專利名稱：含有與前體藥物結合的抗體－酶偶聯(lián)物的藥物組合物的制作方法
偶聯(lián)物的藥物組合物發(fā)明領域本發(fā)明涉及用于酶-前體藥物治療的組合物和試劑盒，其中酶與載體偶聯(lián)。
背景技術：
腫瘤疾病的化學療法常常由于限制給藥劑量的不利系統(tǒng)毒性而受到破壞或者由于多藥抗性的出現(xiàn)而受到限制。已采取幾種策略以改善藥物導向并使腫瘤中的藥物濃度提高到克服臨床上相關的幾種藥物抗性的水平。
前體藥物已在醫(yī)藥領域使用多年用于治療各種失調。它們能提供改善的可溶性、改善的藥物動力學和組織分布、不利代謝的避免、選擇性器官效應和特異性腫瘤毒性。為使前體藥物用作抗癌劑，腫瘤必須有高水平的能活化前體藥物的酶或必須向其中傳遞外源酶，并且在正常組織中必須沒有活性酶的存在。前體藥物必須是無害及藥物動力學惰性的，并且是具有有利Km和Vmax值的酶底物。
已經(jīng)很好地建立了使用抗體偶聯(lián)物(conjugate)或逆轉錄病毒載體將酶傳遞給腫瘤的抗體定向酶前體藥物療法(ADEPT)(參考文獻1、2)和基因/病毒定向酶前體藥物療法(G/VDEPT)(參考文獻3)的思想。在ADEPT中，將代謝正常不被哺乳動物細胞代謝的底物的外源酶與腫瘤特異的或腫瘤相關的抗體化學連接；靜脈注射抗體偶聯(lián)物并且通過識別腫瘤相關抗原強烈結合到腫瘤上。在VDEPT中，逆轉錄病毒設計為帶有表達可以選擇性地傳遞給腫瘤的預選酶基因或在腫瘤特異性啟動子控制之下的預選酶基因。然后外源酶用于活化精心設計的低分子量前體藥物。動物模型和人體試驗研究已證明可以選擇性地向實體瘤傳遞活性酶如羧肽酶G2、青霉素酰胺酶、β-內酰胺酶、β-葡糖醛酸酶、胞嘧啶脫氨酶、硝基還原酶或堿性磷酸酶(參考文獻4、5)。
兩種方法都有許多內在限制。以ADEPT為例，這些限制包括抗體-酶偶聯(lián)物的免疫原性、需要修飾每一偶聯(lián)物以靶向腫瘤上存在的抗原，優(yōu)化給藥時間表的困難以及在ADEPT中使用清除抗體的需要(參考文獻6)。以VDEPT為例，有與病毒載體相關的內在危險，由于特異性地向癌細胞傳遞基因的問題而導致的腫瘤中酶表達特異性的潛在缺乏以及在病人基礎上評估酶表達持續(xù)時間和可重復性的困難導致優(yōu)化后續(xù)前體藥物時間表時的困難。
近年來，對作為抗癌藥物載體的多聚物(polymer)進行了大量研究(在參考文獻7中綜述)。大量此項工作的基礎是有毒藥物與高分子量載體的結合導致系統(tǒng)毒性的降低、體內滯留時間的延長、生物分布的改變、治療功效的改善以及通過增強的滲透性和保持(EPT)效應而引起的點特異性被動捕捉。EPR效應是由于腫瘤新維管結構不連續(xù)內皮的滲漏，由其中增強的大分子或小顆粒滲透性引起。除了腫瘤血管發(fā)生(多維管結構癥)以及血管網(wǎng)的不規(guī)則和不完整，伴隨的淋巴引流缺乏也促進外滲大分子的積累。對于大分子試劑和脂類，可在許多實體瘤中觀察到此效應。增強的血管滲透性將支持腫瘤快速生長對營養(yǎng)和氧的大量需求。除非特別指出腫瘤細胞通過受體介導的胞吞作用進行吸收，進入腫瘤內環(huán)境的多聚物通過液相胞飲作用相對緩慢地得到吸收。
許多以多聚物為基礎的抗癌劑，現(xiàn)在已進入臨床或正在通過臨床試驗；每一種抗癌劑與傳統(tǒng)藥物相比已證實了此觀念。例如，N-(2-羥丙基)甲基丙烯酰胺(HPMA)共聚物-阿霉素偶聯(lián)物已在早期臨床試驗中表現(xiàn)出前景(參考文獻9、10)。并且，未滲透入腫瘤但保留在循環(huán)中的殘留HPMA共聚物偶聯(lián)物快速分泌出來，給出較高的腫瘤血比(參考文獻11)。
在大多數(shù)情況中，多聚物載體上活性抗癌藥物的釋放由簡單水解作用或由蛋白水解或酯酶介導(參考文獻12、13)。因為這些反應的條件不必然限定于腫瘤組織，所以一些非特異性藥物釋放是不可避免的。
