專利名稱：以低的副作用施用喜樹堿化合物治療癌癥的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及喜樹堿化合物，具體地說，涉及鹽酸伊立替康(irinotecanhydrochloride)組合物制劑，并涉及以低的副作用施用喜樹堿化合物(例如鹽酸伊立替康)治療癌癥和愛滋病的方法。
鹽酸伊立替康(CPT-11)(4S)-4,11-二乙基-4-羥基-9-[(4-哌啶哌啶基)碳酰氧基]-1H-吡喃基[3′,4′:6,7]吲嗪基[1,2-b]喹啉-3,14(4h,12H)二酮鹽酸鹽具有新的抗腫瘤主動(dòng)機(jī)理，即抑制DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ。拓?fù)洚悩?gòu)酶是纏繞和不纏繞構(gòu)成染色體的DNA的一些酶。染色體必須不被纏繞才能制造蛋白質(zhì)，而喜樹堿化合物保持染色體被緊密纏繞使得它們不能制造蛋白質(zhì)。因?yàn)榘┘?xì)胞以比正常細(xì)胞快得多的速率生長(zhǎng)，它們比正常細(xì)胞更易受拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制作用的攻擊。
CPT-11已經(jīng)顯示出有效的臨床抗腫瘤活性(2,3)，并且，前不久CPT-11對(duì)存活的益處在結(jié)腸直腸癌上顯示。然而，在臨床實(shí)踐中，其具有白細(xì)胞減少和腹瀉這些嚴(yán)重的毒性。CPT-11以較高的劑量在臨床上的使用與不希望的和高發(fā)的腹瀉(4,6,7,12)有關(guān)，腹瀉現(xiàn)在被認(rèn)為是這一藥物的受劑量影響的毒性(4-7)。雖然已經(jīng)進(jìn)行了許多藥物分析(其已顯示在不同的病人中很大的可變性)來預(yù)測(cè)腹瀉的發(fā)生率，但是出現(xiàn)了一些有沖突的結(jié)果(8-11)。
CPT-11和其代謝物，SN-38以及SN-38-Glu，不僅在人血漿中而且在人膽汁中被檢測(cè)到。在三種化合物中，SN-38具有強(qiáng)的細(xì)胞毒性，SN-38-Glu是從SN-38去活化的和葡萄糖醛酸化的，與SN-38相比，CPT-11具有低得多的細(xì)胞毒性。這些化合物具有α-羥基-3-內(nèi)酯環(huán)，其以一定的速率進(jìn)行可逆水解，所說的速率主要取決于pH值(15,16,17)。在高于生理pH值下，內(nèi)酯形式不穩(wěn)定，平衡有利于水解，打開內(nèi)酯環(huán)，產(chǎn)生羧化物形式。在酸性條件下，形成內(nèi)酯的逆向反應(yīng)是有利的。CPT-11和SN-39-Glu也發(fā)生類似的反應(yīng)。
從幾個(gè)報(bào)告可以認(rèn)為，在人中的主要代謝途徑如下CPT-11通過主要為肝臟來源的羧基化酯酶水解為活性代謝物，7-乙基-10-羥基-喜樹堿(SN-38)。一些SN-38爾后進(jìn)行經(jīng)由肝酶，UDP-葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶的與SN-38β-葡萄糖醛酸化物(SN-38-Glu)的綴合，與其它組分，CPT-11以及SN-38一同分泌進(jìn)膽汁(13,14)。三種化合物被認(rèn)為由腸細(xì)胞再吸收，進(jìn)入腸肝循環(huán)。前不久已發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞色素P-4503A酶將CPT-11代謝為7-乙基-10-[4-N-(5-戊酸)-1-哌啶基]碳酰氧基喜樹堿，其具有比SN-38弱500倍的抗腫瘤活性(Rivary等，1996b；Haaz等，1997)。CPT-11,SN-38和SN38-Glu具有α-羥基-3-內(nèi)酯環(huán)，其以一定的速率進(jìn)行可逆水解，所說的速率主要取決于pH值(Fassberg等，1992)。在生理pH值和高于該pH下，內(nèi)酯形式不穩(wěn)定，平衡有利于水解，打開內(nèi)酯環(huán)，產(chǎn)生羧化物形式。在酸性條件下，內(nèi)酯-羧化物內(nèi)部轉(zhuǎn)化移向內(nèi)酯形式。CPT-11，SN-38和SN38-Glu被分泌進(jìn)膽汁，并與其一同釋放進(jìn)小腸腔(Atsumi等，1991；Lokiec等，1995；Chu等，1997a,b)。此外，雖然次要(Atsumi等，1995)，但另外的途徑牽涉CPT-11及其代謝物從血清跨越上皮細(xì)胞向腔室的直接轉(zhuǎn)運(yùn)。一旦在腸中，SN38-Glu經(jīng)由細(xì)菌β-葡萄糖醛酸酶在盲囊和結(jié)腸中與SN-38去綴合(Takatsuna等，1996)。CPT-11,SN-38和SN38-Glu被認(rèn)為由腸細(xì)胞某種程度的再吸收，進(jìn)入腸肝循環(huán)。
迄今為止，只有關(guān)于CPT-11和其衍生物的腸攝取和轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)理的很少信息。這一知識(shí)對(duì)CPT-11引起腹瀉的機(jī)理的理解是關(guān)鍵的步驟。在本項(xiàng)研究中，CPT-11和SN-38由腸上皮細(xì)胞的攝取被估價(jià)，并與它們各自對(duì)細(xì)胞毒性的作用相關(guān)聯(lián)。
幾種喜樹堿衍生物的結(jié)構(gòu)是已知的。
此外，美國(guó)專利5,552,154公開了肌內(nèi)或口頭施用關(guān)閉的內(nèi)酯環(huán)形式的喜樹堿(CPT)和其衍生物。在這樣的情況下，獲得人類寬范圍的癌癥的總體上減輕而沒有以前用CPT Na+觀察到的毒性是可能的。所使用的CPT衍生物是9-氨基-20(S)-喜樹堿(9AC)、9-硝基-20(S)-喜樹堿(9NO2)。
美國(guó)專利5,468,754描述了CPT11和其它喜樹堿衍生物進(jìn)行E-環(huán)內(nèi)酯的堿性、pH-依賴性水解。慢反應(yīng)動(dòng)力學(xué)使人們可以評(píng)估是否藥物的內(nèi)酯和非-內(nèi)酯形式兩者都穩(wěn)定拓?fù)洚悩?gòu)酶切割的DNA復(fù)合物。研究表明僅僅喜樹的關(guān)閉的內(nèi)酯形式幫助穩(wěn)定可切割的復(fù)合物。因此，該專利推薦使用低于7的pH值水平，以使喜樹堿的內(nèi)酯形式占主導(dǎo)地位。該專利提出與藥學(xué)上可接受的酸一起使用所說的化合物。
美國(guó)專利5,447,936描述了藥物的HECPT形式在酸性環(huán)境中比在具有高的胞內(nèi)pH值水平的細(xì)胞中抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶-Ⅰ更有效。該專利描述了與酸(其是有機(jī)羧酸，例如檸檬酸)一起施用藥物的方法。
