專(zhuān)利名稱(chēng)：治療膿毒癥的方法
本申請(qǐng)要求于1998年10月22日提交的，臨時(shí)申請(qǐng)序列號(hào)為No.60/105,239的申請(qǐng)的優(yōu)先權(quán)。
本發(fā)明涉及醫(yī)療科學(xué)，尤其是利用蛋白C和殺菌通透性增加(BPI)蛋白所進(jìn)行的膿毒癥的治療。
蛋白C是一種絲氨酸蛋白酶和天然存在抗凝劑，其通過(guò)在凝聚級(jí)聯(lián)中滅活因子Ⅴa和Ⅷa，從而在止血中發(fā)揮其作用。人蛋白C以2-鏈酶原的形式在體內(nèi)循環(huán)，但經(jīng)凝血酶和細(xì)胞表面膜蛋白-凝血調(diào)控蛋白的限制性蛋白水解后，其將轉(zhuǎn)變?yōu)榛罨牡鞍證(aPC)，該蛋白會(huì)在內(nèi)皮和血小板表面起作用。
連同其他蛋白，aPC可能是以血液凝聚的最重要的負(fù)調(diào)節(jié)物起作用，故可防止血栓的生成。除了抗凝聚功能外，通過(guò)抑制細(xì)胞因子(如TNF和IL-1)的產(chǎn)生，aPC具有抗炎癥效果，并且aPC還有血纖維蛋白溶酶原的性質(zhì)，故可促進(jìn)血凝塊的裂解。因而，蛋白C酶系統(tǒng)代表了主要的抗凝聚，抗炎癥和血纖維蛋白溶解的生理學(xué)機(jī)制。
殺菌通透性增加蛋白(BPI)是從哺乳動(dòng)物多形核嗜中性細(xì)胞(PMNs)顆粒中分離得到的一種蛋白。通過(guò)酸提取和層析的方法(Elsbach,1979,J.Bio.Chem.254:11000；Weiss et al.1987,Blood69:652)，人們已從PMNs中分離得到人BPI，該蛋白具有有效的針對(duì)廣譜革蘭氏陰性菌的殺菌活力。除了具有針對(duì)革蘭氏陰性菌的殺菌作用外，BPI還能結(jié)合并中和脂多糖(LPS)。由于其刺激的炎癥應(yīng)答，LPS還被認(rèn)為是一種內(nèi)毒素。
膿毒癥，包括嚴(yán)重性膿毒癥和膿毒性休克，是對(duì)感染或外傷的系統(tǒng)性炎癥應(yīng)答，該應(yīng)答涉及并由眾多宿主防御機(jī)制的激活所介導(dǎo)，上述宿主防御機(jī)制包括細(xì)胞因子網(wǎng)，白細(xì)胞和補(bǔ)體，和凝聚/血纖維蛋白溶解系統(tǒng)。[Mesters，等Blood 88:881-886,1996]。散布的血管內(nèi)凝聚[DIC]具有多器官的微血管內(nèi)纖維蛋白的廣泛沉積的特征，其是膿毒癥和膿毒性休克的早期表現(xiàn)。DIC在多器官衰竭綜合癥的發(fā)生過(guò)程中是一種重要的介質(zhì)，并使膿毒性休克病人預(yù)后不良。[Fourrier,等Chest 101:816-823,1992]。
膿毒癥可由細(xì)菌(革蘭氏陰性菌或革蘭氏陽(yáng)性菌)，真菌，病毒和其他的感染，以及非傳染性刺激物如復(fù)合外傷，嚴(yán)重?zé)齻推鞴僖浦驳纫l(fā)。
雖然任何細(xì)菌感染均能導(dǎo)致膿毒癥，但其往往是與革蘭氏陰性菌感染有關(guān)。膿毒癥通常是從震顫、發(fā)燒、血壓下降，吸收和心跳加速，和皮膚損傷開(kāi)始。在數(shù)小時(shí)或數(shù)天內(nèi)，膿毒癥將發(fā)展成血管內(nèi)自發(fā)性凝塊，嚴(yán)重性低血壓，多器官衰竭和死亡。
多數(shù)損害源于內(nèi)毒素而不是侵染的細(xì)菌。內(nèi)毒素結(jié)合到細(xì)胞上如單核白細(xì)胞/巨嗜細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞并誘導(dǎo)他們產(chǎn)生多種類(lèi)型的介質(zhì)如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和多種白細(xì)胞介素(IL-1,IL-6和IL-8)，這一過(guò)程表明了其作用。過(guò)量TNF-α,IL-1,IL-6和IL-8能誘發(fā)膿毒性休克。
近來(lái)，有許多為治療人類(lèi)膿毒癥而進(jìn)行的嘗試，其中的絕大部分是使用阻斷與上述疾病病理生理學(xué)有關(guān)的炎癥介質(zhì)的試劑。然而，利用阻斷炎癥介質(zhì)的試劑所進(jìn)行的臨床研究還未成功[綜述見(jiàn)Natanson等Ann.Intern.Med 120:771-783,1994；Gibaldi,Pharmacotherapy13:302-308,1993]。由于參與炎癥的許多介質(zhì)是補(bǔ)償應(yīng)答的，因而具有有益的作用，故一些研究者認(rèn)為阻斷他們的作用可能是不合適的[如Parrillo,N.Engl.J.Med.328:1471-1477,1993]。