水溶性多聚物與藥理學活性蛋白如酶、毒素、免疫球蛋白、細胞因子或過敏原的偶聯(lián)可用于減少這些蛋白蛋白水解上的降解、改善它們的生物學效力并延長血漿清除作用，同時減弱蛋白的免疫原性。例如，HPMA共聚物-天冬酰胺酶偶聯(lián)物已用于治療白血病。酶與多聚物的偶聯(lián)已表現(xiàn)增強酶的循環(huán)時間，其中酶的活性在去除白血病細胞的天冬酰胺方面是有用的。
發(fā)明概述根據(jù)本發(fā)明，產(chǎn)品或試劑盒包含兩種成分，即安排或適于對人或動物順序給藥的兩種藥物組合物。第一種成分是酶偶聯(lián)物，例如包含藥學上可接受的賦形劑和酶偶聯(lián)物的組合物。酶偶聯(lián)物可由與多聚物或其它載體共價結合的酶組成，便得酶偶聯(lián)物可保持其酶活性。第二種成分是前體藥物，例如包含藥學上可接受的賦形劑和前體藥物的組合物。前體藥物一般基本上無活性(在藥物活性方面)但能通過酶活化。
應當指出除非本文特別指出產(chǎn)品給藥的順序，此處提及的“第一種”和“第二種”組合物不表示任何具體給藥順序。
試劑盒的兩種成分用于類似于ADEPT的治療方案，除了施用酶偶聯(lián)物而不是抗體-酶偶聯(lián)物。一個顯著差異是在采用本發(fā)明時兩種成分可以任一順序給藥。例如，含前體藥物的組合物可首先給藥。本發(fā)明能避免由抗體-酶偶聯(lián)物的免疫原性引起的ADEPT的問題。而且，盡管多聚物載體不是特異性地靶向腫瘤細胞表面的抗原位點，但仍可預期它能通過EPR效應優(yōu)先在實體瘤中積累。已觀察到ADEPT在體內是驚人地非特異性的，并且可以相信多聚物-酶偶聯(lián)物可能表現(xiàn)出與ADEPT中表現(xiàn)的同樣顯著的優(yōu)先積累。
附圖描述

圖1表示通過β-內酰胺酶從頭孢菌素連接的前體藥物中釋放藥物的反應機制；圖2表示實施例1和2的反應；圖3是表示HPMA-Gly-Gly-ONp和β-內酰胺酶混合反應后的光譜的圖；圖4是表示通過β-內酰胺酶和通過HPMA-β-內酰胺酶偶聯(lián)物降解芐青霉素的圖；圖5是表示患B16F10黑色素瘤的C57小鼠血液中游離和偶聯(lián)的放射性標記β-內酰胺酶的柱形圖；圖6是表示患B16F10黑色素瘤的C57小鼠中游離和偶聯(lián)的放射性標記β-內酰胺酶的腫瘤積累的柱形圖；圖7表示可通過組織蛋白酶B切割的前體藥物PR1的結構；圖8是表示通過游離和偶聯(lián)的組織蛋白酶B以及沒有組織蛋白酶B時從HPMA-Gly-Phe-Leu-Gly-dox釋放阿霉素的圖；圖9是表示通過游離和偶聯(lián)的組織蛋白酶B從患B16F10黑色素瘤的C57小鼠中的PK1釋放阿霉素的柱形圖；并且圖10是表示對患B16F10鼠黑色素瘤的C57黑色雄性小鼠進行4次HPMA共聚物-組織蛋白酶B給藥之后阿霉素從PK1釋放的圖。
發(fā)明描述優(yōu)選的是酶偶聯(lián)物的分子量應得到修飾以優(yōu)化腫瘤中偶聯(lián)物的積累。因此分子量應足夠高以使偶聯(lián)物不通過正常內皮但通過滲漏的新維管結構進入腫瘤并通過阻止從其中清除而得以積累。但是，分子量還應足夠低以從腎清除殘余的非腫瘤積累的偶聯(lián)物。偶聯(lián)物的總分子量優(yōu)選地應小于1000kD，更優(yōu)選地是小于100kD，并且優(yōu)選地至少20kD。
酶偶聯(lián)物的載體優(yōu)選地是多聚物，如酶可與之形成共價鍵的水溶性多聚物。多聚物和酶之間的鍵應允許保持偶聯(lián)物的酶活性。因此多聚物可通過間隔基團與酶結合使得多聚物主鏈和酶之間有一段距離，避免酶活性位點的空間阻礙。為避免降解，使用分子量至少30kD的多聚物可能是優(yōu)選的。