美國(guó)專利5,225,404描述了用水溶性化合物的水基溶劑(如生理鹽水或磷酸鹽緩沖的鹽溶液)施用喜樹堿化合物的方法。該專利指出阻止了腹瀉和膀胱炎癥狀，并且沒有出現(xiàn)任何全身性毒性。
美國(guó)專利5,637,770描述了通過把水溶性環(huán)添加至喜樹堿上獲得環(huán)已基化合物(其具有喜樹堿的很好的特性)的方法。美國(guó)專利5,633,016描述了組合癌癥治療方法，包括施用與順式鉑氨一起施用有效量的topotecan。
美國(guó)專利5,633,26021公開了7-11-取代的喜樹堿衍生物。該專利也描述了在制劑中保持酸性pH值(3到4)對(duì)帶有E-環(huán)-水解的羧化物的11,7-HECPT內(nèi)脂的緩慢的轉(zhuǎn)變(其在生理pH下發(fā)生)是重要的。這一專利規(guī)定了常規(guī)劑量以消除化合物的毒性。
美國(guó)專利5,652,244描述了利用喜樹堿衍生物治療人癌癥的方法。美國(guó)專利5,658,920描述了喜樹堿的環(huán)己基化合物的衍生物。
美國(guó)專利5,597,829公開了CPT由腎排泄不變，雖然大比例的所施用的藥物不能在尿中被計(jì)數(shù)，該專利提出CPT的羧化物形式的提高的腎排泄出現(xiàn)在暴露在pH值低于5時(shí)。因此，推薦通過施用具有有機(jī)羧酸的化合物施用所說的藥物以保證酸性pH值。
美國(guó)專利5,674,874描述了CPT11向HECPT的藥理學(xué)轉(zhuǎn)化。該專利描述了與藥學(xué)上可接受的酸一起施用足夠量的化合物，以保持制劑的pH值從約2到約6。
癌癥研究，第14卷增刊1第31號(hào)描述了使用伊立替康(CPT11)治療結(jié)腸癌癥和非小細(xì)胞肺癌。該出版物證實(shí)，在接受積極的洛哌丁胺治療后，與使用CPT11相關(guān)的4級(jí)腹瀉發(fā)生率從17％降至5％。
用于進(jìn)行性結(jié)腸癌的批準(zhǔn)的伊立替康，藥物科學(xué)通訊1996，第18卷12號(hào)指出，腹瀉是施用伊立替康的一種普遍的副作用。
國(guó)家癌癥研究所雜志，1996年9月4日，第88卷17號(hào)提出在盲囊中額外產(chǎn)生硫代粘蛋白可能是CPT-11-導(dǎo)致的腹瀉的主要原因。
Camptosar患者管理指南提出通過施用洛哌丁胺和gatorade避免camptosar的腹瀉副作用。
本發(fā)明克服了與施用喜樹堿化合物，特別是鹽酸伊立替康相聯(lián)系的主要副作用之一，腹瀉。其是在現(xiàn)有技術(shù)中施用鹽酸伊立替康治療腫瘤的主要缺陷之一。本發(fā)明克服了與施用鹽酸伊立替康和其相關(guān)化合物有關(guān)的腹瀉副作用。
本發(fā)明提供了抑制由肝清除的喜樹堿化合物(包括但不限于，irlnotecan鹽酸鹽(CPT-11),SN36-Clu，以及SN-38)的腹瀉副作用的方法，該方法包括在保持腸腔堿性pH值的同時(shí)，施用鹽酸伊立替康。
本發(fā)明也提供了治療癌癥的方法，該方法包括在保持腸腔堿性pH值的同時(shí)，施用喜樹堿化合物如鹽酸伊立替康。
在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，所說的癌癥選自但不限于乳腺癌、卵巢癌、結(jié)腸癌、惡性黑素瘤、小細(xì)胞肺癌、甲狀腺癌、淋巴瘤和白血病。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了治療艾滋病的方法，該方法包括在保持腸腔堿性pH值的同時(shí)，施用鹽酸伊立替康。
本發(fā)明有利地提供了靜脈內(nèi)施用喜樹堿化合物如鹽酸伊立替康(CPT-11)的方法，該方法包括在施用所說的喜樹堿化合物之前或同時(shí)，口頭施用碳酸氫鹽與堿性H2O。
本發(fā)明提供了靜脈內(nèi)施用喜樹堿化合物如鹽酸伊立替康(CPT-11)的方法，該方法包括在施用所說的喜樹堿化合物之前或同時(shí)，口頭施用包含硼酸(borbicacid)的組合物。
本發(fā)明也提供了靜脈內(nèi)施用喜樹堿化合物的方法，該方法包括在施用所說的喜樹堿化合物之前或同時(shí)，口頭施用包含烏索脫氧膽酸的組合物。
在本說明書(其中以包括或包含特定組合物的形式描述了組合物，試劑盒，以及方法)中，發(fā)明人期望本發(fā)明的組合物也實(shí)質(zhì)上包含或含有所敘述的組分。
從下列詳細(xì)描述與附圖，相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)人員將易于理解本發(fā)明的以上和其他目的。在以下詳細(xì)描述與附圖中，僅簡(jiǎn)單地說明實(shí)施發(fā)明的最好方式，來顯示和描述本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案。相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)人員容易認(rèn)識(shí)到本發(fā)明可以被改進(jìn)，但不偏離本發(fā)明的精神和范圍。
圖2A和2B顯示CPT-11和SN-38由分離的腸細(xì)胞攝取的時(shí)程分別以內(nèi)酯和羧化物形式的[14C]CPT-11(20μM)和[14C]SN-38(2μM)由分離的空腸腸細(xì)胞的攝取作為時(shí)間的函數(shù)測(cè)定。在時(shí)間0，各種試劑在持續(xù)振蕩下添加至37℃保持的腸細(xì)胞懸液中。在15,30,45,60,90,120,240和480秒，除去細(xì)胞懸液的等分樣，如材料和方法中的描述進(jìn)行處理。結(jié)果以平均值±SE顯示。
圖3A,3B,3C和3D顯示CPT-11的攝取初始的速率與其濃度之間的關(guān)系在初始的90秒溫育期間從細(xì)胞攝取的線型斜率測(cè)定初始攝取速率，數(shù)據(jù)用方程式V=(VmaxS)/(Km+S)+KdS經(jīng)最小二乘法非線性回歸分析處理，其中V代表攝取的初始速率，Vmax是攝取的最大速率，Km是表觀米氏常數(shù)，Kd是擴(kuò)散速率，S是CPT-11的濃度。
圖4A和4B顯示SN-38的攝取初始的速率與其濃度之間的關(guān)系初始攝取速率如圖3的圖例中與材料和方法中的描述測(cè)定，數(shù)據(jù)由最小二乘法線性回歸處理。由于有限的溶解性，僅研究了達(dá)2μM濃度的SN-38。