目前，已經(jīng)有數(shù)個(gè)利用蛋白C在膿毒癥的不同動(dòng)物模型中所進(jìn)行的令人鼓舞研究的相關(guān)報(bào)道。Taylor等[J.Clin.Invest.79:918-25,1987]利用活化的，來(lái)源于血漿的人蛋白C進(jìn)行了狒狒膿毒癥模型的研究。上述動(dòng)物進(jìn)行了預(yù)防性注射(如，在LD100E.coli兩小時(shí)注入之前，給上述動(dòng)物施用aPC)。全部的5個(gè)受試動(dòng)物均存活了7天，因而，認(rèn)為它們是實(shí)驗(yàn)方案的永久存活者。接受同樣E.coli注入的5個(gè)對(duì)照動(dòng)物在24-32小時(shí)內(nèi)全部死亡。此外，源于血漿的人蛋白C酶原作為挑戰(zhàn)傳統(tǒng)療法的成功的附屬物，可用于治療患有細(xì)菌性膿毒癥引發(fā)的急性紫癜的病人(Gerson等Pediatrics 91:418-422,1993；Smith等Thromb.Haemost,PS1709,p419,1997；Rintala等Lancet 347:1767,1996；Rivard等J.Pediatr.126:646-652,1995)。
重組BPI蛋白已表現(xiàn)出中和內(nèi)毒素的致死性和亞致死性的作用(Fisher等Crit.Care Med.,22(4):553-558,1994)，該內(nèi)毒素施用給了小鼠，大鼠和兔。由于具有中和內(nèi)毒素的能力和其針對(duì)革蘭氏陰性菌的殺菌活力，BPI能應(yīng)用于患有革蘭氏陰性菌所誘發(fā)疾病的病人的治療中，上述疾病包括菌血癥、內(nèi)毒素血癥和膿毒癥。
本發(fā)明首次描述了在膿毒癥治療中aPC和BPI的組合使用。aPC和BPI的組合使用產(chǎn)生了協(xié)同作用，該作用導(dǎo)致aPC和BPI用劑量的減少和接受治療的病人的臨床效果的改善。組合療法中藥量的減少降低了任一藥劑可能出現(xiàn)的負(fù)作用。因而，結(jié)合aPC的抗凝聚/抗炎癥性質(zhì)和BPI的殺菌與內(nèi)毒素中和的活力，可提供針對(duì)膿毒癥的有效的協(xié)同療法，該療法可減少或減輕副作用并可改善膿毒性病人的臨床效果。
本發(fā)明提供治療膿毒癥病人的方法，該方法包括給病人聯(lián)合施用藥學(xué)上有效量的蛋白C和殺菌通透性增加(BPI)蛋白。
本發(fā)明進(jìn)一步提供治療膿毒癥方法，該方法包括給病人施用藥學(xué)上有效量的BPI蛋白和活化的蛋白C，因而，血漿中活化的蛋白C的水平為約2ng/ml-約300ng/ml.
如本文所公開(kāi)和要求的，對(duì)本發(fā)明來(lái)說(shuō)，術(shù)語(yǔ)定義如下。
蛋白C是指維生素K依賴(lài)型絲氨酸蛋白酶，其具有抗凝聚、抗炎癥和纖維蛋白溶酶原的性質(zhì)，該蛋白包括，但不局限于，來(lái)源于血漿的和重組獲得的蛋白。蛋白C包括且優(yōu)選地是人蛋白C，盡管還可能包括具有其蛋白水解的、酰胺裂解的、脂水解的和生物學(xué)的(抗凝聚、溶解纖維蛋白和抗炎癥)活力的其他種類(lèi)的蛋白C或其衍生物。蛋白C衍生物的實(shí)例見(jiàn)于Gerlitz等人的美國(guó)專(zhuān)利No.5,453,373和Foster等人的美國(guó)專(zhuān)利No.5,516,650，其中的內(nèi)容在此均被引入作為參考。
酶原-即酶學(xué)上蛋白水解酶的無(wú)活性的前體。前述的蛋白C酶原是指分泌型的、無(wú)活性的形式，其具有蛋白C的一條或兩條鏈。
活化的蛋白C或aPC是指蛋白C酶原經(jīng)限制性蛋白酶解作用而轉(zhuǎn)化成具有活性的形式。蛋白C包括且優(yōu)選地是人蛋白C，盡管還可能包括具有其蛋白水解的、酰胺裂解的、脂水解的和生物學(xué)的(抗凝聚、溶解纖維蛋白和抗炎癥)活力的其他種類(lèi)的蛋白C或其衍生物。前述蛋白C的敘述中提及了蛋白C衍生物的實(shí)例。
r-hPC-重組人蛋白C酶原。
r-aPC-活化的重組蛋白C，優(yōu)選地，其是通過(guò)激活r-hPC或由原核細(xì)胞、真核細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物或植物直接分泌蛋白C的活化的形式而獲得，包括，例如，由人腎臟293細(xì)胞以酶原的形式分泌，再通過(guò)技術(shù)人員熟知的方法加以純化和激活，上述技術(shù)方法見(jiàn)于授于Yan的美國(guó)專(zhuān)利No.4,981,952和Cottingham,WO97/20043，上述兩項(xiàng)專(zhuān)利的內(nèi)容在此均被引入作為參考。
來(lái)源于血漿的活化的蛋白C-通過(guò)激活血漿蛋白C以制備活化的蛋白C。Eibl的美國(guó)專(zhuān)利No.5,478,558中有關(guān)于上述內(nèi)容的描述，其中的內(nèi)容在此被引入作為參考。
