醫(yī)學意義”，Dominique Charron編輯EDK出版，1997，或者參見http//www.icnet.uk/axp/tia/marsh/ihw.html)。對于HLA-A*0201，適合的細胞系可以是IHW9012。與所需MHC/HLA分子相對應的核苷酸序列可以在http//www.anthonynolam.com/HIG/index.html，或 者 在http//www.ncbi.nl m.nih.gov找到。應用此序列信息可以設計霧核苷酸引物，以便近過聚合酶鏈式反應擴增包含來自此適當cDNA的成熟MHC/HLA分子氨基酸1-274的編碼區(qū)。選定相關的正向和反向引物用于擴增HLA-A*0201，并將它插入Pet28a表達載體(Novagen，見http//www.novagen.com/vectfram.html)的NcoI和HindIII限制性位點。將連接產(chǎn)物轉化進入細菌TOP10F’并對卡那霉素抗性選擇過夜。挑選出幾個克隆并借助于Wizard miniprep(Promega)制備它們的質(zhì)粒。在應用此克隆引物的聚合酶鏈式反應中將該質(zhì)粒用作模板，并通過瓊脂糖凝膠電泳和溴化乙錠染色分析此擴增產(chǎn)物。對導致適當大小擴增產(chǎn)物的質(zhì)粒進行測序(ABL310測序儀)，以便鑒別包含所需序列的克隆。將這些確定無疑的克隆用于隨后的制備過程。類似的方案可用于克隆任何所需的基因。
特別優(yōu)選的蛋白質(zhì)是脊推動物蛋白質(zhì)，例如人的、鼠的、大鼠的、豬的、牛或鳥類的蛋白質(zhì)。
在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及一種產(chǎn)生多種功能性蛋白質(zhì)的方法，在此至少其中一種蛋白質(zhì)是免疫球蛋白超家族，并且此多種蛋白質(zhì)當有功能時包含至少一個分子內(nèi)或分子間二硫鍵，此方法包括如下步驟(ⅰ)提供一種細菌細胞，此細胞包含各編碼一種蛋白的多種基因，所有的基因都可在該細胞中表達，
(ⅱ)在使這些基因表達的條件下培養(yǎng)此細胞，(ⅲ)在不會改變細胞產(chǎn)生的二硫鍵的條件下從細胞中分離出這些蛋白質(zhì)，且任選地可純化它們，(ⅳ)使分離出的蛋白質(zhì)經(jīng)受折疊處理。
在此實施方案中，此蛋白質(zhì)可以是融合蛋白，或者可能是二個單獨的蛋白質(zhì)，即共表達蛋白質(zhì)。
另一個實施方案涉及一種產(chǎn)生功能性免疫球蛋白超家族蛋白的方法，此蛋白質(zhì)在有功能時具有至少一個二硫鍵，此方法包括如下步驟(ⅰ)提供一種包含編碼該蛋白質(zhì)基因的細胞，此基因在該細胞中可表達，此蛋白質(zhì)是作為一個聚集體被表達，(ⅱ)在使該基因表達的條件下培養(yǎng)這種細胞，(ⅲ)在不會改變細胞產(chǎn)生的二硫鍵的條件下從細胞中分離出此蛋白質(zhì)聚集體，并且任選地純化它，(ⅳ)使分離出的蛋白質(zhì)經(jīng)受折疊處理。
變性蛋白質(zhì)可能以許多不同的構象存在—它沒有一個獨特的構象-而在水溶液中折疊的蛋白質(zhì)是以一種或幾種截然不同的構象存在。本發(fā)明的基本特征之一是，它避免對在還原條件下由復性作用引起的蛋白質(zhì)聚集體進行常規(guī)的溶解，這將導致完全未折疊的蛋白質(zhì)。為了產(chǎn)生正確折疊的蛋白質(zhì)而需要再形成正確的二硫鍵，這使隨后的再折疊復雜化了。本發(fā)明方法的特點在于它意外地發(fā)現(xiàn)，存在于聚集體如包涵體中的蛋白質(zhì)似乎是以具有正確二硫鍵的功能性形式存在，因此其任務是使它們不破壞二硫鍵而被溶解。本發(fā)明者已發(fā)現(xiàn)，必須在不改變蛋白質(zhì)的氧化還原狀態(tài)的非-還原條件下使此蛋白質(zhì)變性溶解。應用具有正確二硫鍵的變性蛋白質(zhì)可導致簡化重折疊過程，現(xiàn)在可能像稀釋例如尿素一樣簡單而不需加氧化還原偶合物。但是可借助于其它一些蛋白質(zhì)如伴侶蛋白幫助折疊，在MHC I類的情況下可借助于β2m和/或肽的幫助。進而根據(jù)本發(fā)明，對于某些蛋白質(zhì)如MHC可以基本上在沒有氧化還原偶合物如GSSG/GSH的存在下進行折疊處理。
可通過使細胞破裂來實現(xiàn)分離過程，分離出聚集體如包涵體(例如通過離心)，任選地可進行洗滌，在導致提取可溶性蛋白質(zhì)的變性劑(例如尿素或鹽酸胍，或者借助于本領域技術人員已知的其它方法)中提取此聚集體(如包涵體)。這是分離步驟(ⅲ)的簡要過程，對于本領域的技術人員顯然還可以對它進行修改或者隨后加入例如純化步驟。這是一個特別方便的時機，對于MHC分子加入純化步驟確實是優(yōu)選的，因為可以除去包括寡肽的許多非共價結合的分子?？山柚谌缦露喾N方法進行這種純化過程離子交換層析、大小排阻層析、親和層析、疏水相互作用，沉淀法，過濾法，離心法和本領域技術人員已知的其它方法。
通過將變性劑(如尿素)稀釋至導致蛋白質(zhì)折疊的濃度點可啟動折疊。本發(fā)明方法中的折疊步驟優(yōu)選地是在含有至少一種緩沖劑化合物的水介質(zhì)中進行。然后可使蛋白質(zhì)經(jīng)過如上所述的純化程序。
在本發(fā)明的方法中，含有編碼異源性或同源性蛋白質(zhì)基因的細胞，并且此基因可在其中表達的細胞可以是任何一種細胞。優(yōu)選地此細胞可選自細菌細胞，真菌細胞，酵母細胞，動物細胞和植物細胞。更優(yōu)選地此細胞是選自革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的細菌細胞。在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中此革蘭陰性菌是大腸桿菌，包括BL21株或它的衍生株或者XA90株或它的衍生株。
預期可用的另一種細胞是被遺傳修飾的細胞，與相同株的未修飾細胞相比較這種細胞較弱的細胞內(nèi)還原環(huán)境，例如此細胞已被修飾具有降低的或者缺乏硫氧還蛋白還原酶或對細胞質(zhì)硫氫基還原潛力具有相似作用酶的活性，如trxB-突變株。另一種可用的細胞株可以是能夠生物素化蛋白質(zhì)的細胞株，即此細胞株能夠生物素化具有生物素化序列的蛋白質(zhì)?？梢栽隗w內(nèi)或體外修飾這種蛋白質(zhì)，例如被磷酸化、糖基化、乙酰化、酰胺化或任何所適當?shù)钠渌揎椃绞健?br> 被表達的蛋白質(zhì)可能定位在細胞內(nèi)、細胞周質(zhì)或細胞外。