圖5顯示?；悄懰?TCA)分別對(duì)CPT-11和SN-38膠束形成的作用[14C]CPT-11(20μM)和[14C]SN-38(2μM)在存在或不存在TCA(20mM)的情況下在Hank’s溶液中貯存一夜。如材料和方法所述經(jīng)采用1000-分子量截?cái)嗄?YM1)超濾從膠束聚集體分離單體。數(shù)值是所示代謝物的單體形式，以超濾之前起始溶液濃度的百分比(％)表示。TCA和對(duì)照之間的比較由Mann-Whitney試驗(yàn)估價(jià)。(*)在TCA存在下SN-38羧化物明顯不同于其他試劑(Kruskal-Wallis試驗(yàn)P=0.023,Student-Newman-Keuls法，P＜0.05)。使用的縮寫CPT內(nèi)酯(CPTlact.)；CPT羧化物(CPT carb.)；SN-38內(nèi)酯(SNlact.)；SN-38羧化物(SNcarb.)圖6A和6B顯示pH值對(duì)CPT-11和SN-38的初始攝取速率的作用[14C]CPT-11(20μM)和[14C]SN-38(2μM)溶解在pH6.2,6.8,7.4的PBS中，并且貯存一夜。通過添加藥物至包含來源于整個(gè)小腸的腸細(xì)胞的Hank’s溶液中，完成攝取研究。由pH值引起的初始攝取速率的區(qū)別通過Kruskal-Wallis試驗(yàn)(對(duì)CPT-11和SN-38分別是p＜0.001,p＜0.001)和Student-Newman-Keuls法(*p＜0.05)分析。
圖7顯示pH值對(duì)HT29細(xì)胞初始攝取速率的作用。在pH6.2,6.8,7.4下，[14C]SN-38(2μM)溶解在PBS中一夜。通過添加化合物至包含HT29細(xì)胞的Hank’s溶液開始攝取研究。攝取的比較初始速率作為pH值的函數(shù)由Kruskal-Wallis試驗(yàn)(p＜0.001)和Dunn’s法(*p＜0.05)分析。
圖8顯示SN-38的初始攝取速率和細(xì)胞毒性之間的關(guān)系。利用HT29細(xì)胞，生理pH值對(duì)2μM[14C]SN-38的初始攝取速率的作用如圖3圖例中的描述估價(jià)。在HT29細(xì)胞中，0.4μM SN-38-引起的細(xì)胞毒性由所描述的MTT測(cè)定法研究。SN-38的初始攝取速率和細(xì)胞毒性之間的關(guān)系由一簡(jiǎn)單的最小二乘法回歸法圖示。
發(fā)明詳述喜樹堿化合物如CPT-11和其代謝物由腸細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)的機(jī)理的知識(shí)對(duì)由喜樹堿化合物，如CPT-11引起的腹瀉的機(jī)理和在藥代動(dòng)力學(xué)中不同患者中的大的可變性的理解是關(guān)鍵的步驟。
本發(fā)明發(fā)明人研究了幾種喜樹堿化合物，CPT-11和SN-38由腸上皮細(xì)胞的攝取，結(jié)果提供了一種方法的新的設(shè)計(jì)，該方法是在用鹽酸伊立替康和其相關(guān)化合物治療癌癥和腫瘤的臨床實(shí)踐上，阻止腹瀉和在藥代動(dòng)力學(xué)中不同患者間的大的可變性的方法。
本發(fā)明提供了一種抑制喜樹堿化合物(鹽酸伊立替康(CPT-11)、SN-38-Glu、SN-38和其衍生物)的腹瀉副作用的方法，該方法包括在保持膽汁和/或腸腔堿性pH值的同時(shí)，施用鹽酸伊立替康。在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過施用碳酸氫鹽與堿性H2O來保持腸腔處于堿性pH值。碳酸氫鹽的量和堿性pH值適于降低喜樹堿化合物的攝取量，并且由此降低包括腹瀉副作用在內(nèi)的細(xì)胞毒性副作用。喜樹堿化合物或鹽酸伊立替康可以通過靜脈內(nèi)，口頭或饑內(nèi)施用。本發(fā)明的方法阻止再吸收，并且降低腸對(duì)CPT-11和SN-38的內(nèi)酯攝取，并且由此降低與喜樹堿化合物如鹽酸伊立替康相聯(lián)系的腹瀉副作用。
本發(fā)明也提供了一種治療癌癥的方法，該方法包括在保持腸腔處于堿性pH值狀態(tài)的同時(shí)，施用鹽酸伊立替康和其衍生物。在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，所說的癌癥選自但不限于下組乳腺癌、卵巢癌、結(jié)腸癌、惡性黑素瘤、小細(xì)胞肺癌、甲狀腺癌、淋巴瘤和白血病。堿性pH值可以是從約7至約10。在一可替實(shí)施方案中，在保持腸腔處于堿性pH值狀態(tài)的同時(shí)，通過施用選自7-羥甲基喜樹堿，鹽酸伊立替康，氨基喜樹堿，DX-8951F,SN-3B,HAR4,HAR5,HAR6,HAR7,HAR8以及topotecan的化合物來治療癌癥。
本發(fā)明有利地提供了一種治療AIDS的方法，該方法包括在保持腸腔處于堿性pH值狀態(tài)的同時(shí)，施用鹽酸伊立替康和其衍生物。
包含鹽酸伊立替康(CPT-11)的藥物組合物和試劑盒可以與碳酸氫鹽結(jié)合施用，所說的結(jié)合的碳酸氫鹽選自碳酸氫鈉、碳酸氫鎂和碳酸氫鉀。另外鹽酸伊立替康(CPT-11)可以與包含硼酸的組合物結(jié)合施用。這一化學(xué)品已經(jīng)用于緩沖組合物(如Britton-Robinson緩沖液)，并且具有強(qiáng)的堿性緩沖作用。
本發(fā)明也提供了一種施用喜樹堿化合物的方法，該方法包括在施用所說的喜樹堿化合物之前或同時(shí)，口頭施用包含烏索脫氧膽酸的組合物。這一組合物可以也可以不與碳酸氫鹽一起施用。人們相信烏索脫氧膽酸刺激碳酸氫鹽分泌進(jìn)入膽汁。
下列實(shí)施例顯示了依據(jù)本發(fā)明的方法，鹽酸伊立替康化合物降低腹瀉副作用的能力。
實(shí)施例藥物和動(dòng)物14C-標(biāo)記的SN-38(3.68 MBg/mg)和14C-標(biāo)記的CPT-11(1.47MBq/mg)由Daiichi藥物有限公司(日本東京)友好贈(zèng)送。非標(biāo)記的CPT-11,SN-38和SN-38-Glu由Yakult Honsha有限公司(日本東京)供給。14C-標(biāo)記的SN-38以2μM的終濃度溶解在DMSO中，這是因?yàn)槠涫杷院軓?qiáng)，并且在水中有差的可溶性。已證實(shí)在2％時(shí)，DMSO對(duì)標(biāo)記的CPT-11和SN-38的起始攝取沒有任何影響。其它藥物溶解在蒸餾水中。通過分別在pH6或9的50mM磷酸緩沖液中溶解化合物一夜產(chǎn)生14C-標(biāo)記的CPT-11和SN-38的內(nèi)酯和羧化物形式。由谷胱甘肽和CDNB(1-氯-2,4-二硝基苯)化學(xué)制備DNP-SG。所有其它試劑是分析純?cè)噭Ｊ褂贸赡晷坌越瘘S倉(cāng)鼠(6-8周齡)，其模型代表類膽汁酸輪廓(28)，類似于在人中觀察到的。腸細(xì)胞的制備如現(xiàn)有技術(shù)的描述分離腸細(xì)胞(28,29)。簡(jiǎn)言之，雄性倉(cāng)鼠用戊巴比妥鈉(Nembutol 70mg/kg體重)麻醉。移走整腸。腸腔管用37℃的Hank’s溶液洗滌。沖洗回腸囊(從盲腸12.5cm)和空腸(保留小腸)以及小腸肛門端的(從盲腸12.5cm)和口部端的(其它小腸)腸囊。以包含檸檬酸鈉的氧化緩沖液(96mM NaCl,1.5mM KCl,5.6mM KH2PO4,27mM檸檬酸鈉，pH7.3)沖洗囊，并于37℃在相同的緩沖液中溫育10分鐘。然后倒空囊，沖以包含乙二胺四乙酸的氧化緩沖液(140mM NaCl,16mM Na2HPO4,2mM乙二胺四乙酸，0.5mM二硫蘇糖醇。pH7.3)，在37℃溫育10分鐘。然后將各囊放置在培養(yǎng)皿中，輕輕渦旋1分鐘。用50mlHank’s溶液回收包含腸細(xì)胞的緩沖液，洗滌兩次，并且用Hank’s介質(zhì)(包含0.5％牛血清清蛋白的細(xì)胞貯存溶液，pH7.4)調(diào)節(jié)至106細(xì)胞/ml。