在酶偶聯(lián)物中，每一個酶分子可通過一個或多個連接與多聚物分子結合，優(yōu)選地通過單獨的共價鍵連接。并且，平均每一個多聚物分子可以有少于一個酶分子與之結合。然而優(yōu)選地，與多聚物分子結合的酶分子的平均數(shù)是至少1個，更優(yōu)選地1到5個。優(yōu)選的比例取決于酶的分子量、多聚物的分子量和通過EPR效應在腫瘤中積累的偶聯(lián)物的最佳總分子量。
已用作載體并且其偶聯(lián)物看來通過EPR效應積累的適當多聚物包括聚乙二醇、乙烯乙二醇共聚物、糊精、羥烷基(甲基)丙烯酰胺多聚物和共聚物如羥丙基甲基丙烯酰胺以及苯乙烯與順丁烯二酸酐的共聚物?？梢允褂玫钠渌嗑畚锇ǘ嗑郯肴樘侨┧?、羥烷基(甲基)丙烯酸鹽的共聚物如N-苯基吡咯烷酮、多聚(L-谷氨酸羥乙基-L-谷氨酰胺)、多聚(α-順丁烯二酸)、多聚天冬氨酸-PEG共聚物、多聚-L-賴氨酸以及聚乙烯亞胺的共聚物。
盡管酶-多聚物偶聯(lián)物在實體瘤中的定位首先依靠EPR，但結合確?；钴S導向的配體是有利的。例如，結合半乳糖配體以將偶聯(lián)物導向肝是有利的。選擇性地，可將黑色素細胞刺激素與多聚物結合作為黑色素瘤的配體。如果需要，可將抗體作為配體連接到多聚物上，使抗體導向目的靶組織的特異性抗原位點。盡管這樣的抗體-多聚物-酶偶聯(lián)物的使用在減弱免疫原性方面有一些超過在正常ADEPT系統(tǒng)中使用的抗體-酶偶聯(lián)物的優(yōu)點，本發(fā)明優(yōu)選地避免使用酶偶聯(lián)物的活躍導向配體。
酶偶聯(lián)物包括功能性酶。偶聯(lián)物優(yōu)選地保持高水平酶活性。只要保留了高水平的有用活性，與天然酶相比其活性水平可以降低。
用于本發(fā)明的前體藥物可以是相對低分子量的化合物。酶對前體藥物的作用可能并不顯著改變化合物的分子量。適當前體藥物和活化前體藥物的酶的有用總結在參考文獻5的表1中給出，參考文獻5是引用了很多參考文獻的綜述文章，其中描述了前體藥物及其使用的完整細節(jié)。因此酶可選自DT-心肌黃酶、纖溶酶、羧肽酶G2、胸腺嘧啶激酶(病毒的)、胞嘧啶脫氨酶、葡萄糖氧化酶、黃嘌呤氧化酶、羧肽酶A、α-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、偶氮還原酶、γ-谷氨酰轉移酶、β-葡糖醛酸酶、β-內酰胺酶、堿性磷酸酶、氨肽酶、青霉素酰胺酶和硝基還原酶。
一個優(yōu)選的酶是β-內酰胺酶。β-內酰胺酶是一組具有不同特異性的酶，但所有酶都能使β-內酰胺水解成取代的β-氨基酸。一些酶更易作用于青霉素，而其它酶則對頭孢菌素有更強的活性。β-內酰胺酶活性對于哺乳動物系統(tǒng)不是內源性的并且因此易受到來自抑制劑、酶底物或內源酶系統(tǒng)的最低限度干擾。
一系列不同芥子(mustard)的頭孢菌素衍生物(參考文獻14)和阿霉素(參考文獻15)的合成已得到描述并且這些物質是酶的相對好的底物。多聚物和抗癌藥物之間的間隔將含有以青霉素或頭孢菌素形式的β-內酰胺環(huán)。β-內酰胺酶切割內酰胺環(huán)并在化學重排后(如圖1表示)產(chǎn)生藥物?？山Y合許多細胞毒性試劑，只要它們具有可替換的NH2或OH基團并因此可作用為前體藥物。水解率通過吸光度變化進行體外測量。
另一類優(yōu)選的酶是蛋白酶/肽酶。硫醇依賴的蛋白酶如組織蛋白酶B是特別優(yōu)選的。
前體藥物在藥物活性上應是基本上無活性的。因此活化的藥物應優(yōu)選地具有前體藥物活性至少100倍的活性，最優(yōu)選地具有前體藥物至少1000倍的活性。