借助于任何一種用于將核苷酸序列導入細胞的常規(guī)技術可實施插入編碼功能性蛋白的基因，例如通過轉化、轉染或轉導技術。一般可借助于轉座(transposome)或通過重組過程將基因插入宿主細胞的染色體，或者可以借助于適當?shù)妮d體以游離體的形式將基因導入。適合于此目的的載體包括pET載體如T7質(zhì)粒。
人們會總意識到，基因可被單獨地或者與另一些核苷酸序列組合在一起導入宿主細胞。包括調(diào)節(jié)基因表達的序列如啟動子序列，調(diào)節(jié)啟動子的序列，增強子序列，編碼包括反義RNA的阻抑物的序列，或者終止序列。為了增加所產(chǎn)生蛋白質(zhì)的量，可以將編碼此功能蛋白質(zhì)的多拷貝基因導入宿主細胞。也可能導入編碼伴侶蛋白的序列或者調(diào)節(jié)天然伴侶蛋白表達或功能的序列，或者編碼導致此功能性蛋白質(zhì)糖基化的基因產(chǎn)物的序列。此啟動子可能是組成型或可誘導的。
本發(fā)明方法的優(yōu)越性表現(xiàn)在蛋白質(zhì)產(chǎn)物的一方面或幾方面。按照本發(fā)明方法產(chǎn)生的功能性蛋白質(zhì)的產(chǎn)率，相對于在基本類似的條件下，但其中是在確實改變細胞產(chǎn)生的二硫鍵的條件下實施步驟(ⅲ)所得到的功能性蛋白質(zhì)的產(chǎn)率可能增加至少10％，例如至少20％、至少40％、至少50％、至少70％、或至少100％。另一方面，按照本發(fā)明方法的速度，與在確實改變細胞產(chǎn)生的二硫鍵的條件下實施步驟(ⅲ)時的速度相比較可能至少快10％，例如至少20％，至少40％，至少50％，至少70％，或至少100％。預期其速度實際上可能是多達2倍、5倍、10倍、100倍或10000倍地增加。在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，其速度至少增加50倍。最后，按照本發(fā)明的方法產(chǎn)生的功能性蛋白質(zhì)的純度，相對于在基本上相似的條件下，但其中是在確實改變細胞產(chǎn)生的二硫鍵的條件下實施步驟(ⅲ)所得到的功能性蛋白質(zhì)的純度可能增加至少10％，例如至少20％、至少40％、至少50％、至少70％或至少100％。
根據(jù)實施例特別是MHC蛋白A2，其折疊效率可能是至少40％，而MHC蛋白Db具有認為還要更高的折疊效率，即至少50％。對于活性蛋白質(zhì)此百分率是在折疊后立即被測定，與在折疊過程中所研究蛋白質(zhì)的輸入量相比較。預期當使本發(fā)明的方法對于所研究的蛋白質(zhì)最佳化時，那么在所產(chǎn)生的免疫球蛋白超家族蛋白中至少可獲得25％具有功能形式的蛋白。
優(yōu)選地此蛋白質(zhì)不含有未配對的半胱氨酸殘基。但是在本發(fā)明范圍內(nèi)的一個實施方案，其中該蛋白質(zhì)含有1個未配對的半胱氨酸殘基。此蛋白質(zhì)可能含有至少2個例如至少3個、至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個、至少10個、至少11個、至少12個、至少13個、至少14個、至少15個、至少16個、至少17個、至少18個、至少19個、或至少20個半胱氨酸殘基。優(yōu)選地此蛋白質(zhì)含有偶數(shù)的半胱氨酸殘基。非?？赡艽说鞍踪|(zhì)具有至多20個，例如至多14個、至多10個、至多8個、至多5個、至多4個、至多3個或至多2個半胱氨酸殘基。此蛋白質(zhì)優(yōu)選地能夠具有至少1個，例如至少2個、至少3個、至少4個、至少5個或至少6個二硫鍵。非?？赡艽说鞍踪|(zhì)能夠具有至多20個，例如至多15個、至多10個、至多8個、至多5個、至多4個、至多3個或至多2個二硫鍵。
在優(yōu)選的實施方案中，其基因是天然存在基因的衍生物。通過取代至少一個密碼子可獲這種衍生物，此密碼子與原來存在的編碼相同氨基酸的密碼子相比較更經(jīng)常地被宿主細胞利用。一般地說此基因是在天然狀態(tài)不與此基因結合的調(diào)節(jié)性DNA序列的控制之下。但是它還可能是在它自己的啟動子控制之下。在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，是以選自pET載體例如T7質(zhì)粒的表達載體轉化細菌細胞。對于本領域的技術人員顯然還有其它的載體。
本發(fā)明最重要的方面是可通過本發(fā)明方法獲得的一種穩(wěn)定的無肽MHC蛋白。在本領域以前還沒有通過任何方法產(chǎn)生穩(wěn)定的無肽MHC蛋白。雖然已聲稱(Matsumura等1992)從TAP缺乏的真核細胞如T2或昆蟲細胞可以獲得空分子，但是從這種制備物中已提取并鑒定出肽(Wei和Cresswell1992，Henderson等1992)，也就是說，這些制備物不是真正的空分子。穩(wěn)定的無肽MHC蛋白的用途之一是提供用于高效率地產(chǎn)生純的同源肽-MHC復合體。用名詞“穩(wěn)定的”意指在尿素中分離形式的重鏈在-20℃，50％甘油下可以保存至少3個月。此復合物的半壽期實際上大于6個月，正在研究功能性MHC復合體即11重鏈和β2m在水溶液中的穩(wěn)定性。但是已知在存在過量β2m時重鏈在水溶液中穩(wěn)定的半壽期在4℃是大約2天。
本發(fā)明的另一個重要方面是一種試劑盒，它包含有使其接受者能產(chǎn)生功能性MHC I類蛋白的MHC I類重鏈和β2m，對此蛋白可以加入能夠結合于該MHC I類蛋白而導致形成功能性MHC I類蛋白的肽。此MHC蛋白將通過本發(fā)明的方法被優(yōu)選地產(chǎn)生。在一個實施方案中，此試劑盒包含將允許最終使用者可測定對他/她所選擇的任何一種肽結合的試劑，可應用如酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)、放射免疫測定法(RIA)或本領域技術人員已知的其它檢測系統(tǒng)。在另一個實施方案中，此試劑盒包含低聚合的MHC蛋白，例如2個、3個、4個或更多MHC蛋白的低聚合物。在一個特定的實施方案中，此試劑盒包含被加入作為標記物的另一種試劑，使此試劑盒適合于診斷的目的。標記物優(yōu)選地可選自熒光染料、酶、化學發(fā)光和放射活性的標記物。