分別測(cè)定14C-標(biāo)記的CPT-11和SN-38的細(xì)胞攝取14C-標(biāo)記的CPT-11和SN-38的攝取由快速真空抽濾測(cè)定法(28,29)測(cè)定。將0.95ml細(xì)胞懸浮在37℃的水浴中，攪拌15分鐘。通過在37℃添加0.05mlPBS(在pH3或9)開始攝取，所說的PBS含有標(biāo)記的CPT-11和SN-38。在各時(shí)間間隔，100μL小份樣品在4℃稀釋進(jìn)3毫升Hank’s介質(zhì)，以終止攝取。真空下(20psi)用玻璃微型纖維濾膜(玻璃纖維濾膜圈G4,Fisherbrand,PA)過濾包含細(xì)胞的終止溶液。細(xì)胞以含0.5％牛血清白蛋白的Hank’s介質(zhì)5ml洗滌一次(4℃)和)，用Hank’s溶液20ml洗滌一次(4℃)。將濾膜放置在包含4ml閃爍液的小瓶中，在β閃爍計(jì)數(shù)器(LS3801,Beckman,MD)中計(jì)數(shù)放射活性。
通過在14C-CPT-11和14C-SN-38(2μM)3分鐘之前添加2,4-二硝基苯酚(1mM)至細(xì)胞中研究代謝抑制物2,4-二硝基苯酚(1mM)的作用。20mM?；悄懰?TCA)對(duì)CPT-11和SN-38的攝取的作用在pH7.4存在和不存在TCA下用Hank’s溶液過夜溫育14C-CPT-11(20μM)和14C-SN-38(2μM)后進(jìn)行。通過在14C-CPT-11(20μM)和14C-SN-38(2μM)7分鐘之前添加DNP-SG或SN-38-Glu至細(xì)胞制劑中研究200μM DNP-SG或SN-38-Glu的作用。
分別在pH6.2,6.8,7.4和8下用磷酸緩沖鹽水過夜溫育14C-CPT-11(20μM)和14C-SN-38(2μM)后，研究生理pH值對(duì)CPT-11和SN-38的初始腸攝取速率的作用。評(píng)估膠束形成為了評(píng)估CPT-11和SN-38是否形成膠束，用含有10mM TCA無鈣和鎂的Hank’s溶液pH4和9下溫育這些藥劑過夜。通過采用1000-分子量截?cái)嗄M1(Diaflo,Amicon,MA)以0.04ml/分鐘的穩(wěn)定速度過濾各溶液。一旦停止過濾，就按照以前的描述測(cè)定初始溶液以及濾液和過濾后的保留的溶液中的放射活性。細(xì)胞毒性測(cè)定修改用于線粒體脫氫酶活性的快速比色測(cè)定法，并且用于評(píng)價(jià)SN-38的細(xì)胞毒性(Mosmann,1983)。簡(jiǎn)言之，將HT29細(xì)胞接種進(jìn)12孔平板(Falcon-3043,Lincoln Park,NJ)，在48小時(shí)之后，在pH6.2,6.8,7.4和8.0下添加SN-38(0.4(M)。露置24小時(shí)，洗滌細(xì)胞兩次，并且進(jìn)行無藥物溫育24小時(shí)。然后，用0.5mg/ml 3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基-四溴化物(MTT)溫育細(xì)胞4小時(shí)，通過添加在0.01N HCl中的n-十二烷基苯硫酸鈉鹽(SDS)和溫育一夜溶解藍(lán)色formazan晶體。藍(lán)色formazan化合物的形成在560毫微米以分光光度法(Ultraspec 4050,LKB,Brornma,Sweden)測(cè)定。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析CPT-11或SN-38的攝取的初始速率是從各自的回歸線的線型回歸分析中得出的，所說的回歸線是從作為時(shí)間函數(shù)的攝取的曲線圖獲得的。將攝取的初始速率被對(duì)對(duì)應(yīng)的濃度作圖。數(shù)據(jù)用方程式V=(VmaxS)/(Km+S)+KdS經(jīng)最小二乘法非線性回歸分析(SigmaStat,Jandel scientific,CA)處理，其中V代表攝取的初始速率，Vmax是攝取的最大速率，Km是表觀米氏常數(shù)，Kd是擴(kuò)散速率，S是CPT-11或SN-38的濃度。
兩組之間的比較通過Mahn-whitney等級(jí)總數(shù)試驗(yàn)評(píng)價(jià)。兩組以上的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著性由Kruskal-Wallis單向等級(jí)方差分析確定，然后由Dunn’s法完成與對(duì)照組的多重比較。用簡(jiǎn)單的最小二乘法回歸法將攝取的初始速率與SN-38的細(xì)胞毒性之間的關(guān)系作圖。CPT-11和SN-38內(nèi)酯和羧化物的分別由腸細(xì)胞的攝取20μM14C-CPT-11和2μM14C-SN-38的內(nèi)酯和羧化物兩種形式被分離的空腸細(xì)胞的時(shí)間-依賴性攝取在圖2中顯示。在時(shí)間0的攝取值的外推產(chǎn)生正的截距，表明非特異性結(jié)合，如對(duì)在細(xì)胞表面的標(biāo)記的吸附。CPT-11和SN-38的內(nèi)酯與羧化物兩種形式各自的攝取在多達(dá)90秒內(nèi)是線型的。因此，在初始時(shí)間期間，攝取的初始攝取速率由直線回歸適配確定。各種藥劑的內(nèi)酯和羧化物形式之間的攝取速率的比較清楚地顯示CPT-11和SN-38兩者的內(nèi)酯形式與羧化物形式比較被更迅速地?cái)z取(圖2)。
表1總結(jié)了20μM14C-CPT-11和2μM14C-SN-38被空腸和回腸細(xì)胞的初始攝取速率。在兩種腸區(qū)的細(xì)胞中，CPT-11和SN-38內(nèi)酯形式與它們的羧化物形式得到更迅速的攝取，但在空腸和回腸細(xì)胞之間沒有顯著性差異。CPT-11和SN-38內(nèi)酯和羧化物的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)將CPT-11內(nèi)酯和羧化物的各自的初始攝取速率作為濃度的函數(shù)作圖，空腸以及回腸細(xì)胞中的數(shù)據(jù)用方程式V=(VmaxS)/(Km+S)+KdS經(jīng)最小二乘法非線性回歸分析處理(圖3)，CPT-11內(nèi)酯的攝取的優(yōu)勢(shì)組分是非飽和的。表明由被動(dòng)擴(kuò)散或液相胞吞作用攝取。CPT-11羧化物攝取的曲線分析也表明攝取過程的至少兩個(gè)不同的組分。曲線的飽和組分的特征是147的最大攝取速率(Vmax)和157pmol·106細(xì)胞-1·分鐘-1·μM-1，以及分別在空腸和回腸細(xì)胞中的51.3和50.5(M的米氏常數(shù)(Km)。次要的非飽和組分的特征是擴(kuò)散速率(Kd)小于0.05pmol·106細(xì)胞-1·分鐘-1·μM-1，并且代表在兩個(gè)腸區(qū)的細(xì)胞中不到CPT-11內(nèi)酯的二十分之一(表2)。此外，CPT-11內(nèi)酯的Kd低于SN-38內(nèi)酯的1.8-2.5倍。