藥物可選自抗腫瘤劑、抗生素、抗代謝劑、烷化劑、生物堿類和微管抑制劑和信號轉導調節(jié)物。優(yōu)選地，它是細胞毒素試劑，因為本發(fā)明主要用于癌癥的治療。因此藥物可以是任何已知的、酶活化的、能以前體藥物形式提供的細胞毒素試劑。
藥物及其預期的前體藥物以及相應活化酶的適當目錄在參考文獻5的表1中給出。因此藥物可選自5-(Azurubub-1-基)-4-二羥基氨基-2-硝基苯甲酰胺苯二胺芥子苯甲酸芥子(各種)Gangcyclouir三磷酸腺嘌呤阿拉伯核苷三磷酸(araATP)5-氟尿嘧啶過氧化氫超氧化物，過氧化氫氨甲蝶呤氰化物苯二胺芥子類(各種)苯二胺芥子苯酚芥子Anthracyclines如表阿霉素、阿霉素和道諾紅菌素4-脫乙酰長春堿-3-carboxhydrazide
氮芥子(各種)絲裂霉素醇表鬼臼毒素吡喃葡糖苷巖沙海葵毒素苯丙氨酸氮芥5-(氮丙啶-1-基)-4-羥胺-2-硝基苯酰胺放射菌素D，絲裂霉素CTaxanes，如紫杉醇和taxotere拓撲異構酶抑制劑如喜樹堿和topotecan優(yōu)選地，前體藥物包含與藥物偶聯(lián)的載體。在一些情況下，前體藥物的酶活化不伴隨活化藥物從多聚物偶聯(lián)物的釋放這一點可能是有利的。因此，活化的藥物-多聚物偶聯(lián)物可以帶有通過不被酶切割的連接部分與藥物部分結合的多聚物，而藥物活性仍得以保留。選擇性地，通過酶反應對前體藥物的活化可獨立于藥物部分從多聚物偶聯(lián)物的切割發(fā)生，例如通過連接藥物部分與多聚物的銜接物上的分開的酶活性。
然而對于前體藥物-多聚物偶聯(lián)物的活化，優(yōu)選的是通過易于被酶切割的銜接物的斷裂發(fā)生活化。
因此銜接物可以是頭孢菌素銜接物，可按參考文獻15中所述的通過β-內酰胺酶進行切割。然而優(yōu)選地，銜接物是肽部分并且酶是以肽銜接物作為底物的肽酶。
在本發(fā)明的另一實施方案中，前體藥物包含通過肽基銜接物連接在一起的多聚物與藥物部分的偶聯(lián)物并且酶偶聯(lián)物包含與載體部分結合的酶。偶聯(lián)物和前體藥物是安排用于順序給藥的包含兩種組合物的新試劑盒的成分，每種組合物含有前述偶聯(lián)物之一。
多聚物和藥物部分的偶聯(lián)物優(yōu)選地具有5kD到1000kD范圍內、更優(yōu)選地20kD到100kD范圍內的分子量。
在本發(fā)明的這一方面，酶偶聯(lián)物可以是如用于本發(fā)明第一方面的多聚物-酶偶聯(lián)物。它也可以是例如ADEPT中所用的抗體-酶偶聯(lián)物。選擇性地，載體可以是能被活躍地導向所希望的靶細胞或可特異性結合其它蛋白或成分的另一類型分子。例如，載體可包含能與環(huán)境中存在的載體或細胞表面的受體特異性結合的激素或其它特異性部分。
用于本發(fā)明這一方面的酶是能切割前體藥物偶聯(lián)物肽基銜接物的肽酶。銜接物的切割優(yōu)選地導致活性藥物的釋放。選擇性地，酶反應產(chǎn)物可進一步通過后續(xù)步驟反應以在原位產(chǎn)生活性藥物。優(yōu)選地，肽酶是僅切割特異性肽序列的特異性酶，并且不是非特異性的肽酶。
肽基銜接物包含足夠的氨基酸單位以保證特異性結合和通過肽酶進行的切割。優(yōu)選地，銜接物至少2個氨基酸長，更優(yōu)選地至少3個氨基酸長，例如4個或更多氨基酸長。
同樣在本發(fā)明的這一方面，藥物優(yōu)選地是細胞毒性藥物。肽基銜接物通過在腫瘤中存在的與組織相比相對高水平的酶來切割是方便的。適當?shù)拿甘橇虼家蕾嚨牡鞍酌?，例如組織蛋白酶B。組織蛋白酶B的特異性底物是Gly-Phe-Leu-Gly銜接物。