本發(fā)明方法的優(yōu)選用途是用于生產(chǎn)MHC，特別是無肽的MHC分子。穩(wěn)定的無肽MHC蛋白的優(yōu)選用途是用于分析MHC中改變一個氨基酸對該MHC結合特異性的影響，如通過應用肽文庫法分析所測定的，不論是合成的或者是重組的文庫。這樣一種MHC點突變的組合，隨后通過肽文庫進行特異性分析，可構成一種測定結構-功能相互關系的新型方法。本發(fā)明的另一些用途如下面所述。重組MHC I類分子的用途a)分析和診斷(特別是借助于ELISA和/或FACS)a.1)對肽-MHC相互作用的定量測定測定肽和MHC之間的相互作用是相當有價值的。對任何推定存在的T細胞抗原表位都應該檢驗其對MHC的結合，優(yōu)選地是進行定量測定。目前不良控制的檢測系統(tǒng)、缺乏空MHC分子和/或需要標記至少一種成分都阻礙了用于測定這種相互作用的方法?？辗肿邮歉呋钚缘模走\用于高度受控制的RIA類型的生物檢測系統(tǒng)(BuuS等1995)。空分子還適合于通過ELISA法檢測。在優(yōu)選的實施方案中，這種ELISA包括泛-特異性的抗-MHC抗體的捕捉和泛-特異性的抗-MHC抗體的檢測，隨后是高靈敏度、定量的非放射活性檢測。其它的ELISA檢測方案(例如包括親和性標記的)也是本領域技術人員已知的。
a.2)對用于定量和定性鑒定T細胞群的特異性T細胞的詳述1996年Mark Davis和其同事(Altman等1996)證明，用加入的附著于重鏈C-端的生物素化信號可產(chǎn)生重組體純肽-MHC I類復合物。在酶促生物素化過程之后，可用藻紅素標記的鏈親和素使這些復合物四聚體化。然后可按肽特異性的、MHC I限定的方式將這些多聚體化的標記的肽-MHC I類復合物用于標記T細胞。一般認為對于肽-MHC I復合物T細胞受體的穩(wěn)定性太低，不能引起穩(wěn)定的生物化學結合。但是四聚體化之后，多聚體化復合物的親合性足夠引起生物化學結合。因此，借助于熒光激活的細胞分選儀(FACS)的分析，可將這種四聚體用于對任何給定的細胞懸液中T細胞的數(shù)目進行計數(shù)。此后表明，用于計數(shù)特異性T細胞的老方法，有限稀釋分析法非常不準確，并會過低估計特異性T細胞的數(shù)目。因此不論從科學的觀點而且從公布文獻的觀點進行“四聚體”分析都已成必需的。Davis的方法具有二個主要的問題難以產(chǎn)生大量的純MHC I分子，以及生物素化過程是昂貴、麻煩的，特別是需要在37℃持續(xù)地溫育。許多肽在此溫育的后期確實仍然結合于MHC I，這可能解釋即使在相同的實驗中結果易變的原因。本專利申請公開了一種方法，按照此方法可以快速有效地產(chǎn)生肽-MHC復合物，致使復合物形成后只要作最小的修正。預期按照本發(fā)明方法產(chǎn)生的MHC I分子經(jīng)得起作為商品試劑盒的運輸和貯存的考檢，它還進一步允許在任何非專門的實驗室，用最后使用者選擇的任何相關肽生產(chǎn)最終的肽-MHC I復合物。相比之下，以前生產(chǎn)MHC I的方法可能要求有相當多的蛋白質(zhì)和分子生物學知識以及經(jīng)驗。最后可以預期有許多比酶促生物素化法更好的方法能用于標記MHC I(Gallimore等1998，Walter等1998)。
a.3)對使免疫處理可受到精確監(jiān)控的特異性T細胞的詳述任何免疫處理(例如免疫接種)都需要精確和特異性的監(jiān)控。上述的“四聚體”技術是目前對免疫處理過程進行科學、臨床和商業(yè)評價的極好標準。
b)科學價值b.1)對MHC I分子特異性的功能和結構測定在產(chǎn)生T細胞介導的所有應答時MHC I分子是主要的角色。相當多的努力都是針對理解MHC I分子的功能和特異性。在所有這些場合都需要獲得有功能活性的MHC I分子。從天然來源產(chǎn)生MHC I分子有幾個嚴重的缺點(麻煩、昂貴的生產(chǎn)過程，還會產(chǎn)生少量不純的MHC I)。在此公開的方法使有可能簡便、快速和高效率地產(chǎn)生肽-MHC I復合的。以前用于產(chǎn)生肽-MHC I復合物的方法包括對處于重折疊過程中的MHC I提供過量肽的步驟(Garboczi等1992)。因此所形成的復合物被肽預先占據(jù)了，不能很快地重新進行肽結合。按照在此公開的方法可以將所產(chǎn)物的MHC I分子立即用于結合肽，并因此可用于對肽結合進行任何一種分析，包括將異性分析。重組MHC I分子與最近公布的肽文庫法相結合(Stryhn等1996)，研究者可仔細地測定包括突變MHC I分子在內(nèi)的任何MHC I子的特異性。應該著重指出的是，這種詳細的分析還導致提高了對肽結合的預測(Styrhn等1996)。
b.2)對T細胞特異性的功能和結構測定通過在此公開的方法可快速有效地產(chǎn)生純肽-MHC I復合物。這種復合物可在T細胞受體與該肽-MHC I復合物相互作用時用于分析此T細胞受體的結構，并且應用肽變異體或MHC I變異體還可能對T細胞變體的特異性進行功能分析。
b.3)對特異性T細胞的處理(誘導或阻斷)在此公開的肽-MHCI復合體能夠與給定靶細胞的T細胞受體相互作用。為了刺激此細胞，它的T細胞受體必須被交聯(lián)。因此可以預料，多聚體化的肽-MHCI復合物(如“四聚體”)可能刺激適合的肽特異性的MHC I-限制性T細胞，而可溶性肽-MHC I復合物可能阻斷這種細胞。
b.4)對免疫處理(如免疫接種)特異性作用的監(jiān)測在技術得到進一步改善之前，任何關于如何操縱T細胞免疫系統(tǒng)的研究都依賴于現(xiàn)存的“四聚體”(或類四聚體)技術?？梢跃_、簡便地測定其誘導預測的特異性應答的能力，并且借助于現(xiàn)代的FACS分析技術可更進一步分析哪些亞群受到影響和程度如何。因此四聚體技術對于免疫處理的未來發(fā)展將是必不可少的。
b.5)純化特異性T細胞四聚體將使對肽特異性的MHC I限制性T細胞的有效純化成為可能。作為例子，如果此四聚體通過它們的生物素被偶聯(lián)于順磁性微珠，那末使用一個磁體就可比較直接了當?shù)丶兓湎鄳奶禺愋訲細胞。然后此特異性T細胞可被洗脫出，用于分析或被擴展并被用于進一步的免疫處理(例如適應性T細胞轉移)。與目前極端麻煩和緩慢的克隆技術相比較這可能成為一個巨大的改進。