連續(xù)注入-在特定的一段時(shí)間內(nèi)，大體上連續(xù)地、不間斷地向靜脈內(nèi)引入溶液。
大藥妨濃注-在不超過(guò)約120分鐘的一段時(shí)間內(nèi)定量地(稱(chēng)為大藥丸)注入藥物。
適與給藥的-凍干的制劑或溶液，其適于以治療藥物的形式給藥。
單位劑量形式-適于為人類(lèi)受試者單位藥劑的完全分離的單位，每一單位包含預(yù)定量的，估計(jì)可產(chǎn)生預(yù)期治療效果的活性物質(zhì)和合適的藥物賦形劑。
藥學(xué)上有效量的-指表示本發(fā)明中能治療人類(lèi)膿毒癥的蛋白C的量。根據(jù)上述目的，所施用的蛋白C的具體劑量將由主治醫(yī)師在評(píng)估病例的具體情況后確定。
BPI蛋白-包括天然的和重組獲得的殺菌通透性增加(BPI)蛋白；天然的、人工合成的和重組的，并具有生物學(xué)活力的BPI蛋白的多肽片段；具有生物學(xué)活力的BPI蛋白或其片段的多肽變體，包括雜交融合蛋白和其二聚體；BPI蛋白或其片段或其變體的類(lèi)似物，包括半胱氨酸替代的類(lèi)似物和源于BPI的肽段。人BPI的全氨基酸序列和編碼BPI的DNA的核苷酸序列由Gray等加以說(shuō)明(1989,J.Biol.Chem264:9505)。BPI蛋白重組體的基因編碼和其表達(dá)的方法,包括BPI全蛋白和BPI的片段，見(jiàn)于美國(guó)專(zhuān)利No.5,198,541，其中的內(nèi)容在此被引入作為參考。
本發(fā)明涉及利用蛋白C結(jié)合BPI蛋白來(lái)治療膿毒癥。aPC和BPI的聯(lián)合使用產(chǎn)生了協(xié)同作用，該作用導(dǎo)致aPC和BPI用劑量的減少和接受治療的病人的臨床效果的改善。聯(lián)合療法中藥劑量的減少降低了任一藥劑可能出現(xiàn)的負(fù)作用。因而，聯(lián)合aPC的抗凝聚/抗炎癥性質(zhì)和BPI的殺菌與內(nèi)毒素中和的活力可提供針對(duì)膿毒癥的有效的協(xié)同療法，該療法可減少或減輕不利的狀況并可改善膿毒性病人的臨床效果。
根據(jù)本發(fā)明所施用的蛋白C可由本領(lǐng)域中任何已知方法或美國(guó)專(zhuān)利No.4,981,952和美國(guó)專(zhuān)利No.5,550,036中所述的方法生產(chǎn)和/或分離，本文在此引入作為參考。例如，本發(fā)明提供可以從細(xì)胞中制備和分離全長(zhǎng)的，可溶性蛋白C，或具有生物活力的蛋白C的多肽變體的方法，該方法包括(a)構(gòu)建一個(gè)包含編碼蛋白C的DNA的載體；(b)用載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞；(c)在如下所述的條件下在培養(yǎng)基中培養(yǎng)上述已轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，在該條件下，細(xì)胞可分泌全長(zhǎng)的可溶性蛋白C，或具有生物活力的蛋白C的多肽變體。進(jìn)一步而言，細(xì)胞可以是真核細(xì)胞，例如，哺乳動(dòng)物的細(xì)胞如金黃倉(cāng)鼠AV12，人類(lèi)胚胎293細(xì)胞，或小倉(cāng)鼠的腎細(xì)胞。
上述結(jié)合施用的蛋白C可根據(jù)已知的方法制備成藥學(xué)上有用的組合物。例如，理想的制劑是穩(wěn)定的，凍干的，高純度產(chǎn)品，該產(chǎn)品包含填料(bulking agent)如蔗糖，一種鹽如氯化鈉，一種緩沖液如檸檬酸鈉和蛋白C或aPC。
蛋白C可腸胃外給藥，通過(guò)在約1小時(shí)-約240小時(shí)內(nèi)連續(xù)注入合適的劑量以確保其以有效的形式進(jìn)入血液循環(huán)。
與BPI結(jié)合治療時(shí)，施用的蛋白C的量為約5μg/kg/hr-約250μg/kg/hr。優(yōu)選地，與BPI結(jié)合施用的蛋白C是活化的蛋白C。施用aPC的量為1.0μg/kg/hr-約50μg/kg/hr。更優(yōu)選地，施用aPC的量為1.0μg/kg/hr-約40μg/kg/hr。更優(yōu)選地，施用aPC的量為1.0μg/kg/hr-約35μg/kg/hr。更優(yōu)選地，施用aPC的量為約5.0μg/kg/hr-約30μg/kg/hr。更優(yōu)選地，施用aPC的量為約20μg/kg/hr-約30μg/kg/hr。最優(yōu)選地，施用aPC的量為約24μg/kg/hr。與BPI聯(lián)合施用的aPC的合適劑量可導(dǎo)致效果的改善或每一藥劑量的減少或前述兩種結(jié)果。