多聚物、銜接物與藥物的偶聯(lián)可使用傳統(tǒng)化學和生化技術進行。例如，多聚物上的基團可與使用的肽化合物反應并且具有肽側鏈的多聚物隨后可與藥物分子反應。選擇性地，可多聚化的肽化合物易于獲得并且與其它單體共聚化以形成帶有肽基團的多聚物，藥物化合物可與之反應。Gly-Phe-Leu-Gly-阿霉素-HPMA偶聯(lián)物的合成在參考文獻16中描述。參考文獻17中偶聯(lián)物表現(xiàn)與游離的阿霉素相比減弱的毒性和改善的抗腫瘤活性。
本發(fā)明的另一方面在于使用硫醇依賴的蛋白酶作為酶/前體藥物療法的酶成分。新的偶聯(lián)物含有與載體共價結合的硫醇依賴的蛋白酶，所述偶聯(lián)物保持硫醇依賴的蛋白酶活性。酶優(yōu)選地是組織蛋白酶B。偶聯(lián)物可作為藥物組合物或試劑盒的一部分提供。
在此，發(fā)明的第三方面，載體與第二方面一樣可以是抗體或其它活躍導向成分，但優(yōu)選地是多聚物。盡管對于硫醇依賴的蛋白酶-多聚物偶聯(lián)物優(yōu)選的是不被活躍導向的，但是提供具有活性配體如抗體和其它特異性結合成分的多聚物是可能的。
產(chǎn)品或試劑盒包含新的偶聯(lián)物和含有通過可被硫醇依賴的蛋白酶切割的銜接物與載體結合的藥物的前體藥物。
在本發(fā)明的每一方面，成分可用于治療方法。治療將是與藥物相關聯(lián)的治療。每種成分應該給藥的量取決于治療條件的性質和所使用的特定藥物，這對于本領域普通技術人員是顯而易見的。典型的量和劑量方案可與相關方法相同或類似，并可在需要時加以調整。
在本發(fā)明的每一方面，成分可對病人以任一順序給藥。優(yōu)選的是選擇給予第一種組合物使得它通過EPR在腫瘤中積累。優(yōu)選地，給予的第一種組合物中的成分能由腎在短于例如12小時、優(yōu)選地短于6小時(循環(huán)半壽期)時期后從循環(huán)正常清除。首先給予前體藥物偶聯(lián)物是特別方便的，從而實現(xiàn)腫瘤中的快速積累以及隨后潛在毒性前體藥物通過經(jīng)由腎的分泌有從循環(huán)的清除。這明顯優(yōu)于其中必須施用首先酶的ADEPT系統(tǒng)。
當首先給藥的成分未從循環(huán)充分清除時，通過施用清除成分從循環(huán)清除該成分可能是適當?shù)?。第一種給藥成分可與適于與抗配體結合的配體共同提供。此成分因此能通過包含抗配體和使清除成分適于從循環(huán)清除的部分的第二種清除成分從循環(huán)中清除。
優(yōu)選地，新方法中首先給藥的成分是前體藥物。因此它應適于優(yōu)化其EPR而由此優(yōu)化腫瘤積累。盡管在這樣的優(yōu)選實施方案中，因為酶偶聯(lián)物一般是基本上是無毒性的，第二位給藥的酶偶聯(lián)物利于優(yōu)先導向腫瘤，但酶偶聯(lián)物在適于優(yōu)化EPR效應方面更不重要。酶偶聯(lián)物的循環(huán)時間應足夠長以在基本上所有前體藥物的目的位點活化。兩種組合物給藥之間的時間差異可以是幾小時或甚至幾天?？刂聘鱾€偶聯(lián)物的分子量產(chǎn)生最佳給藥方案的控制級別。
本發(fā)明第三方面的優(yōu)點是前體藥物在腫瘤中優(yōu)先積累時將通過在腫瘤中細胞內以增高水平存在的內源硫醇依賴的蛋白酶在細胞內活化并且通過硫醇依賴的蛋白酶-載體偶聯(lián)物在細胞外活化。這提供了可轉運到不含活性藥物的細胞中的細胞外活性藥物。
發(fā)明參考附圖的圖2等在下列實施例中得到進一步說明。實施例1HPMA-β-內酰胺酶偶聯(lián)物β-內酰胺酶(Sigma公司；～29kDa)于控制的pH通過ONp基團的非特異性氨解反應與多聚物載體N-(2-羥基丙基)甲基丙烯酰胺-甘氨酸-甘氨酸-P-硝基苯酚(HPMA-Gly-Gly-ONp；Polymer Laboratories；～30kDa)結合。反應在圖2中表示。進行了下列步驟將側鏈P-硝基苯酚(ONp)基團上帶有的多聚物溶于雙蒸水(4mg/ml)中并將此β-內酰胺酶溶于pH7.2的0.05M磷酸緩沖液中(2mg/ml)，并且將此溶液在攪拌下于4℃加入到多聚物溶液中。