c)治療用途c.1)疫苗的開發(fā)對疫苗開發(fā)的作用可被粗略地細分為直接的和間接的作用。所公開技術的直接作用可能是將b3中所述的原理用于治療，在此，基于按刺激性方式(交聯(lián)成“四聚體”或在微珠上等)所給予的被分離的富有肽的MHC I分子，預期將高度特異性并非常有效地激活特異性T細胞(隨后是激活免疫系統(tǒng))。間接的作用是由改進對候選疫苗的鑒別引起的，這種改進將是本公開技術的結果。通過使其能夠對人全部MHC I分子進行大批量詳細地分析，將改善對能夠結合于MHC的病原體來源肽的預測，并且有可能容易地證實這種預測(MHC特異性抗原表位分析)。
c.2)對自身免疫性疾病的治療對治療自身免疫疾病的作用可被粗略地細分為直接的和間接的作用。所公開技術的直接作用可能是將b3中所述的原理用于治療，在此，基于按非刺激性方式(即作為可溶性的非交聯(lián)復合物)所給予的被分離的富有肽的MHC I分子，預期將導致高度特異性地阻斷特異性T細胞(隨后是阻斷免疫系統(tǒng)的重要部分)。間接的作用是由改進對誘發(fā)自身免疫性疾病的候選物的鑒別引起的，這種改進將是本公開技術的結果。通過使之能夠對人全部MHC I分子進行大批量詳細地分析，將改善對能夠結合于MHC的自身蛋白來源肽的預測，并且有可能容易地證實這種預測。
c.3)純化T細胞用于適應性轉移可以用“四聚體”特異性地標記T細胞，因此也可以對它進行挑選(即通過磁性微珠)，獲得具有預定特異性的純T細胞群制備物。然后可以使這種T細胞群擴展用于例如針對感染性疾病或致癌性疾病的適應性轉移(adoptivetransfer)。
c.4)治療癌癥許多癌癥與突變的致癌基因/腫瘤抑制基因有關，或者與不良調(diào)控的致癌基因/抑制基因有關。形成的細胞代謝改變可被免疫系統(tǒng)發(fā)覺?，F(xiàn)在有例子表明，不良調(diào)控可導致完全正常的自身蛋白水平發(fā)生改變。但是在這種情況下已證明自身蛋白水平的改變使它變得具有致免疫性和腫瘤排斥作用(Vierboom等1997)。作為例證但不局限于這些例證，借助于基因分析(例如“單鏈構象多態(tài)性”，“選擇性聚合酶鏈式反應”或“差異展示”)或者蛋白質(zhì)分析(質(zhì)譜驅動的蛋白質(zhì)分析)可發(fā)現(xiàn)這種突變和不良調(diào)控?？梢詫θ魏芜@樣鑒定的蛋白質(zhì)進行上述的MHC特異性抗原表位分析，并可如c1和c3所詳述的嘗試對癌癥進行特異性治療。
泳道1如所指示的標準參照物。泳道2誘導前的細胞蛋白質(zhì)。泳道3誘導后3小時的細胞蛋白質(zhì)。泳道4用陰離子交換層析純化后的重組HLA-A*0201。圖2非還原條件下在15％SES-PAGE中分析的重組HLA-A*0201重鏈的陰離子交換組分，此重鏈是來自尿素溶解的包涵體蛋白。分析了與純化肽結合單體相應的組分(在上端標明了組分號，與圖中相對照)。顯示重組HLA-A*0201象二種大約31-32kD的不同蛋白質(zhì)一樣遷移；蛋白帶2a和3都具有完整的二硫鍵。圖3存在或不存在DTT時對純化的重組HLA-A*0201分子的SDS-PAGE分析。泳道1通過稀釋法折疊(非還原的方法)得到的高度純化的和功能性HLA-A*0201重鏈。泳道2和3在非還原條件下陰離子交換的HLA-A*0201重鏈(蛋白帶2a和3)。在泳道3顯示二條蛋白質(zhì)帶通過存在于泳道4中的還原劑被部分地還原成蛋白帶1。泳道4在還原條件下陰離子交換的HLA-A*0201重鏈，顯示出蛋白質(zhì)帶1，它比蛋白帶2a和3遷移更緩慢。圖4對洗脫量蛋白質(zhì)分析的陰離子交換組分和相對應的肽結合能力。由BCA確定濃度并在OD562下(實線)測定。還對相同的組分測定了肽結合。對柱加樣的大約30％蛋白質(zhì)總量沒有結合(堿性的或中性帶電的蛋白質(zhì))。這些蛋白質(zhì)與同包函體共純化的細菌本底蛋白質(zhì)相對應。用大約200mM的NaCl洗脫重組HLA-A*0201分子，并通過肽結合分析(虛線)和SDS-PAGE分析(圖3)進行鑒定。圖5用特異性抗體免疫沉淀重組HLA-A*0201分子。
在4℃將重組HLA-A*0201重鏈、b2m和放射性標記肽的復合物與抗HLA-A*0201，H-2Kk或H-2Dh分子的單克隆抗體共同孵育。然后加入蛋白A沉淀免疫復合物。反復洗此沉淀并作放射性記數(shù)。只有HLA-A*0201特異性的抗體BB7.2和W6/32能沉淀結合了放射性標記肽的重組HLA-A*0201。在重組HLA-A*0201與具有無關特異的抗體之間不存在可測定出的相互作用。圖6與重組HLA-A*0201重鏈結合的肽。
將逐漸增加劑量的重組HLA-A*0201重鏈與b2m(1μM)的微量放射性標記的肽(2nM)在18℃共溫育4小時。借助于G25旋轉柱層析測定復合物形成的程度。圖7肽與重組HLA-A*0201相互作用的親和性。
將5nM重組HLA-A*0201與微量放射性標記的肽和b2m(1μM)以及分別具有對HLA-A*0201和H2-Kk特異性的逐漸增加濃度的未標記肽共同溫育。在18℃共溫育這些反應物4小時，并借助于G25旋轉柱層析測定復合物形成的程度。將結合的配體濃度對結合與游離配體之比作圖得到Scatchard直線圖(插入圖)。圖8對重組HLA-A*0201的b2m依賴性肽結合。
將重組HLA-A*0201重鏈與微量肽和如所示的逐漸增加濃度的人和小鼠b2m共溫育。在18℃溫育此反應物4小時，并借助于G25旋轉柱層析測定復合物形成的程度。圖9逐漸增加劑量的重組HLA-A*0201重鏈與放射標記的人b2m在有或沒有特異性肽(10μM)存在時，在18℃共溫育4小時。將此反應物在18℃溫育4小時之后，借助于G50旋轉柱層析測定復合物形成的程度。

圖10b2m從重組HLA-A*0201復合物中的離解。將旋轉柱層析純化的重鏈和帶有或不帶有肽的放射標記b2m的復合物與3μM未標記的b2m混合，并在4℃溫育所指定的時間。借助于葡聚糖凝膠G50旋轉柱層析測定離解的程度。圖11通過FACS分析評估的四聚體染色。被分析的細胞是CD8陽性的T細胞，此T細胞是來自攜帶有對與H-2Db結合的KAVYNFATM肽特異性的T細胞受體轉基因的小鼠，或者是來自非轉基因對照H-2Db小鼠。以藻紅素-鏈親合素形成的四聚體進行分析，此四聚體包含與重組H-2Db和生物素化b2m復合的相關的KAVYNFATM肽，或者帶有與重組H-2Db和生物素化b2m復合的無關的FAPGNYPAL肽。以在x-軸上的四聚體染色和y-軸上的CD8染色進行FACS分析。在右上四邊形中可見陽性四聚體和CD8陽性細胞的數(shù)量。對方框右邊計算四聚體和CD8都為陽性的細胞總百分數(shù)，并在右上四邊形中直接給出。