施用的血漿內(nèi)aPC的濃度范圍為約2ng/ml-約300ng/ml。優(yōu)選地，血漿內(nèi)的濃度范圍為約2ng/ml-約200ng/ml。最優(yōu)選地，血漿內(nèi)的濃度范圍為約30ng/ml-約150ng/ml，更優(yōu)選地，約100ng/ml。
通過(guò)下列步驟進(jìn)行aPC的給藥每小時(shí)以大藥丸注射的方式施用1/3的合適劑量；以連續(xù)注入1小時(shí)的方式施用剩余的2/3的合適劑量；以連續(xù)注入23小時(shí)的方式施用合適的劑量。通過(guò)上述步驟即可在24小時(shí)左右完成合適劑量的施用。此外，以1.5倍與正常速率的流速，經(jīng)靜脈內(nèi)袋狀滴泵或注射泵以大藥丸注射的方式給藥40-50分鐘，再以2倍與正常速率的流速，給藥10-20分鐘。給藥者可選擇上述兩種給藥方式中的任意一個(gè)。正常的速率即每一時(shí)間段內(nèi)給藥者確定的治療藥物的合適的劑量水平，該時(shí)間段持續(xù)24小時(shí)-240小時(shí)。
根據(jù)本發(fā)明，適于使用的BPI蛋白包括，但不局限于，天然的和重組獲得的BPI蛋白，例如，Gray等(1989)和美國(guó)專(zhuān)利No.5,733,872描述的重組BPI全蛋白，其中的內(nèi)容在此被引入作為參考；天然的、人工合成的和重組的，并具有生物學(xué)活力的BPI蛋白的多肽片段，例如，Ooi等在J.Exp.Med174:649(1991)和Gazzano-Santoro等在Infect.Immun60:4754-4761(1992)中所描述的；具有生物活力的BPI蛋白或其片段的多肽變體，包括雜交融合蛋白和二聚體；具有生物活力的BPI蛋白質(zhì)或其片段或其變體的多肽類(lèi)似物，包括半胱氨酸替代的類(lèi)似物和BPI衍生的蛋白質(zhì)，上述實(shí)例見(jiàn)于美國(guó)專(zhuān)利No.5,733,872,5,627,262,5,753,620,5,607,916和5,756,464,此處引入作為參考。
更可取地，本發(fā)明的BPI蛋白質(zhì)包括與天然人類(lèi)的BPI全蛋白具有相同或者相似氨基酸序列的生物活性分子。這類(lèi)BPI蛋白質(zhì)的非限制性例子有如Ooi等人(1991)所描述的天然人類(lèi)BPI蛋白質(zhì)的25kd的N-末端片段和Gazzano-Santoro等人(1992)描述的編碼天然人類(lèi)BIPN-末端1到193或者199氨基酸DNA重組表達(dá)產(chǎn)物。
本發(fā)明的可給藥的BPI蛋白質(zhì)可以通過(guò)該領(lǐng)域任何已知的方法產(chǎn)生和/或者分離，或者如U.S.專(zhuān)利No.5,308,834中所描述，此處合并引用。例如，本發(fā)明提供一個(gè)方法，可以從細(xì)胞中生產(chǎn)和分泌全長(zhǎng)的，可溶的BPI全蛋白，具有生物活性的多肽片段，或者具有生物活性的BPI全蛋白或者其片段的變異體，這個(gè)細(xì)胞包括(a)構(gòu)建一個(gè)含有編碼BPI DNA的載體；(b)用載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞和(c)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)已轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，一定條件下，分泌全長(zhǎng)可溶的BPI全蛋白，具有生物活性的多肽片段，或者具有生物活性的BPI全蛋白或者其片段的變異體。進(jìn)一步而言，細(xì)胞可以是一個(gè)真核細(xì)胞，例如金黃倉(cāng)鼠AV12，人類(lèi)胚胎的293細(xì)胞或者小倉(cāng)鼠的腎細(xì)胞等哺乳動(dòng)物的細(xì)胞。另一可選用的，細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，例如，酵母細(xì)胞或者細(xì)菌細(xì)胞。