將SN-38內(nèi)酯和羧化物的初始攝取速率作為濃度的函數(shù)作圖(圖4)，用于這一研究的SN-38的最大濃度低于2μM，這是因?yàn)樵摶衔锊畹娜芙庑?，由此使得測(cè)定攝取的飽和和不可飽和組分變得困難。在這一濃度水平上，SN-38內(nèi)酯和羧化物的攝取是最不可飽和的(圖4)載體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運(yùn)已知受代謝抑制劑抑制，如2,4-二硝基苯酚，其干擾細(xì)胞代謝，并且降低產(chǎn)生能量的反應(yīng)(23)。因此，2,4-二硝基苯酚用于應(yīng)用研究以分別確定CPT-11和SN-38內(nèi)酯和羧化物的攝取的機(jī)理。這一研究的結(jié)果在表3中總結(jié)。雖然CPT-11和SN-38兩者的內(nèi)酯的攝取不明顯地受添加2,4-二硝基苯酚的影響，但CPT-11以及SN-38羧化物的攝取速率分別被2,4-二硝基苯酚降低至22,6和30.85。表明對(duì)這兩種化合物的主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)。
2,4-二硝基苯酚-S-谷胱甘肽(DNP-SG)已知在肝中是活性多特異性有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(cMOAT)的底物(24)。此外，由SN-38的UDP-葡糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶的綴合導(dǎo)致形成SN-38-Glu，其也是肝cMOAT的底物(12,17)。為了確定CPT-11羧化物和/或SN-38羧化物是否通過腸細(xì)胞的類cMOAT機(jī)理轉(zhuǎn)運(yùn)，存在或不存在DNP-SG和SN-38-Glu下研究CPT-11以及SN-38的攝取速率。結(jié)果在表3中總結(jié)。DNP-SG和SN-38-Glu明顯抑制SN-38羧化物攝取的60％，而CPT-11羧化物的攝取保持不變，CPT-11和SN-38內(nèi)酯形式的攝取速率不明顯受到DNP-SG或SN38-Glu存在的影響。膠束形成和其對(duì)CPT-11和SN-38初始攝取速率的影響臨界膠束濃度以上的?；悄懰?TCA)形成膠束(25)，與CPT-11和SN-38相反，其不能穿過1,000-分子量截?cái)嗄ぁＮ覀兝眠@一性質(zhì)來確定CPT-11和SN-38內(nèi)酯和羧化物是否可以與TCA締合成膠束。圖5中報(bào)告的結(jié)果，表明TCA明顯降低CPT-11內(nèi)酯和羧化物以及SN-38內(nèi)酯的％單體濃度。然而，SN-36羧化物不明顯締合成TCA膠束。
下一個(gè)應(yīng)用試驗(yàn)?zāi)z束形成對(duì)CPT-11和SN-38的細(xì)胞攝取的作用。在這一系列實(shí)驗(yàn)中，組合空腸與回腸細(xì)胞。在20mM TCA存在下，CPT-11和SN-38的初始攝取速率(平均值±SD)降低至沒有TCA的對(duì)照的48.5(10.8和69.3±12.7％(N=5,Mann-Whitney試驗(yàn)，分別對(duì)CPT-11和SN-38 P=0.015和P=0.343)。pH值和碳酸氫鹽對(duì)CPT-11和SN-38的初始攝取速率的影響CPT-11和SN-38各自的內(nèi)酯和羧化物之間相互轉(zhuǎn)化是可逆的和受pH值驅(qū)動(dòng)的(11)。研究了生理pH值(pH6.2-8)對(duì)20μM14C-CPT-11，和2μM14C-SN-38的初始攝取速率的影響。結(jié)果在圖6中總結(jié)，其顯示在pH值大于6.8時(shí)，CPT-11和SN-38的攝取速率明顯降低約65％。當(dāng)在存在和不存在碳酸氫鹽時(shí)測(cè)定CPT-11與SN-38的初始攝取速率時(shí)，也觀察到攝取的改變。當(dāng)Hank’s緩沖液的HEPES組分由碳酸氫鈉代替，pH值調(diào)節(jié)至大于7時(shí)，CPT-11和SN-38的攝取降低。
利用倉(cāng)鼠腸細(xì)胞，本研究的結(jié)果顯示CPT-11和SN-38兩者的非離子內(nèi)酯形式主要通過被動(dòng)機(jī)理吸收，但是各自以幾倍于其陰離子羧化物形式的速率(表1,2和3；圖2,3和4)。在空腸和回腸細(xì)胞之間的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)理以及動(dòng)力學(xué)參數(shù)上存在明顯差異(表2和3)。雖然沒有顯示出來，在采用盲腸和結(jié)腸細(xì)胞完成CPT-11和SN-38的攝取時(shí)，也觀察到類似的結(jié)果(26)。
倉(cāng)鼠腸細(xì)胞對(duì)估價(jià)SN-38的細(xì)胞毒性作用不是最好的模型，這是由于它們有限地存活約2小時(shí)(Gore等，1993)。因此，HT29細(xì)胞也用來研究生理pH值對(duì)2μM[14C]SN-38的初始攝取速率和0.4(MSN-38的細(xì)胞毒性的相對(duì)作用。SN-38的初始攝取速率在HT-29細(xì)胞中比在分離的倉(cāng)鼠腸細(xì)胞中低(圖3和4)。然而，與在分離的倉(cāng)鼠腸細(xì)胞觀察的一樣，在HT29細(xì)胞中SN-38的攝取速率在pH6.2和6.8時(shí)明顯大于在pH7.4和8.0時(shí)(Kruskal-Wallis試驗(yàn)p=0.008,Dunn’s法p＜0.05)(圖7)。SN-38對(duì)HT29細(xì)胞的細(xì)胞毒性在pH6.2和6.8時(shí)明顯大于在pH7.4和8.0時(shí)(Kruskal-Wallis試驗(yàn)p=0.007；Dunn的方法p＜0.05)。圖5顯示[14C]SN-38的初始攝取速率和SN-38的細(xì)胞毒性之間的相互關(guān)系，表明在降低的pH下，更高的攝取速率與更強(qiáng)的細(xì)胞毒性相關(guān)聯(lián)。