T細胞復合物 ％四聚體+和CD8+圖11A 相關的 相關的53％圖11B 相關的 無關的2％圖11C 無關的 相關的1％圖11D 無關的 無關的3％
在pGMT7載體(pET衍生載體)中的重組H-2Db來自Dr Gallimore的友好贈送。將含有H-2Db的質(zhì)粒轉化進入大腸桿菌BL21菌株(DE3)(Novagen)，在含有100μg/ml氨芐青霉素的200ml Luria-Bertani培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)。為了制備在含有100μg/ml氨芐青霉素的200mlLuria-Bertani培養(yǎng)基中接種來自過夜培養(yǎng)物的這種細胞，并在37℃培養(yǎng)。
用0.4mM異丙基-b-D-硫代半乳糖苷(IPTG)在對數(shù)生長中期(A600-0.6)誘導蛋白質(zhì)表達。3小時后通過離心收細胞。將此細胞懸浮于含有1mM EDTA的10ml20mM，pH8.0的tris緩沖液中，-20℃保存。分離包涵體和純化重組HLA-A2*01 I類重鏈在含有溶菌酶(100μg/ml)，EDTA(1 mM)，PMSF(50μg/ml)的10ml20mM pH8.0的tris緩沖液中借助于超聲處理破裂冷凍的細胞制備物(來自200ml培養(yǎng)物的)，并在室溫下溫育20分鐘。隨后加入DNA酶(10μg/ml)和MgCl(10mM)。放置一段時間之后通過以10000g離心15分鐘部分地純化包涵體。在tris緩沖液內(nèi)洗含有包涵體的沉淀3次。最后通過在含有PMSF和EDTA的3ml8M尿素、20mM tris pH8.0的溶液中4℃溫育2小時使沉淀溶解。通過離心除去不溶解的物質(zhì)。收集此上清液，使之通過孔徑0.22μm的濾器然后保存在-80℃。這些制備物含有HLA-A*0201I類重鏈，根據(jù)SDS-PAGE測定此重鏈具有大約60-80％的純度。用陽離子交換(速流、Pharmacia)柱(1×25 cm)純化了此HLA-A*0201I類重鏈。用8M尿素、pH8.0的20mM tris緩沖液將含有部分純化重鏈的制備物稀釋5倍，并對此離子交換基質(zhì)加樣。用20ml8M尿素、pH8.0的20mM tris緩沖液洗柱，然后以在8M尿素、pH8.0的20mM tris緩沖液配制的0-500mM NaCl梯度液洗脫蛋白質(zhì)。通過BCA蛋白測定，SDS-PAGE分析和肽結合能力監(jiān)測被洗脫的蛋白質(zhì)。將含有高度純化的重鏈蛋白質(zhì)單體的組分和具有高度肽結合能力的組分合并在一起，保持于-80℃。111.4b2m和單克隆抗體的純化按以前所述方法(Pedersen等1995)制備并純化了重組人和小鼠b2m。以腹水的形式制備了單克隆抗體W6/32(α-HLA I類)、BB7.2(α-HLA-HLA-A*0201)、11-4.1(α-Kk)、S13-29(α-Kk)、28-14-8S(α-H-2Db)，和B22-249(α-H-2Db)，并通過蛋白A層析進行了純化(這些雜交瘤大多數(shù)來自ATCC)。放射性碘化標記b2m和肽通過反相HPLC層析純化HLA-A*0201和H-2Db特異性肽，并被冷凍干燥。按以前所述的方法(Olsen等1994)放射標記此肽(1-2μg)，達到60mCi/μg的比活性?？山Y合于重組的或天然MHC I類的被標記肽的百分率通常是80％。電泳用均質(zhì)的聚丙烯酰胺凝膠(15％)進行一維的小型SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)。在SDS-PAGE分析之前先在加入或不加入50mM DTT的Laemmli樣品緩沖液中將樣品煮沸。用Coomassie蘭R-250對蛋白質(zhì)染色。肽對重組HLA-A*0201 I類分子的結合(示蹤結合)對來自陰離子交換純化的變性重組HLA-A*0201重鏈測定其在b2m存在時結合肽的能力?；旧先缤ㄟ^稀釋測定(Garboczi等1992)實施肽對重組重鏈的結合-不同的是放射標記肽的量是示蹤量即大約2nM。通常是在下述的折疊緩沖液中將取自離子交換純化組分的1μl變性的重鏈液稀釋100倍。溫育此反應物至少4小時。借助于葡聚糖凝膠G25旋轉柱層析(Buus等1995)檢測肽的結合。所有的實驗都進行了二次或二次以上。揭示出由20mM tris pH7、150mM NaCl、1mM EDTA、50μg/ml PMSF、1μM b2m和1-2nM示蹤肽組成的最佳折疊緩沖液可優(yōu)化肽對重組H-2Db和HLA-A*0201的結合。值得注意的是，經(jīng)典的折疊劑如L-精氨酸和細菌伴侶蛋白如GRO-EL/ES對此肽結合沒有負面影響(資料未顯示)。正常濃度范圍的GSH/GSSG例如1.8mM/0.2mM對此肽相互作用沒有影響。在4℃-37℃溫度范圍內(nèi)的肽結合分析表明18℃有最佳的結合。在pH5.5-9的范圍內(nèi)肽結合分析表明在pH6.5-7.5有最佳的結合。動力學研究顯示在18℃4小時溫育之后達到示蹤肽結合平衡。功能性HLA-A*201 I類分子的產(chǎn)生(遞增性折疊)通過在折疊緩沖液(如上面)中100倍稀釋使變性的和純化的HLA-A*201重鏈制備物(300-600μg/ml)折疊，對它加入肽達到大約10μM的濃度。應用具有大約10kD阻隔孔徑的Amicon濾器在4℃將此反應物濃縮10-20倍。在4℃保溫此濃縮物1小時，然后在15000g離心15分鐘。進一步使用具有大約3kD阻隔孔徑的Centricon裝置在4℃濃縮其上清液。反復離心后將上清液對大小排阻層析柱(葡聚糖凝膠G50)加樣，除去游離的b2m和肽。合并含有功能性HLA-A*201I類的組分，并濃縮至大約1mg/ml的濃度。結果對變性的重組HLA-A*201重鏈的表達和純化用基本上如Garboczi等(Garboczi等1992)所述的方法表達并部分地純化重組HLA-A*0201和H-2Db。在大約0.6的細胞濃度用0.4mM IPTG誘導細胞并在37℃溫育3小時。以15％SDS-PAGE凝膠分析在加入和未加入IPTG時煮沸和還原樣品的遷移率。估計重組HLA-A*0201的產(chǎn)率是大約50-50ml/L培養(yǎng)物，相當于圖1中泳道3大約33kD的主要蛋白帶。