術(shù)語(yǔ)“聯(lián)合”指的是BIP蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)C同時(shí)，按次序的或者作為一個(gè)組合的給藥。所用的BPI蛋白質(zhì)和正確的劑量水平在該領(lǐng)域是已知的或者如U.S.專(zhuān)利No.5,756,464所描述的，此處合并引用。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以確定所用的劑量水平，取得一個(gè)治療膿毒的藥物有效量。含有BPI蛋白質(zhì)的藥物有效成分可以通過(guò)全身或者局部給藥。全身的給藥路線包括靜脈的，肌內(nèi)的或者皮下注射(包括為了長(zhǎng)期釋放的貯存)，眼內(nèi)的和眼球后的，鞘內(nèi)的，腹膜內(nèi)的(例如，腹膜腔灌洗法)，肺內(nèi)的用氣溶膠或者噴霧藥，經(jīng)皮的。優(yōu)選的路線是靜脈給藥。當(dāng)胃腸外給藥時(shí)，BPI蛋白質(zhì)的注射劑量的范圍是大約0.04μg/kg/hr到大約4mg/kg/hr。優(yōu)選地，BIP蛋白質(zhì)的給藥范圍是大約4μg/kg/hr到大約420μg/kg/hr。更優(yōu)選，BPI蛋白質(zhì)的注射劑量的范圍是大約50μg/kg/hr到大約300μg/kg/hr。最優(yōu)選，BPI蛋白質(zhì)的注射劑量的范圍是大約100μg/kg/hr到大約200μg/kg/hr。治療可以通過(guò)連續(xù)灌輸或者間歇的注射或者灌輸，同時(shí)，減少或者增加每天的劑量，例如24小時(shí)到240小時(shí)，另外，可以由治療的醫(yī)師決定。BPI蛋白質(zhì)優(yōu)選的給藥是開(kāi)始靜脈大藥丸注射，然后連續(xù)輸注。優(yōu)選的劑量方案是大約0.1mg/kg到大約10mg/kgBPI蛋白質(zhì)的靜脈大藥丸注射，接下來(lái)的靜脈輸注的劑量范圍是大約4μg/kg/hr到大約420μg/kg/hr，一直持續(xù)到10天。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定最佳的藥物有效劑量和含有BPI蛋白質(zhì)治療成分的給藥方案，這些可以根據(jù)好的醫(yī)療實(shí)踐和通過(guò)個(gè)體病人的臨床條件確定。
內(nèi)毒素的抑制和BPI蛋白質(zhì)的革蘭氏陰性殺菌活性以及aPC的抗炎性的聯(lián)合，導(dǎo)致治療膿毒效能的加強(qiáng)。這種增效作用使聯(lián)合治療中試劑劑量的減少成為可能。
下面的提供的例子只是為了進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明。本發(fā)明的范圍不應(yīng)該僅僅理解為由下面的例子所組成。
制劑1
人類(lèi)蛋白質(zhì)C的制備重組的人類(lèi)蛋白質(zhì)C(r-hpc)可以通過(guò)楊領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉的技術(shù)，在人類(lèi)腎293細(xì)胞中產(chǎn)生，例如，在Yan,U.S.專(zhuān)利No.4,981,952公布的，在此處被引入作為參考。編碼人蛋白C的基因被Bang等人在U.S.專(zhuān)利N0.4,775,624中公開(kāi)并要求保護(hù)，在此處均被引入作為參考。在293細(xì)胞中用來(lái)表達(dá)人類(lèi)蛋白質(zhì)C的質(zhì)粒是質(zhì)粒pLPC,Bang等人在U.S.專(zhuān)利No.4,992,373中公開(kāi)，在此處被引入作為參考。質(zhì)粒pPLC的構(gòu)建也在歐洲專(zhuān)利公開(kāi)No.0 445 939中描述，Grinnell等人在1987,Bio/Technology5:1189-1192中描述，在此處均被引入作為參考。簡(jiǎn)而言之，質(zhì)粒被轉(zhuǎn)染到293細(xì)胞中，也使穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化體得到鑒定，并亞培養(yǎng)和生長(zhǎng)于無(wú)血清培養(yǎng)基中。發(fā)酵后，通過(guò)微量過(guò)濾，獲得無(wú)細(xì)胞的培養(yǎng)基。
人類(lèi)蛋白C采用Yan,U.S.專(zhuān)利No.4,981,952中的技術(shù)，進(jìn)而在培養(yǎng)液中獲得分離。在吸附于離子交換樹(shù)脂(Fast-FlowQ,Pharmacia)之前，澄清的培養(yǎng)基在EDTA中確定終濃度為4mM。用4倍柱體積的20mM Tris,200mM NaCl,pH7.4的溶液和2倍柱體積的20mM Tris,150mM NaCl,pH7.4的溶液洗滌后，結(jié)合的重組人類(lèi)蛋白質(zhì)C酶原用20mM Tris,150mM NaCl,10mM CaCl2pH 7.4的溶液洗脫。洗脫后，洗脫的蛋白質(zhì)用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定純度大于95％。
在NsCl溶液中確定蛋白質(zhì)的濃度為3M，然后吸附于用20mMTris,3M NaCl,10mMCaCl2,pH7.4的溶液平衡的疏水作用樹(shù)脂，可以進(jìn)一步提純蛋白質(zhì)。用兩倍柱體積的不含CaCl2平衡緩沖液洗滌后，重組蛋白質(zhì)用20mM Tris,pH7.4的溶液洗脫。