結(jié)果清楚地顯示CPT-11和SN-38羧化物通過主動(dòng)機(jī)理被腸細(xì)胞取(表2和3；圖3)。前不久已經(jīng)報(bào)道，在肝小管膜中表達(dá)的cMOAT作為主要主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)轉(zhuǎn)運(yùn)幾種類型的有機(jī)陰離子進(jìn)入膽汁(24,27-29)。此外，已報(bào)道肝cMOAT對(duì)陰離子，SN-38羧化物，SN-3B-Glu內(nèi)酯以及羧化物的膽汁分泌起作用(12,17)。報(bào)道陰離子CPT-11羧化物僅部分通過cMOAT消除(12,17)。發(fā)明人的工作顯示，與CPT-11羧化物的不同，SN-38羧化物的初始攝取速率明顯受DNP-SG和SN-38-Glu的抑制(表3)。這些結(jié)果與cho等(12,17)利用肝小管膜泡的結(jié)果一致。因此，這一工作界定cMOAT或類cMOAT轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白牽涉到SN-38的空腸和回腸細(xì)胞攝取。
發(fā)明人也報(bào)道CPT-11內(nèi)酯和羧化物，以及SN-38內(nèi)酯，在存在高濃度的TCA時(shí)可以形成膠束(圖5)。單體濃度的百分比在38至47％的范圍內(nèi)。這些濃度不同于長(zhǎng)鏈脂肪酸的(即，油酸2.3％)和膽固醇的(3％)。此外，膠束形成抑制CPT-11攝取，不同于正向作用膽汁酸膠束形成，在長(zhǎng)鏈脂肪酸和膽固醇的腸攝取中起作用。這些結(jié)果支持顯示膠束形成抑制短鏈脂肪酸(如棕櫚酸)攝取的數(shù)據(jù)。
如

圖1中所描述的，從CPT-11和SN-18內(nèi)酯轉(zhuǎn)變至羧化物是受pH驅(qū)動(dòng)的(11,12)。以前已經(jīng)報(bào)道，在pH7.4時(shí)，SN-38和CPT-11分別有13％是其內(nèi)酯形式的(30)。本研究顯示CPT-11和SN-38的初始攝取速率在酸性pH值(pH6.2和6.8)幾倍于在中性或堿性pH值時(shí)(pH7.4和8)(圖6)?？紤]以下事實(shí)1)在酸性pH值，CPT-11和SN-38的非離子內(nèi)酯形式被被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)，2)在中性/堿性pH值，CPT-11和SN-38的陰離子羧化物形式主要是主動(dòng)吸收，和3)CPT-11和SN-38兩者的內(nèi)酯的攝取速率比它們的羧化物形式的大幾倍，CPT-11和SN38的腸細(xì)胞攝取機(jī)理密切類似短鏈脂肪酸。這一假說得到事實(shí)的支持，如同用短鏈脂肪酸，膠束形成降低CPT-11和SN-38的攝取，并且CPT-11和SN-38的攝取不限于小腸，而且也在盲囊與結(jié)腸中發(fā)生。
因此，對(duì)短鏈脂肪酸而言，膽汁的堿化和腸腔含量降低CPT-11和SN-38的腸攝取。從兩人(由順式鉑氨治療，并且靜脈內(nèi)接收CPT-11)測(cè)定CPT-11和其代謝物的膽汁含量(9)。膽汁的主要組分是CPT-11(75.6-91.9％)，而SN-38和SN-38-Glu是次要組分，分別為0.9-3.3％和7.3-18.9％。此外，人膽汁的pH值已報(bào)道在6.5-8.0的范圍內(nèi)(31)。因此，可以認(rèn)為，不僅CPT-11的羧化物而且內(nèi)酯形式在藥代動(dòng)力學(xué)中扮演著重要作用，這是因?yàn)镃PT-11內(nèi)酯在腸上皮細(xì)胞中較大的吸收，導(dǎo)致在腸肝循環(huán)中增加CPT-11水平。
SN-38主要以內(nèi)酯形式為活性，而SN-38羧化物僅顯示小的拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ-抑制活性(32)。利用大鼠全身放射自顯影，Ⅳ注射14C-SN-38 24小時(shí)后，在胃腸道中發(fā)現(xiàn)放射活性(33)。SN-38顯示強(qiáng)的細(xì)胞毒性，SN38-Glu是SN-38的去活化葡萄糖醛酸化形式，與SN-38相比，CPT-11有較低的細(xì)胞毒性(Kavato等，1991)。SN-38在腸中的積累在大鼠中顯示(Atsumi等，1995)，并且被認(rèn)為是對(duì)在裸鼠中施用CPT-11引起的腹瀉的反應(yīng)(Araki等，1993)。在CPT-11施用之后的腹瀉的小鼠和大鼠中觀察到盲囊中腸上皮破裂(Takatsuna等，1996；Ikuno等，1995；Araki等，1993)。已報(bào)道在人中由CPT-11施用引起的腹瀉為分泌腹瀉(Bleiberg和Cvitkovic,1996)。然而，如在動(dòng)物模型中報(bào)道的，在患者中我們觀察到與CPT-11-誘導(dǎo)的副作用相關(guān)聯(lián)的致死小腸損傷傷害(Kobayashi等，1998b)。
此外，SN-38的積累，放射活性僅在胃腸道中被發(fā)現(xiàn)(33)。SN-38在腸中的積累被證明是對(duì)裸鼠中CPT-11引起的腹瀉的反應(yīng)(34)。在盲囊中的腸上皮破裂被認(rèn)為是對(duì)在大鼠中CPT-11-引起的腹瀉的反應(yīng)(35)。最后，從歐洲的臨床評(píng)價(jià)來看，由CPT-1引起的腹瀉被說成是分泌腹瀉(36)，而在我們的研究中，應(yīng)用者們經(jīng)歷了嚴(yán)重的小腸損傷(37)。
尸體解剖揭示假膜空腸回腸炎的存在，在光學(xué)顯微鏡下，其特征是腸上皮的破裂，表明損壞性腹瀉可能在嚴(yán)重的情況下發(fā)生。CPT-11-引起的腹瀉的機(jī)理被認(rèn)為包括腸上皮的主要SN-38和CPT-11內(nèi)酯的再吸收，導(dǎo)致腸上皮對(duì)這些代謝物的高暴露，所說的代謝物引起腸道的結(jié)構(gòu)和功能損傷。
如本研究所揭示的，膽汁堿化和/或腸腔含量降低腸上皮對(duì)CPT-11和SN-38內(nèi)酯的攝取和暴露，腸的短鏈脂肪酸的吸收在過去十年中已有研究，并且曾有沖突的結(jié)果被報(bào)道。人們相信，降低pH值，導(dǎo)致降低攝取短鏈脂肪酸，如圖6中報(bào)道的。這樣，喜樹堿和CPT-11-引起的腹瀉的預(yù)防治療集中于兩個(gè)目標(biāo)1)腸腔的堿化，和2)從身體清除CPT-11和SN-38(即，大便控制)。在標(biāo)準(zhǔn)Ⅳ施用CPT-11之前和/或同時(shí)，給患者口頭施用pH大于7的碳酸氫鈉，氧化鎂和水的組合物，腹瀉的機(jī)會(huì)會(huì)降低。
在本研究中也估價(jià)了SN-38的細(xì)胞攝取和與它相聯(lián)系細(xì)胞毒性之間的關(guān)系。發(fā)現(xiàn)HT29細(xì)胞中，SN-38的細(xì)胞攝取和細(xì)胞毒性是pH-依賴性的，并且細(xì)胞毒性與初始攝取速率很好地相關(guān)(圖8)。如以前的描述，我們認(rèn)為，SN-38的占優(yōu)勢(shì)的形式在酸性pH值下是內(nèi)酯。這將導(dǎo)致SN-38內(nèi)酯較大的細(xì)胞攝取和胞內(nèi)濃度。由于SN-38主要以內(nèi)酯形式為活性，而SN-38羧化物僅顯示小的拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ-抑制活性(Kawato等，1991)，這應(yīng)當(dāng)與增加的細(xì)胞死亡相關(guān)。因此，有關(guān)CPT-11-引起的腹瀉的一種可能的機(jī)理也許包括腸上皮對(duì)SN-38內(nèi)酯的再吸收，導(dǎo)致腸道的結(jié)構(gòu)和功能損傷。