為了分離包涵體通過超聲波處理使此細胞破裂。離心此表達重組重鏈的細胞(來自200ml培養(yǎng)物)，并使沉淀在含有20mM tris、pH8、溶酶體、PMSF和EDTA的緩沖液中再溶解。隨后加入DNA酶和MgCl2。待此溶液放置一段時間之后(20-30分鐘，22℃)離心沉淀出包涵體。在tris緩沖液pH8中洗沉淀3次，最后在8M尿素中再溶解并保存在-80℃。
應用陽離子交換層析將來自包涵體的部分純化的蛋白質(zhì)進一步分級分離。進行這一純化步驟的原因是為了使制備物有效地富集高度折疊的重組HLA-A*0201分子，并避免異質(zhì)性(少量污染物，在細菌中對重鏈的少量酶促改變等)。
以梯度(0-500mM)NaCl洗脫單體重組HLA-A*0201。分別在大約200mM和350mM NaCl洗脫出了重組HLA-A*0201和H-2Db重鏈單體。以SDS-PAGE分析了此純化重鏈的純度、濃度和功能性(圖1泳道4和圖2)，并進行了BCA-蛋白質(zhì)測定試驗和示蹤蛋白質(zhì)結合分析(圖4)。
陰離子-交換純化和非還原性SDS-PAGE分析表明，從分離的包涵體中溶解的大多數(shù)，如果不是全部，重組HLA-A*0201蛋白被氧化了，即含有二硫橋。如圖2中顯示的，在非還原性SDS-PAGE分析中洗脫出的重組HLA-A*0201重鏈遷移成二個不同的帶(此后分別被分稱為2a和3)。應用大小排阻層析、離子-交換層析或疏水性層析我們都未能使蛋白質(zhì)2a與蛋白質(zhì)3分開。在還原性條件下，此二種HLA-A*0201重鏈像一個單獨的蛋白帶——被稱為帶1，緩慢地共-遷移(圖3，將電泳道2和3與電泳道4相比較)。此蛋白帶相當于圖1中占優(yōu)勢的HLA-A*0201蛋白帶(電泳道3)。總之此蛋白質(zhì)仿佛是帶有完整的二硫橋包裹在包涵體內(nèi)，導致成為至少二個不同的單體。如下面所述的折疊實驗清楚地表明，只有蛋白帶2a折疊成為功能性重組HLA-A*0201復合物(圖3，比較泳道1和2)。在通過稀釋法的折疊過程中蛋白帶3錯誤折疊并聚集。推測蛋白帶2a包含正確的二硫橋，而蛋白帶3是不正確的。使放射標記的肽化學交聯(lián)于重組HLA-A*0201重鏈還發(fā)現(xiàn)此蛋白帶2a為肽受體(資料未被顯示出)。
包裹在包涵體內(nèi)的蛋白質(zhì)快速遷移似乎是普遍現(xiàn)象。在非還原性SDS-PAGE分析中我們已觀察到多種不同蛋白質(zhì)的較快速的遷移，如人b2m、CD3復合物蛋白質(zhì)γ-和ε-鏈的功能區(qū)、H2-Kk、MHC II類的α-和β-鏈。在非還原性條件下重組H-2Db分子以比較高的速度遷移(資料未被顯示出)。與HLA-A*0201重鏈相比較，非還原的H-2Db重鏈像在還原性SDS-PAGE分析中較緩慢遷移的一條單獨的快速遷移帶一樣遷移(資料未被顯示出)。放射標記的肽對部分純化的變性重組HLA-A*201重鏈的結合對通過陽離子交換層析分級分離的重組重鏈測定了它們結合在通過稀釋法(見材料和方法)折疊過程中加入的放射標記特異性肽的能力。如圖4中顯示的，在重組HLA-A*0201重鏈單體的單體存在(帶2a和帶3)與肽結合能力之間存在良好的相關性。在即使存在GSH/GSSG時進行生物化學純化之后，從具有還原劑(大于0.1mM DTT)的尿素制備物中得到的純化重鏈不與肽結合。因此，肽結合的能力與具有預先形成的二硫橋的重鏈有關。
重組HLA-A*0201和重組H-2Db重鏈都可結合特異性放射配體，這種放射配體可被特異性肽抑制，但不能被非-結合性肽抑制。復合物中具有放射標記肽的重組HLA-A*0201可用抗HLA-A*0201的特異性抗體使之沉淀，但是用抗H2-Kk和H-2Db分子的抗體不能使之沉淀，表明產(chǎn)生了正確的HLA-A*0201(圖5)。放射標記的肽對高度純化的變性重組HLA-A2*201重鏈的結合使用放射標記的肽和放射標記的b2m評價了從具有預先形成的二硫橋的變性狀態(tài)重鏈功能性MHC I類的產(chǎn)生。通過用8M尿素變性功能性重組HLA-A*0201獲得了與蛋白帶2a相對應的完全純化的HLA-A*0201重鏈。在含有8M尿素的20mM tris pH8緩沖液中通過大小排阻層析(葡聚糖凝膠G50)對此變性的蛋白質(zhì)作分級分離，重鏈被收集在空隙體積中。
通過在上面所述的折疊緩沖液中稀釋進行放射標記配體(肽或b2m)的結合。劑量響應曲線(圖6)顯示在折疊過程中放射標記的肽對變性重鏈非常有效和靈敏的結合。相比之下常規(guī)親和性純化的MHC I類分子為了結合相似量的肽需要10-50倍的較高濃度。
以抑制試驗和Scatchard分析對肽結合的高效率進行了分析。如圖7所示，重組HLA-A*0201只與特異性肽相互作用。Scatchard分析(圖7插入框)顯示出完全直線的Scatchard作圖，親和平衡常數(shù)是大約30nM。重要的是，活性受體的百分率大約是輸入蛋白質(zhì)的80-90％。因此，此HLA-A*201重鏈是完全活性的，沒有被來自細菌或由任何后續(xù)操作步驟產(chǎn)生的肽預先占據(jù)。相比之下，常規(guī)親和性純化的MHC I類制備物被具有通常是2％的有限數(shù)量活性受體的肽預先占據(jù)了。
肽結合是非常地取決于b2m。如圖8所示，對結合反應加入逐漸增加劑量的b2m可促進放射標記肽的結合。不存在b2m時完全阻止了肽對重鏈的結合。也有相反的反應，即b2m對重鏈的結合也顯示出對特異性肽存在的某些依賴性(圖9)。因為b2m在沒有肽時確實與重鏈結合了，雖然是以較低的親和性，所以肽不是絕對的需要。