通過(guò)去除殘留的鈣，可以準(zhǔn)備將洗脫的蛋白質(zhì)激活。重組蛋白質(zhì)過(guò)金屬親合柱(Chelex-100,Bio-Rad)，去除鈣并再次結(jié)合到離子交換樹(shù)脂(Fast-Flow Q,Pharmacia)上。這些柱子按系列排布，并用20mM Tris,150mM NaCl,5mM EDTA pH7.4的溶液平衡。上蛋白質(zhì)之后，Chelex-100柱子在從系列中切斷之前，用一倍柱體積的相同緩沖液洗滌。在用0.4M NaCl,20mM Tris-乙酸，pH6.5溶液洗脫之前，離子交換樹(shù)脂用3倍柱體積的平衡緩沖液洗滌。
重組人類(lèi)蛋白質(zhì)C的蛋白質(zhì)濃度和重組活性的蛋白質(zhì)C溶液分別用UV280nm消光測(cè)定，E0.1％=1.81或者1.85。
制劑2重組人類(lèi)蛋白質(zhì)C的激活在4℃,50mM HEPES,pH7.5溶液中，將牛的凝血酶偶聯(lián)到活化的CH-Sepharose 4B上(Pharmacia)。偶聯(lián)反應(yīng)在已經(jīng)裝入柱子中的樹(shù)脂上完成，比例為5000個(gè)單位的凝血酶/ml樹(shù)脂。在循環(huán)溶液中加入濃度為0.6ml/L的2-氨基-乙醇之前，凝血酶溶液在柱子中循環(huán)3個(gè)小時(shí)。含有MEA的溶液再循環(huán)10-12個(gè)小時(shí)，以確保完全封閉樹(shù)脂上未反應(yīng)的氨基。封閉之后，凝血酶偶聯(lián)的樹(shù)脂用10倍柱體積的1MNaCl,20mM Tris,pH6.5的溶液洗滌，以去除所有的非特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)，在活性緩沖液中平衡后，再用于活性反應(yīng)。
提純的r-hPC在EDTA確定終濃度為5mM(螯合任何殘留的鈣)，并用20mM Tris,pH7.4或者20mM Tris-乙酸，pH6.5的溶液稀釋至2mg/ml。這些材料通過(guò)在37℃用50mM NaCl和20mM Tris,pH7.4的溶液或者20mM Tris-乙酸，pH6.5溶液平衡的柱子。流速調(diào)整到允許r-hPC和凝血酶接觸時(shí)間為大約20分鐘。收集流出物，立刻鑒定酰胺襲解的活性。如果流出物浮有可以和已建立的aPC標(biāo)準(zhǔn)相仿的比活性，則該材料重新在凝血酶的柱子中循環(huán)，完成r-hPC的激活。在等待下一個(gè)步驟時(shí)，用上述的20mM的緩沖液，pH7.4或者pH6.5的溶液1∶1稀釋材料，保持較低濃度。
從aPC的材料中去除被過(guò)濾的凝血酶，可以通過(guò)將aPC結(jié)合到用含有150mM NaCl的活性緩沖液(20mM Tris,pH7.4或者20mM Tris-乙酸，pH6.5)平衡的離子交換樹(shù)脂(Fast-Flow Q,Pharmacia)上完成。在這些條件下，凝血酶不與離子交換樹(shù)脂反應(yīng)，但通過(guò)柱子，進(jìn)入樣品流出物中。一旦aPC結(jié)合到柱子上，在用含有0.4M NaCl的5mM Tris-乙酸pH6.5或者20mM Tris,pH7.4洗脫結(jié)合的aPC這一步驟之前，用2-6倍柱體積的20mM平衡緩沖液洗滌柱子。柱子的大容積洗滌有助于更完全去除十二肽。從柱子中洗脫的原料以冷凍的溶液(-20℃)或者凍干粉末的形式保存。
激活的蛋白質(zhì)C的抗凝聚活性可以通過(guò)測(cè)定在活化的不完全凝血激酶時(shí)間(APTT)的凝血測(cè)定中延長(zhǎng)凝血時(shí)間的方法測(cè)定。制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，在稀釋的緩沖液(1mg/ml放射免疫測(cè)定級(jí)牛血清白蛋白[BSA]，20mM Tris,pH7.4,150mM NaCl,0.02％NaN3)中，蛋白質(zhì)C的濃度變化范圍是125-1000ng/ml，而樣品在這一濃度范圍之內(nèi)，制備幾種不同稀釋度。在每一個(gè)樣品杯中，加入50μl冷的馬血漿和50μl的重建活化的不完全凝血激酶時(shí)間試劑(partial thromboplastin timeagent)(APTT試劑，Sigma),37℃溫浴5分鐘。溫浴后，50μl適量的樣品或者標(biāo)準(zhǔn)樣加入到每一個(gè)杯子中。稀釋緩沖液用來(lái)替代樣品或者標(biāo)準(zhǔn)樣，以便決定基礎(chǔ)的凝血時(shí)間。向樣品或者標(biāo)準(zhǔn)樣中加入50μl 37℃的30mM CaCl2之后，立刻開(kāi)始計(jì)時(shí)。樣品中活化的蛋白質(zhì)C的濃度可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程計(jì)算得出。此處所報(bào)道的凝血時(shí)間包括標(biāo)準(zhǔn)曲線的樣品至少是三次重復(fù)測(cè)量的平均值。