反應混合物在黑暗中于pH7.2攪拌30分鐘。通過加入飽合的四硼酸鈉緩沖液在超過4小時時間內將pH小心升高到8.5(為防止酶變性)，并將反應混合物再攪拌4小時。通過加入1-氨基-2-丙醇(相對于原始ONp基團的1/2量)去除未反應的ONp基團來終止反應。溶液酸化到pH7.2。
為去除游離的多聚物和游離的酶，通過用于分離的Spectra/PORCE(Cellulose Ester)無菌50kDa分子量去除DispoDialyzer純化偶聯(lián)物。
偶聯(lián)反應之后進行紫外分光光度法測定，表明P-硝基苯酚從HPMA-共聚物的釋放。與HPMA結合的ONp在λmax 270nm吸收而游離的ONp在400nm吸收。光譜在圖3中表示。
蛋白以濃度依賴方式將堿性Cu(II)還原成Cu(I)。辛可寧二酸(Bicinchoninic acid)是對Cu(I)高度特異的生色劑，形成在562nm有最大吸光度的紫色復合物。吸光度直接與蛋白濃度成比例。
辛可寧二酸分析的結果在下表中示
<p>-4.1μg β-內酰胺酶在分離＞50kDa后的20μl偶聯(lián)物樣品中(0.21mg/ml)。
-43.8μg β-內酰胺酶在分離前的20μl樣品中(2.2mg/ml)。
產(chǎn)量為(205.7/1000)×100＝20.57％進行SDS-PAGE以證明P-硝基苯酚基團的釋放是由于氨解作用而不是由于磷酸緩沖液的水解作用。相對于分子量標記將游離的β-內酰胺酶與結合的β-內酰胺酶比較。如所預計的，來自多聚物的未反應的HPMA沒有條帶。由于存在兩種類型的酶，游離的β-內酰胺酶給出兩條與30kDa分子量標記相符的條帶。HPMA共聚物-β-內酰胺酶偶聯(lián)物給出對應于60kDa的條帶；純化之后未檢測到游離酶。
在酶活性分析中，將磷酸緩沖液(0.1M，pH7.0)中的10單位/ml β-內酰胺酶(游離的或偶聯(lián)的)加入芐青霉素溶液中(1mM)，240nm處的紫外吸光度隨時間推移而下降。
活性分析使用與游離酶活性測試和偶聯(lián)酶活性測試中相同的酶量即每ml 10單位來進行。在作為代表性底物的游離芐青霉素上測試活性。結果表明β-內酰胺酶在多聚物偶聯(lián)之后保留了酶活性；盡管活性降低了，但足以切割PDEPT最終形式中的間隔。結果圖4中表示。
以使用游離酶與偶聯(lián)酶比較為基礎，以恒定的酶濃度(10單位/ml)、在不同濃度的芐青霉素上(1.0mM、0.9mM、0.75mM、0.5mM、0.33mM)從上述分析計算Michaelis-Menten常數(shù)。吸光度的變化按時間計算直至達到平穩(wěn)水平。對不同底物濃度降解的線性部分作圖并從斜率計算Vo，并制作Lineweaver-Burk圖。
對于游離的β-內酰胺酶，Vmax是0.77nM/S/單位，而Km是0.22。對于偶聯(lián)物，Vmax是0.20nM/s/單位，而Km是0.07。
實施例1的偶聯(lián)物適合用于與適當前體藥物結合。
HPMA共聚物-酶化合物的體內生物分布在根據(jù)UKCCCR(英國癌癥研究協(xié)調委員會)準則進行的動物實驗中測試。使用B16F10鼠黑色素瘤S.C.模型。
雄性C57BL/6J小鼠用105存活的B16F10細胞皮下(S.C.)接種。讓腫瘤形成直至面積達到通過兩正交徑產(chǎn)物測量的約50-70mm2。將1×106計數(shù)細胞在0.9％NaCl中稀釋成0.5ml。然后用飽合的NaOH中和pH并使終體積達到1.0ml。在此樣品中，用1ml注射器和12規(guī)格針頭取出100μl并計數(shù)作為注射劑量的測量值。