在動力學研究中進一步分析了肽對b2m相互作用的影響。在有或沒有特異性肽存在時分析了由放射標記b2m和重鏈組成的HLA-A*201復合物的離解速度。異二聚體復合物即在沒有特異性肽存在時形成和保持的復合物37℃以大約4小時的半壽期迅速地離解。三聚體肽-b2m-重鏈復合物即在有肽存在時形成或保持的復合物比較穩(wěn)定，半壽期大約是14小時。因此肽可穩(wěn)定b2m的結合。我們的結論是，通過變性重鏈和b2m之間的初級相互作用可形成HLA-A*201復合物。此相互作用可產(chǎn)生異二聚體，它表現(xiàn)出高親合性的肽結合位點。肽本身又可增加被結合b2m分子的親和性，導致形成穩(wěn)定的功能性HLA-A*201復合物。功能性HLA-A*0201的產(chǎn)生收集具有高度肽結合能力的組分(大約15ml相當于含有單體重鏈組分的60-70％)并合并在一起用于產(chǎn)生(折疊)功能性HLA-A*0201分子。在上述的折疊緩沖液中稀釋重組HLLA-A*0201重鏈。將1ml500μg部分純化的重鏈(相當于大約13ml細菌培養(yǎng)物)加到99ml緩沖液中，并立即用具有大約10kD阻隔孔徑的Amicon濾器濃縮。將5-10ml濃縮液(在1小時內(nèi)獲得的)在4℃保溫1小時，然后以15000g離心除去聚集物。收集上清液并用具有大約3kD阻隔孔徑的Centricon裝置進一步濃縮至大約150-200μl。再一次離心之后應用滯留游離b2m和肽的大小排阻層析(G50)純化此折疊的HLA-A*0201。將含有所集中的HLA-A*0201的組分合并在一起并用Centricon裝置濃縮至最后的濃度大約1mg/ml。從加入的變性蛋白質(zhì)的量計算，折疊效率大約是40-50％。通過整個過程功能性HLA-A*0201的產(chǎn)率相當于大約10mg功能性HLA-A*0201/L細菌培養(yǎng)物。整個折疊和純化過程可在24小時內(nèi)完成。注意折疊過程中未加入常規(guī)的作用劑如L-精氨酸和GSH/GSSG。前者抑制具有預先形成二硫橋的變性HLA-A*0201重鏈的折疊。后者不影響此結果。已在SDS-PAGE中常規(guī)地測定了此折疊的重組HLA-A*0201分子(圖3)，并用特異性抗體測定了其反應性(圖5)。最近將使用生物素化的b2m通過此程序產(chǎn)生的重線H-2Db復合物用鏈親合素進一步裝配成了寡聚體復合物。此寡聚體化的(“四聚體”)H-2Db復合物已被用于特異性T細胞的FACS染色(圖11)，以及用于當通過共焦顯微鏡檢測時染色T細胞。后者證明了其特異性的結合和內(nèi)在化作用。
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權利要求
1.一種產(chǎn)生功能性免疫球蛋白超家族蛋白的方法，此蛋白質(zhì)在有功能時具有至少一個二硫鍵，此方法包括如下步驟(ⅰ)提供一種包含編碼此蛋白質(zhì)基因的細菌細胞，此基因在該細胞中可表達，(ⅱ)在使此基因表達的條件下培養(yǎng)此細胞，(ⅲ)從該細胞中分離出此蛋白質(zhì)而不還原它，(ⅳ)使分離出的蛋白質(zhì)經(jīng)受折疊處理。
2.一種產(chǎn)生多種功能性蛋白質(zhì)的方法，其中包括至少一種是來自免疫球蛋白超家族的蛋白，并且此多種功能性蛋白質(zhì)在有功能時具有至少一個分子間和/或一個分子內(nèi)的二硫鍵，此方法包括如下步驟(ⅰ)提供一種細菌細胞，此細胞包含各編碼一種蛋白的多種基因，所有的基因都可在該細胞中表達，(ⅱ)在使這些基因表達的條件下培養(yǎng)此細胞，(ⅲ)從該細胞中分離出這些蛋白質(zhì)而不還原它們，(ⅳ)使分離出的蛋白質(zhì)經(jīng)受折疊處理。
3.一種產(chǎn)生功能性免疫球蛋白超家族蛋白的方法，此蛋白質(zhì)在有功能時具有至少一個二硫鍵，此方法包括如下步驟(ⅰ)提供一種包含編碼該蛋白質(zhì)基因的細胞，此基因在該細胞中可表達，此蛋白質(zhì)是作為一個聚集體被表達，(ⅱ)在使該基因表達的條件下培養(yǎng)這種細胞，(ⅲ)從細胞中分離出此蛋白質(zhì)聚集體而不還原它，(ⅳ)使分離出的蛋白質(zhì)經(jīng)受折疊處理。
4.根據(jù)權利要求1-3中任何之一的方法，其中按照本方法產(chǎn)生的功能性蛋白質(zhì)的產(chǎn)率，相對于在基本類似的條件下但其中是在還原條件下實施步驟(ⅲ)所得到的功能性蛋白質(zhì)的產(chǎn)率增加至少10％，例如至少20％、至少40％、至少50％、至少70％、或至少100％。
5.根據(jù)權利要求1-4中任何之一的方法，其中當在非還原條件下實施步驟(ⅲ)時，本方法的速度與在還原條件下實施步驟(ⅲ)時相比較至少快10％。
6.根據(jù)權利要求1-5中任何之一的方法，其中按照本方法產(chǎn)生的功能性蛋白質(zhì)的純度，相對于在基本上類似的條件下但其中是在還原條件下實施步驟(ⅲ)所得到的功能性蛋白質(zhì)的純度增加至少10％。
7.根據(jù)權利要求1-6中任何之一的方法，其中的蛋白質(zhì)是選自如下種類的免疫球蛋白超家庭蛋白抗體、免疫球蛋白可變(V)區(qū)、免疫球蛋白恒定(C)區(qū)、免疫球蛋白輕鏈、免疫球蛋白重鏈、CD1、CD2、CD3、I類和II類組織相容性分子、β2微球蛋白(β2m)、淋巴細胞功能相關的抗原-3(LFA-3)和FcγRIII、CD7、CD8、Thy-1和Tp44(CD28)，T細胞受體、CD4、多免疫球蛋白受體、神經(jīng)細胞粘附分子(NCAM)、髓鞘相關糖蛋白(MAG)、髓鞘P蛋白、癌胚抗原(CEA)、血小板衍生生長因子受體(PDGFR)、集落刺激因子-1受體、αβ-糖蛋白、ICAM(細胞間粘附分子)、血小板以及白介素。
8.根據(jù)權利要求1-7中任何之一的方法，其中的免疫球蛋白超家庭蛋白是例如脊椎動物蛋白質(zhì)，如人、鼠、大鼠、豬、?；蝤B類的蛋白質(zhì)。
9.根據(jù)權利要求1-8中任何之一的方法，其中的免疫球蛋白超家庭蛋白是MHC。
10.根據(jù)權利要求9的方法，其中的HHC蛋白是人MHC。
11.根據(jù)權利要求9或10的方法，其中的MHC蛋白是選自重鏈、與β2m結合的重鏈、和功能性成熟MHCI類蛋白的MHCI類蛋白；或者是選自α/β二聚體和帶有肽的α/β二聚體的MHCII類蛋白。
12.根據(jù)權利要求9-11中任何之一的方法，其中是作為無肽的MHC蛋白得到所產(chǎn)生的MHC蛋白。
13.根據(jù)權利要求7-12中任何之一的方法，其中當折疊過程結束時可得到至少25％所產(chǎn)生的免疫球蛋白超家庭蛋白是有功能形式的。
14.根據(jù)權利要求1-13中任何之一的方法，其中步驟(ⅱ)的蛋白質(zhì)是作為包涵體產(chǎn)生。
15.根據(jù)權利要求1-14中任何之一的方法，其中是在不改變氧化還原狀態(tài)的非還原條件下實施步驟(ⅲ)。
16.根據(jù)權利要求1-15中任何之一的方法，其中該方法進一步包括在步驟(ⅳ)之前使從步驟(ⅲ)分離的蛋白質(zhì)經(jīng)受純化的步驟。
17.根據(jù)權利要求1-16中任何之一的方法，其中是在水基質(zhì)和至少一種緩沖化合物中實施折疊處理(ⅳ)。