通過(guò)上文的描述，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以制備aPC，以用來(lái)與BPI蛋白質(zhì)聯(lián)合治療膿毒癥。
制劑3BPI蛋白質(zhì)的表達(dá)為了在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中制備BPI蛋白和/或者BPI蛋白變體，cDNA序列插入到一個(gè)合適的質(zhì)粒載體上，如美國(guó)專(zhuān)利No.5,171,739中所描述的，在此被引入作為參考。上述申請(qǐng)的合適載體是pSV-1，它含有復(fù)制的起始點(diǎn)和SV40的早期和晚期的啟動(dòng)子，接下來(lái)是重復(fù)的克隆位點(diǎn)，接下來(lái)是來(lái)源于乙型肝炎表面抗原基因的終止序列，質(zhì)粒中還含有一個(gè)細(xì)菌DNA復(fù)制的起始點(diǎn)和編碼氨芐青霉素抗性和二氫葉酸還原酶的基因。類(lèi)似的載體也可以用來(lái)表達(dá)其他外源基因[McGrogan,等人。Biotechnology,6:172-177]。為了接受用HindⅢ和BamHⅠ消化的和用堿性磷酸酶去磷酸化的BPI蛋白質(zhì)的cDNA序列，制備載體DNA。
用親本質(zhì)粒合適的限制內(nèi)切酶進(jìn)行消化，例如EcoRⅠ和BgⅢ，產(chǎn)生兩個(gè)含有部分BPI蛋白質(zhì)編碼序列，在pSV-1中插入編碼全長(zhǎng)BPIDNA片段，制備一個(gè)含有插入片段的BPI蛋白質(zhì)cDNA。這兩個(gè)片段在制備的SV-1中連接起來(lái)，得到的重組克隆可以用限制性?xún)?nèi)切酶消化兩個(gè)插入子而出現(xiàn)正確取向得方法進(jìn)行篩選。
通過(guò)限制性消化分析，構(gòu)成得到證實(shí)。為了轉(zhuǎn)染CHO卵巢細(xì)胞品系DUXB11細(xì)胞，于是制備得到大量的重組克隆。用脂轉(zhuǎn)染的方法執(zhí)行轉(zhuǎn)染。用標(biāo)準(zhǔn)的方案，將產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化細(xì)胞在不斷增長(zhǎng)氨甲喋呤挑選出來(lái)。
用轉(zhuǎn)染池或者來(lái)源于轉(zhuǎn)染池克隆的上清液，通過(guò)抑制TNr的釋放，測(cè)定在內(nèi)毒素存在時(shí)的結(jié)合活力?？梢酝ㄟ^(guò)該領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方案，可以純化所選的上清液。
制劑4活化的蛋白C的制備通過(guò)凍干含有2.5mg/ml活化蛋白C，約15mg/ml蔗糖，約20mg/mlNaCl，和一個(gè)pH值介于5.5到6.5之間的檸檬酸鈉緩沖液的方案，可以制備活化的蛋白C的穩(wěn)定凍干制劑。另外，活化的蛋白C穩(wěn)定凍干制劑包括凍干一種溶液，該溶液含有5mg/ml活化蛋白質(zhì)C，約30mg/ml蔗糖，約38mg/mlNaCl，和一個(gè)pH值介于5.5到6.5之間的檸檬酸緩沖液溶液。
aPC、鹽和填料三者之間的比率(w∶w∶w)是決定凍干過(guò)程是否合適的一個(gè)重要因素。比率的變化依靠于aPC的濃度，鹽的選擇和濃度以及填料的選擇和濃度。特別是，優(yōu)選的比率是一份活化的蛋白質(zhì)C，7.6份的鹽和6份填料的。
適于連續(xù)輸注的單位劑量的活化蛋白質(zhì)C可通過(guò)混合活化蛋白質(zhì)C,NaCl，蔗糖和檸檬酸鈉緩沖液而制備?；旌虾?，4ml的溶液轉(zhuǎn)移為一個(gè)單位劑量容器中并凍干。含有5mg-20mg活化蛋白質(zhì)C，并適合給藥的劑量為約0.01mg/kg/hr-約0.05mg/kg/hr，單位劑量被密封保存直到用時(shí)為止。
制劑5BPI蛋白藥物組合物BPI蛋白藥物組合物是通過(guò)下面的步驟制得的。在檸檬酸緩沖鹽溶液中，含有重量百分比分別為0.1％的poloxamer 188(PluronicF-68,BASF Wyandotte,Parsippany)和0.002％聚山梨糖酸酯80(Tween 80,ICI Americas,Inc,Wilmington,Del.)，其中含有1mg/mlBPI蛋白質(zhì)。另一個(gè)含BPI蛋白質(zhì)藥物組合物包括在5mM檸檬酸溶液中，濃度為2mg/ml的BPI蛋白質(zhì)，150mM NaCl,0.2％poloxamer188和0.002％聚山梨糖酸酯80。這些組合在U.S.專(zhuān)利No.5,756,464中描述。