總之，本研究首先估價(jià)CPT-11和SN-38被腸上皮細(xì)胞的攝取。CPT-11和SN-38內(nèi)酯兩者都被被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)，而CPT-11和SN-38羧化物被主動(dòng)吸收。CPT-11和SN-38內(nèi)酯的攝取速率幾倍于各自的羧化物形式。此外，在HT29細(xì)胞中，高的SN-38的攝取速率與增加的細(xì)胞毒性相聯(lián)系。這些研究結(jié)果說明向羧化物轉(zhuǎn)變將導(dǎo)致CPT-11和SN-38兩者的細(xì)胞攝取。因而，這些研究結(jié)果對(duì)作為一種可能的機(jī)理，堿化腸腔以在臨床實(shí)踐中降低CPT-11和SN-38的再吸收提供了支持?？赡艿氖?，有限的腸再吸收反過來調(diào)節(jié)這一藥物腸肝循環(huán)的生物利用率，并且降低SN-38對(duì)腸上皮的毒副作用。
導(dǎo)致直接影響臨床實(shí)踐，以及喜樹堿化合物的施用，，通過肝被清除，如鹽酸伊立替康，以及其衍生物。發(fā)明者提供了喜樹堿化合物的施用的口頭的堿化通過肝被清除，包括CPT-11。
總而言之，發(fā)明人描述了喜樹堿化合物(如CPT-11和SN-38)由腸上皮的攝取。盡管通過不同的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)理，CPT-11和SN-38內(nèi)酯兩者由腸細(xì)胞被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)。CPT-11和SN-38羧化物兩者被主動(dòng)吸收。TCA膠束的形成降低CPT-11和SN-38兩者的攝取。CPT-11和SN-38內(nèi)酯的攝取速率高于羧化物形式的幾倍，而在碳酸氫鹽的存在下和在增加的pH值條件下，攝取速率降低。這些有關(guān)CPT-11和SN-38的研究結(jié)果在臨床實(shí)踐中可能是有用的。
表Ⅰ腸細(xì)胞對(duì)CPT-11和SN-38的初始攝取速率空腸 回腸 比較了[14C]CPT-11(20μM)和[14C]SN-38(2μM)各自的內(nèi)酯和羧化物的攝取初始速率。結(jié)果以pmol·106細(xì)胞-1·min-1表示，并且是10次實(shí)驗(yàn)的平均值±SE。Mann Whitney試驗(yàn)用于統(tǒng)計(jì)分析。
表Ⅱ CPT-11和SN-38由腸細(xì)胞攝取的動(dòng)力學(xué)參數(shù)空腸 回腸KmVmaxKdKmVmaxKdCPT-11 內(nèi)酯 ND ND 0.95 NDND 1.06(0.15) (0.28)羧化物 51.3146.9＜0.0550.5157.3 ＜0.05(16.3) (41.3) (＜0.02) (13.0) (38.0) (＜0.02)SN-38內(nèi)酯* ND ND 2.38 ND ND 1.87(0.26) (0.10)羧化物* ND ND 0.44 ND ND 0.42(0.17) (0.01)(*)由于有限的溶解性，僅研究了SN-38達(dá)2μM的濃度。
(+)由于從在二硝基苯酚的存在下SN-38羧化物攝取的評(píng)價(jià)中，SN-38羧化物被定為主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)(表3)，這些值不被認(rèn)為是生理學(xué)相關(guān)的。
注數(shù)據(jù)用方程式V=(VmaxS)/(Km+S)+KdS經(jīng)最小二乘法非線性回歸分析處理，其中V代表攝取的初始速率，Vmax(pmol·106細(xì)胞-1·min-1)是攝取的最大速率，Km(μM)是表觀米氏常數(shù)，Kd(pmol·106細(xì)胞-1·min-1·μM-1)是擴(kuò)散速率，S(μm)是CPT-11或SN-38的濃度。值是平均值±SE。CPT-11內(nèi)酯，SN-38內(nèi)酯以及SN-38羧化物的攝取的主要組分分別是不可飽和的，因此，Km和Vmax值沒有測(cè)定(ND)
表Ⅲ二硝基苯酚，SN38-Glu和DNP-SG對(duì)CPT-11和SN-38初始攝取速率影響CPT-11羧化物 SN-38羧化物 CPT-11內(nèi)酯 SN-38內(nèi)酯空腸回腸空腸回腸空腸回腸空腸回腸二硝基苯酚(1mM)平均值 22.629.225.530.894.1105.5 96.1 134.9(SE)(13.5) (9.2) (12.4) (13.1) (18.4) (15.6) (14.7) (19.0)P值1(n=5) 0.016 0.008 0.0080.016NS NS NS NSSN38-Glu(200μM)平均值 108.9 93.9 40.1*28.9*88.9 NE 54.3NE(SE)(22.1) (14.3) (11.1) (11.2) (15.3)(20.6)DNP-SG(200μM)平均值103.2 105.832.0*28.5*105.4 NE 78.8NE(SE)(17.0) (36.3) (9.9)(11.9) (12.7) (24.4)P值2(n=5) NS NS 0.0070.020NSNSNE，未評(píng)估；NS，與對(duì)照無明顯不同。
注在分別添加[14C]CPT-11(20μM)和[14C]SN-38(2μM)之前，將二硝基苯酚，SN-38葡糖苷酸(SN38-Glu)或2,4-二硝基苯基-S-谷胱甘肽(DNP-SG)添加到指示細(xì)胞懸液中(詳細(xì)內(nèi)容參見材料和方法)。在每種化合物的存在下CPT-11和SN-38的初始攝取速率以對(duì)照的百分比表示。二硝基苯酚和其對(duì)照之間的區(qū)別用1Mann-Whitney試驗(yàn)估價(jià)。SN-38Glu,DNP-SG以及它們的對(duì)照中間的區(qū)別用2Kriskal-Wallis試驗(yàn)估價(jià)，并且根據(jù)Durm’s法(*p＜0.05)分析與各自對(duì)照的顯著性差異。鹽酸伊立替康制劑在優(yōu)選的實(shí)施方案中，碳酸氫鈉，氧化鎂和水以pH值高于約7，優(yōu)選地8-10，最優(yōu)選地8-9施用給用喜樹堿化合物(如CPT-11和其衍生物)治療的患者。
此外，本發(fā)明的CPT-11化合物在對(duì)人類和動(dòng)物的全身的施用的藥物組合物中有用，其以單劑形式，如片劑，膠囊，丸劑，粉末，微粒，栓劑，無菌腸胃外溶液或懸液，無菌非腸胃外溶液或懸液，口服溶液或懸液，水包油或油包水乳劑等，它們包含合適量的有效成分。對(duì)于口服，固體或液體兩種單劑都可以以化合物制備。所說的化合物在帶有載體的活性成分的藥物組合物中有用，活性成分約(wt％)1到20％，優(yōu)選地約5到15％。