18.根據(jù)權利要求1-17中任何之一的方法，其中是在基本上不存在還原劑如DTT的情況下實施折疊處理。
19.根據(jù)權利要求1-18中任何之一的方法，其中所表達的蛋白質(zhì)是處于細胞內(nèi)。
20.根據(jù)權利要求1-19中任何之一的方法，其中所表達的蛋白質(zhì)是處于細胞周質(zhì)中。
21.根據(jù)權利要求1-20中任何之一的方法，其中所表達的蛋白質(zhì)被轉移至細胞外。
22.根據(jù)權利要求1-21中任何之一的方法，其中是以糖基化的形式表達該蛋白質(zhì)。
23.根據(jù)權利要求1-22中任何之一的方法，其中是以磷酸化的形式表達該蛋白質(zhì)。
24.根據(jù)權利要求1-23中任何之一的方法，其中是在體外使該蛋白質(zhì)糖基化或磷酸化。
25.根據(jù)權利要求1-24中任何之一的方法，其中該蛋白質(zhì)不包含未配對的半胱氨酸殘基。
26.根據(jù)權利要求1-25中任何之一的方法，其中該蛋白質(zhì)包含1個未配的半胱氨酸殘基。
27.根據(jù)權利要求1-26中任何之一的方法，其中該蛋白質(zhì)包含至少2個、例如至少3個、至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個、至少10個、至少11個、至少12個、至少13個、至少14個、至少15個、至少16個、至少17個、至少18個、至少19個、或至少20個半胱氨酸殘基。
28.根據(jù)權利要求1-27中任何之一的方法，其中該蛋白質(zhì)包含偶數(shù)的半胱氨酸殘基。
29.根據(jù)權利要求1-28中任何之一的方法，其中該蛋白質(zhì)具有至多20個、例如至多14個、至多10個、至多8個、至多5個、至多4個、至多3個或至多2個半胱氨酸殘基。
30.根據(jù)權利要求1-29中任何之一的方法，其中該蛋白質(zhì)能夠具有至少1個、例如至少2個、至少3個、至少4個、至少5個或至少6個二硫鍵。
31.根據(jù)權利要求1-30中任何之一的方法，其中該蛋白質(zhì)能夠具有至多20個、例如至多15個、至多10個、至多8個、至多5個、至多4個、至多3個或至多2個二硫鍵。
32.根據(jù)權利要求3-31中任何之一的方法，其中的細胞是選自細菌細胞、真菌細胞、酵母菌細胞、動物細胞和植物細胞。
33.根據(jù)權利要求1-32中任何之一的方法，其中的細胞是選自革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的細菌細胞。
34.根據(jù)權利要求33的方法，其中的革蘭氏陰性菌是大腸桿菌，包括BL21侏或它的衍生株或者XA90株或它的衍生株。
35.根據(jù)權利要求1-34中任何之一的方法，其中的細胞經(jīng)遺傳修飾，與未經(jīng)修飾和同株細胞相比它具有較弱的細胞內(nèi)還原環(huán)境。
36.根據(jù)權利要求1-35中任何之一的方法，其中的細胞已被修飾具有降低的或者缺乏硫氧還蛋白還原酶或對細胞質(zhì)硫氫基還原潛力具有相似作用酶的活性。
37.根據(jù)權利要求1-36中任何之一的方法，其中該修飾的細胞是trxB突變株。
38.根據(jù)權利要求1-37中任何之一的方法，其中的基因是天然存在基因的衍生物。
39.根據(jù)權利要求38的方法，其中通過取代至少一個密碼子可獲得該衍生物，此密碼子與原來存在的編碼相同氨基酸的密碼子相比較更經(jīng)常地被宿主細胞利用。
40.根據(jù)權利要求1-39中任何之一的方法，其中該基因是在天然狀態(tài)不與此基因結合的調(diào)節(jié)性DNA序列的控制之下。
41.根據(jù)權利要求1-40中任何之一的方法，其中是以選自pET載體例如T7啟動子的表達載體轉化該細胞細胞。
42.一種穩(wěn)定的無肽MHC蛋白，可通過權利要求1-41中任何之一的方法獲得。
43.一種包含MHCI類重鏈和β2m的試劑盒，它能夠使其接受者產(chǎn)生和測定或檢測出功能性MHCI類蛋白，對此蛋白可以加入能夠結合于該MHC I類蛋白而導致形成此功能性MHC I類蛋白的肽。
44.根據(jù)權利要求43的試劑盒，它包括對一種或幾種MHC I類亞單位(重鏈、b2m和/或肽)的標記，以便測定或檢測MHC I類蛋白的產(chǎn)生。
45.根據(jù)權利要求43和44的試劑盒，其中對所產(chǎn)生MHC I類蛋白的測定或檢測系統(tǒng)可選自如下技術放射-配體、免疫沉淀、ELLSA、胞質(zhì)團共振、熒光極化、分析超離心、生物化學沉淀、超過濾、層析和平衡透析技術。
46.根據(jù)權利要求43-45的試劑盒，它包含低聚合的MHC蛋白，例如2個、3個、4個或更多MHC蛋白的低聚合物。
47.根據(jù)權利要求43-46的試劑盒，其中加入了作為標記物的一種試劑，使此試劑盒適合于診斷的目的。
48.根據(jù)權利要求44-47的試劑盒，其中的標記物可選自生物素、熒光染料、酶、化學發(fā)光和放射活性的標記物。
49.根據(jù)權利要求1-41中任何之一的方法用于生產(chǎn)MHC的用途。
50.根據(jù)權利要求42的穩(wěn)定空MHC蛋白用于分析MHC中改變一個氨基酸對該MHC結合特異性的影響的用途，這種影響通過應用肽文庫法分析測定，合成的文庫或者是重組的文庫均可。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種產(chǎn)生功能性免疫球蛋白超家族蛋白的方法,此蛋白質(zhì)在有功能時具有至少一個二硫鍵,此方法包括如下步驟:提供一種包含編碼此蛋白質(zhì)的基因且此基因可在其中表達的細菌細胞;在使此基因表達的條件下培養(yǎng)此細胞;從該細胞中分離出此蛋白質(zhì)而不還原它;以及使分離出的蛋白質(zhì)經(jīng)受折疊處理。優(yōu)選地,此免疫球蛋白超家族蛋白是選自如下種類的蛋白質(zhì):抗體、免疫球蛋白可變(Ⅴ)區(qū)、免疫球蛋白恒定(C)區(qū)、免疫球蛋白輕鏈、免疫球蛋白重鏈、CD1、CD2、CD3、Ⅰ類和Ⅱ類組織相容性分子、β
文檔編號A61P37/02GK1326466SQ99813211
公開日2001年12月12日 申請日期1999年9月14日 優(yōu)先權日1998年9月14日
發(fā)明者拉斯·奧斯特加德·佩德森, 索仁·布斯 申請人:拉斯·奧斯特加德·佩德森, 索仁·布斯