實(shí)施例1
在人膿毒癥病人中聯(lián)合施用活化的蛋白C和BPI蛋白中，用安慰對(duì)照進(jìn)行的雙盲實(shí)驗(yàn)該方法是在患有嚴(yán)重性膿毒癥病人中進(jìn)行的安慰劑對(duì)照進(jìn)行雙盲實(shí)驗(yàn)。病人分別用安慰劑、aPC、BPI治療以及aPC、BPI聯(lián)合治療。在48個(gè)小時(shí)內(nèi)，BPI蛋白以約100μg/kg/hr-約200μg/kg/hr的劑量連續(xù)給藥注入。與此同時(shí)，在96個(gè)小時(shí)之內(nèi)，aPC以約1μg/kg/hr-約50μg/kg/hr的劑量連續(xù)給藥注入。
入選標(biāo)準(zhǔn)包括4個(gè)通?？山邮艿哪摱緲?biāo)準(zhǔn)(心率、呼吸力量(effort)、升高/降低體溫、升高/降低白細(xì)胞數(shù)目)中的3個(gè)。病人還表現(xiàn)一定程度的器官功能異常，例如休克、尿排出量減少或者低氧血癥。
這項(xiàng)研究的最終終點(diǎn)是具有功能作用劑量的安全性和劑量耐受性，并比較用aPC或者BPI蛋白單獨(dú)治療與aPC和BPI蛋白聯(lián)合治療的具有功能作用劑量的安全性和劑量耐受性。一個(gè)28天導(dǎo)致的綜合(all cause)死亡率是這些接受安慰劑對(duì)照和接受aPC和BPI聯(lián)合治療或者單獨(dú)治療的終點(diǎn)。
aPC和BPI蛋白質(zhì)的聯(lián)合治療導(dǎo)致了協(xié)同作用，這種作用使得治療更加安全有效，并減少了治療膿毒所需的aPC和BPI蛋白質(zhì)的劑量。
權(quán)利要求
1．一種治療膿毒癥病人的方法，該方法包括給病人聯(lián)合施用藥學(xué)有效量的蛋白C與殺菌/通透性增加蛋白(BPI)蛋白。
2．權(quán)利要求1的方法，其中所述的患者是人。
3．權(quán)利要求1的方法，其中所述的蛋白C是人蛋白C酶原。
4．權(quán)利要求1的方法，其中所述的蛋白C是活化的人蛋白C。
5．根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中所述的活化的人蛋白C的量為約1μg/kg/hr-約50μg/kg/hr。
6．權(quán)利要求5的方法，其中所述的活化的人蛋白C是以連續(xù)注入約1-240小時(shí)的方式進(jìn)行給藥。
7．權(quán)利要求1的方法，其中所述的BPI蛋白是以大藥丸注射的方式進(jìn)行給藥。
8．權(quán)利要求7的方法，其中所述的BPI蛋白的量為約0.1mg/kg-約10mg/kg體重。
9．權(quán)利要求1的方法，其中所述的BPI蛋白是以連續(xù)注入約1-240小時(shí)的方式進(jìn)行給藥。
10．權(quán)利要求9的方法，其中所述的BPI蛋白的量為約4μg/kg/hr-約420μg/kg/hr。
11．一種治療膿毒癥的方法，該方法包括給病人聯(lián)合施用藥學(xué)上有效量的BPI蛋白與活化的蛋白C從而使血漿中活化的蛋白C的水平為2ng/ml-約300ng/ml。
12．權(quán)利要求11的方法，其中所述的蛋白C是以大藥丸注射的方式進(jìn)行給藥。
13．權(quán)利要求11的方法，其中所述的活化的人蛋白C是以連續(xù)注入約1-240小時(shí)的方式進(jìn)行給藥。
14．權(quán)利要求11的方法，其中所述的活化的蛋白C先以大藥丸注射的方式再以連續(xù)輸注進(jìn)行給藥。
15．權(quán)利要求14的方法，其中為獲得血漿中約2ng/ml-約300ng/ml活化的蛋白質(zhì)C所需劑量的三分之一是采用大藥丸注射給藥，剩余三分之二的活化蛋白質(zhì)C通過(guò)連續(xù)輸注的方式給藥。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種治療膿毒癥患者的方法。所要求的治療是使用蛋白C和BPI蛋白的組合療法。組合蛋白C的抗凝聚/抗炎癥特征和BPI的殺菌和內(nèi)毒素中和活性,從而提供了一種有效地、協(xié)同的濃毒癥的療法,結(jié)果是可以減低或減輕副作用并改善臨床上膿毒癥患者的預(yù)后。
文檔編號(hào)A61P31/04GK1324244SQ99812519
公開(kāi)日2001年11月28日 申請(qǐng)日期1999年10月15日 優(yōu)先權(quán)日1998年10月22日
發(fā)明者C·J·菲舍爾, S·－·C·B·彥 申請(qǐng)人:伊萊利利公司