液體或固體單劑形式可以容易地制備供口服施用。例如，CPT-11可以與常規(guī)組分混合，如磷酸二鈣，鋁硅酸鎂，硬脂酸鎂，硫酸鈣，淀粉，滑石，乳糖，阿拉伯膠，甲基纖維素，以及作為藥物賦形劑和載體的功能性類似材料?？梢砸部梢圆皇┯贸掷m(xù)釋放制劑?？梢酝ㄟ^將化合物與藥物稀釋劑混合來制備膠囊，將這種混合物插入到具有合適大小的硬明膠囊中。如果軟膠囊是所需的，可以將化合物的漿狀物與可接受的蔬菜，石油醚，或其它惰性油通過機(jī)器包裹少明膠囊中。
懸液，糖漿以及酏劑可以用于液體單劑形式的口服。包含油的液體制劑可以用于油溶性形式。蔬菜油(例如，玉米油，花生油或紅花油)與調(diào)味劑，甜味劑以及任何防腐劑一道產(chǎn)生可接受的液體制劑?？梢蕴砑颖砻婊钚詣┑剿幸孕纬晒┮后w單位給藥的糖漿?？梢允褂镁哂锌山邮艿奶鹞秳?如糖，糖精或生物增甜劑以及調(diào)味劑的酏劑形式的水-醇藥物制劑。
腸胃外和栓劑施用的藥物組合物也可以利用本領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)獲得。
合適的藥物載體包括無菌水；鹽水，葡萄糖；在水或鹽水中的葡萄糖；蓖麻油和環(huán)氧乙烷的縮合產(chǎn)品(每摩爾蓖麻油組合約30到約35摩爾的環(huán)氧乙烷)；液態(tài)酸；低級(jí)阿卡諾爾；油(如玉米油；花生油，芝麻油等)，具有乳化劑(如脂肪酸或磷脂的單或二甘油酯，如lecitbin等)；乙二醇；聚亞烷基二醇；有懸浮劑(如，羧甲基纖維素鈉)存在的含水介質(zhì)；褐藻酸鈉；聚(聚乙烯吡咯烷酮)等；它們單獨(dú)地或與合適的分散劑(如卵磷脂；聚氧化乙烯硬脂酸鈉)等一起；載體也可以含有與本發(fā)明的滲透增強(qiáng)劑一起的佐劑，如保存穩(wěn)定劑，潤(rùn)濕劑，乳化劑等。
哺乳動(dòng)物的有效劑量可以隨一些因素變化，例如，年齡，體重水平，被治療者的身體狀況等。典型地，根據(jù)本發(fā)明的化合物的有效劑量在口頭或直腸給藥時(shí)，是從約10mg/m2到700mg/m2，每日1-3次。CPT-11可以優(yōu)選地每周施用一次，用藥1到5周。用于癌癥和腫瘤治療的CPT-11的施用次數(shù)和劑量是已知的。鹽酸伊立替康的施用鹽酸伊立替康(Pharmacia-Upjohn)的平均最終排除的半衰期是約6小時(shí)。
喜樹堿化合物可以單獨(dú)施用，也可以與組合化療藥物結(jié)合起來施用，包括甲酰四氫葉酯，順式鉑氨，5-FU,oxiplatin以及其它已知化療藥物。在一可替實(shí)施方案中，喜樹堿中化合物(如鹽酸伊立替康)也可以與洛派丁胺一起施用。
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進(jìn)行以上描述和給出一些實(shí)施例的目的是為了說明本發(fā)明的實(shí)施方案，而沒有任何限制本發(fā)明的意思。本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚，對(duì)本發(fā)明的組合物和方法可以進(jìn)行各種修改和變化而不偏離本發(fā)明的精神和范圍。本文所引用的所有專利和出版物以其整體本文一并參考。
權(quán)利要求
1．一種抑制喜樹堿化合物的腹瀉副作用的方法，該方法包括在堿性pH值下施用所說的喜樹堿化合物。
2．根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所說的喜樹堿化合物選自鹽酸伊立替康(CPT-11)、SN-38-Glu、SN-38和其衍生物。
3．根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于保持腸腔與膽汁處于堿性pH值狀態(tài)。
4．根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于靜脈內(nèi)、口頭或肌內(nèi)施用鹽酸伊立替康。
5．根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所說的喜樹堿化合物的經(jīng)腸再吸收受到抑制。
6．一種治療癌癥的方法，該方法包括在保持腸腔處于堿性pH值狀態(tài)的同時(shí)，施用喜樹堿化合物和其衍生物。
7．根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所說的癌癥選自乳腺癌、卵巢癌、結(jié)腸癌、惡性黑素瘤、小細(xì)胞肺癌、甲狀腺癌、淋巴瘤和白血病。
8．根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所說的堿性pH值是pH值從7至10。
9．根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所說的堿性pH值是pH值從7開始。
10．根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所說的堿性pH值是pH值從6開始。
11．根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所說的堿性pH值是pH值從9開始。
12．根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所說的堿性pH值是pH值從10開始。
13．一種治療愛滋病的方法，該方法包括在保持腸腔處于堿性pH值狀態(tài)的同時(shí)，施用喜樹堿化合物和其衍生物。
14．一種治療癌癥的方法，該方法包括在保持腸腔處于堿性pH值狀態(tài)的同時(shí)，施用選自下組的化合物7-羥甲基喜樹堿、鹽酸伊立替康、氨基喜樹堿、DX-8951F、SN-38、HAR4、HAR5、HAR6、HAR7、HAR8和topotecan。
15．一種包含藥物組合物的試劑盒，所說的組合物含有鹽酸伊立替康(CPT-11)，該鹽酸鹽與適量的為保持腸腔處于堿性pH值狀態(tài)的碳酸氫鹽組合在一起。
16．根據(jù)權(quán)利要求15所述的組合物，其特征在于所說的碳酸氫鹽選自碳酸氫鈉、碳酸氫鎂、碳酸氫鉀和它們的混合物。
17．一種施用喜樹堿化合物的方法，該方法包括在施用所說的喜樹堿化合物之前或同時(shí)，口頭施用包含硼酸的組合物。
18．一種施用喜樹堿化合物的方法，該方法包括在施用所說的喜樹堿化合物之前或同時(shí)，口頭施用包含烏索脫氧膽酸的組合物。
全文摘要
本發(fā)明提供了能降低腹瀉副作用的施用喜樹堿化合物(例如鹽酸伊立替康)的方法,以及用喜樹堿化合物治療癌癥與艾滋病的方法,所說的方法包括在保持腸腔與膽汁處于堿性pH值狀態(tài)的同時(shí),施用喜樹堿化合物。
文檔編號(hào)A61P43/00GK1325305SQ99801114
公開日2001年12月5日 申請(qǐng)日期1999年6月18日 優(yōu)先權(quán)日1998年6月18日
發(fā)明者伯納德·布斯卡雷爾, 小林國(guó)彥 申請(qǐng)人:喬治華盛頓大學(xué)