將100μl(5×105CPM)游離或偶聯(lián)的β-內酰胺酶注射入C57BL/6J小鼠的尾靜脈中(每個時間點重復三次)。然后將小鼠置于代謝籠中并在多至48小時的不同時間點將其處死。解剖下列組織樣品腫瘤、肝、腎、肺、心臟、脾并收集糞便、尿和血。樣品經(jīng)稱重并在PBS中勻漿。然后將樣品(1ml)在γ-計數(shù)器中計數(shù)，重復3次(每只小鼠每個器官3個樣品)。然后結果表示為每個器官注射劑量的百分率或每個器官回收劑量的百分率。假定5.6ml血/100g小鼠計算小鼠的血量。結果在圖5和6中表示。實施例2HPMA-組織蛋白酶B偶聯(lián)物組織蛋白酶B(Sigma公司，～28kDa)于控制的pH通過ONp基團的非特異性氨解反應與多聚物載體(HPMA-Gly-Gly-ONp；～30kDa)結合。反應在圖2中表示。除了將多聚物以1mg/ml溶于雙蒸水中以及用組織蛋白酶B代替β-內酰胺酶之外，進行與實施例中相同的步驟。
偶聯(lián)反應之后再次進行紫外分光光度法測定。
通過SDS-PAGE，相對于分子量標記將游離的組織蛋白酶B與結合的組織蛋白酶B比較。如所預計的，來自多聚物的未反應的HPMA沒有條帶。由于存在酶的不同鏈，游離的組織蛋白酶B給出與30kDa和90kDa分子量標記相符的條帶。HPMA共聚物-組織蛋白酶B偶聯(lián)物給出對應于60kDa和97kDa的條帶(由于交叉連接)。純化之后未檢測到游離酶。
游離或偶聯(lián)的組織蛋白酶B的活性通過在含有DETA(10mM)和還原谷胱甘肽(50mM)的檸檬酸緩沖液(0.2M，pH5.5)中、于37℃溫育過程中測量410nm處P-硝基苯胺(NAp)從三肽Bz-Phe-Val-Arg-NAp的釋放而進行分析。
實施例2的組織蛋白酶B偶聯(lián)物適合用于與適當前體藥物如HPMA-Gly-Phe-Leu-Gly-阿霉素(PK1；見圖7)結合。
組織蛋白酶B(游離或偶聯(lián)的)在高分子量底物PK1上的活性通過高壓液相色譜評估。PK1與組織蛋白酶B的溫育于37℃在含有400μl1mg/ml檸檬酸緩沖液(pH5.5，0.2M)中的PK1、100μl緩沖液(10mM)中的EDTA溶液、100μl還原谷胱甘肽(GSH 50mM)和400μl緩沖液中的HPMA-組織蛋白酶B或游離的組織蛋白酶B(與偶聯(lián)物中存在的組織蛋白酶濃度相同-1mg/ml)的1ml終體積中進行。也準備了含有PK1但無酶的試管，評估水解作用水平作為對照。在不同時間取100μl樣品，立即凍于液氮中并凍存在黑暗中直至通過高效液相色譜進行測定。然后樣品與100ng作為內標準的道諾霉素(DNM)、甲酸銨緩沖液(pH8.5)和提取混合物(氯仿∶丙-2-醇)混合。離心試管，小心去除水層并使用在不高于13.8kPa(2lbf/in2)N2(g)的條件下操作的Techne氮系統(tǒng)蒸發(fā)有機部分至干燥。經(jīng)蒸發(fā)的樣品在分析前重新溶解于甲醇中。游離阿霉素體外從PK1的釋放在圖8中表示。
體內評估通過使用B16F10鼠黑色素瘤模型進行。雄性C57BL/6J小鼠用105存活的B16F10細胞皮下(S.C.)接種。讓腫瘤形成直至面積達到通過正交徑產(chǎn)物測量的約50-70mm2。動物用PK1(相當于5mg/kg和10mg/kg阿霉素)靜脈注射或者用PK1(相當于5mg/kg和10mg/kg阿霉素)接著5小時后用游離的組織蛋白酶B(3.63mg/kg)或HPMA共聚物-Gly-Gly-組織蛋白酶B(相當于3.63mg/kg組織蛋白霉B)靜脈注射，并且在多至48小時的不同時間點處死動物。解剖下列組織樣品腫瘤、肝、腎、肺、心臟、脾并收集尿和血。樣品稱重，在PBS中攪勻，并與100ng作為內標準的道諾霉素(DNM)、甲酸銨緩沖液(pH8/5)和提取混合物(氯仿∶丙-2-醇)混合。離心試管，小心除去水層并使用在不高于13.8kPa(2lbf/in2)N2(g)的條件下操作的Techne氮系統(tǒng)蒸發(fā)有機部分至于燥。經(jīng)蒸發(fā)的樣品在進行高壓液相色譜分析前重新溶解于甲醇中。比較阿霉素從含有和不含有酶的多聚物偶聯(lián)物的釋放，結果在圖9和10中表示。
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權利要求
1.一種在藥物治療中作為結合制品用于順序給藥的產(chǎn)品，包含酶偶聯(lián)物和前體藥物，酶偶聯(lián)物含有與多聚物載體共價結合的功能性酶，而前體藥物是基本上無活性的(在藥物活性方面)但通過酶活化。
2.根據(jù)權利要求1所述的產(chǎn)品，其中前體藥物包含藥物與之共價偶聯(lián)的載體。
3.根據(jù)權利要求2所述的產(chǎn)品，其中前體藥物的載體是多聚物。
4.根據(jù)權利要求3所述的產(chǎn)品，其中酶是蛋白酶并且藥物通過可由蛋白酶切割的肽基銜接物與多聚物載體偶聯(lián)。
5.一種在藥物治療中作為結合制品用于順序給藥的產(chǎn)品，包含酶偶聯(lián)物和前體藥物，前體藥物包含通過由酶切割的肽基銜接物與多聚物載體連接的藥物。
6.根據(jù)權利要求5所述的產(chǎn)品，其中酶偶聯(lián)物包含與酶共價偶聯(lián)的抗體。
7.根據(jù)前述權利要求中的任意一項所述的產(chǎn)品，其中酶是硫醇依賴的蛋白酶。
8.根據(jù)權利要求1-4中的任意一項所述的產(chǎn)品，其中酶是β-內酰胺酶。
9.一種在藥物治療中作為結合制品用于順序給藥的產(chǎn)品，包含酶偶聯(lián)物和前體藥物，酶偶聯(lián)物包含與載體共價結合的功能性硫醇依賴的蛋白酶，而前體藥物包含通過作為硫醇依賴的蛋白酶底物的肽基銜接物與載體結合的藥物。
10.根據(jù)權利要求7或權利要求9所述的產(chǎn)品，其中硫醇依賴的蛋白酶是組織蛋白酶B。
11.根據(jù)權利要求9或權利要求10所述的產(chǎn)品，其中載體是多聚物。
12.根據(jù)權利要求1-8和11中的任意一項所述的產(chǎn)品，其中任何多聚物載體包括羥烷基(甲基)丙烯酰胺，優(yōu)選地羥丙基甲基丙烯酰胺的多聚物或共聚物。
13.一種偶聯(lián)物，含有與載體共價結合的、硫醇依賴的功能性蛋白酶。
14.根據(jù)權利要求13所述的偶聯(lián)物，其中蛋白酶是組織蛋白酶B。
15.根據(jù)權利要求13或權利要求14所述的偶聯(lián)物，其中載體是如權利要求12中所述的多聚物。
16.根據(jù)權利要求13到15中的任意一項所述的偶聯(lián)物，用于治療。
17.藥物組合物，包含藥學上可接受的賦形劑和根據(jù)權利要求13到15中的任意一項所述的偶聯(lián)物。
18.如權利要求1-5和9-12中的任意一項所定義的前體藥物的用途，用于制備與活性藥物結合用于治療的藥物，治療包括將使藥物從前體藥物釋放的酶分開給藥。
19.根據(jù)權利要求18所述的用途，其中前體藥物在酶偶聯(lián)物之前給藥。
全文摘要
能通過酶活化的前體藥物與酶偶聯(lián)物一起配制用于順序給藥。兩種成分之一或每種成分包含使其優(yōu)先導向靶組織的多聚物載體。新的多聚物—前體藥物偶聯(lián)物可通過組織蛋白酶B或其它硫醇依賴的蛋白酶切割。本發(fā)明具有導向實體瘤的特別應用。
文檔編號A61P35/00GK1259875SQ9880605
公開日2000年7月12日 申請日期1998年6月11日 優(yōu)先權日1997年6月11日
發(fā)明者R·敦肯, R·薩奇 申請人:倫敦大學藥學院