專利名稱：蛋白激酶c抑制劑的制作方法
蛋白激酶C(PKC)由一族密切相關(guān)的作為絲氨酸/蘇氨酸激酶起作用的酶組成。蛋白激酶C在細(xì)胞-細(xì)胞信號(hào)、基因表達(dá)中和在細(xì)胞分化和生長的調(diào)控中起著重要作用。目前，在其組織分布、酶特異性和調(diào)節(jié)作用方面各不相同的已知同功酶PKC至少有十種。Nishizuka Y.Annu RevBiochem 5831-44(1989)；Nishizuka Y.科學(xué)258607-614(1992)。
蛋白激酶C同功酶是鏈長為592-737個(gè)氨基酸的單多肽鏈。同功酶包含通過連接肽連接的調(diào)節(jié)區(qū)和催化區(qū)。調(diào)節(jié)區(qū)和催化區(qū)可進(jìn)一步劃分為穩(wěn)定區(qū)和可變區(qū)。蛋白激酶C的催化區(qū)于在其它蛋白激酶中觀察到的十分相似，但調(diào)節(jié)區(qū)是PKC同功酶所特有的。組內(nèi)的PKC同功酶在氨基酸水平的同源性在40-80％之間。然而，不同種類間的同功酶的同源性一般超過97％。
蛋白激酶C是的膜相關(guān)酶，受許多因子變構(gòu)調(diào)節(jié)，這些因子包括膜磷脂、鈣和一些膜的脂質(zhì)如隨磷酸酯酶活性釋放的二?；视?。Bell，R.M.和Burns，D.J.，生物化學(xué)雜志4661-4664(1991)；Nishizuka，Y.科學(xué)258607-614(1992)。蛋白激酶C的同功酶-α、β-1、β-2和γ的完全激活需膜磷脂、鈣和二?；视?佛波醇酯。δ、ε、η和θ形式的PKC的激活模式是鈣非依賴性的。ζ和λ形式的PKC是鈣和二?；视头且蕾囆缘?，據(jù)信它們的激活僅需膜磷脂。
僅有一兩種蛋白激酶C同功酶與已知的疾病有關(guān)。例如糖尿病中升高的血糖水平導(dǎo)致血管組織中β-2同功酶的同功酶特異性升高。Inoguchi等，美國國立科學(xué)院學(xué)報(bào)8911059-11065(1992)。人血小板中β同功酶的糖尿病性升高與它們對(duì)激動(dòng)劑的變化的反應(yīng)相關(guān)聯(lián)。BastyrIII，E.J.和Lu，糖尿病雜志42(增補(bǔ)1)97A(1993)。據(jù)顯示蛋白激酶Cβ可選擇性地磷?；说木S生素D受體。這種磷酰化與其受體功能的改變有關(guān)。Hsieh等，美國國立科學(xué)院學(xué)報(bào)889315-9319(1991)；Hsieh等，生物化學(xué)雜志268151180-15126(1993)。此外，近期的研究表明β-2同功酶引起紅白血病的細(xì)胞增殖，而在該統(tǒng)一的細(xì)胞中α同功酶引起巨核細(xì)胞分化。Murray等，生物化學(xué)雜志26815847-15853(1993)。
蛋白激酶C同功酶的普遍存在性和它們?cè)谏韺W(xué)中的重要作用激發(fā)人們?nèi)ドa(chǎn)高選擇性的PKC抑制劑。由證明某些同功酶與疾病相關(guān)的已知證據(jù)，我們有理由確信與其它PKC同功酶和其它蛋白激酶相比，對(duì)一或兩種蛋白激酶C同功酶具有選擇性抑制作用的化合物是更好的治療劑。由于其特異性，這類化合物應(yīng)顯示出較強(qiáng)的療效和較低的毒性。
微生物的吲哚并咔唑，staurosporine是蛋白激酶C的一種有效抑制劑，它與酶的催化區(qū)間相互作用。Tamaoki等，生物化學(xué)和生物物理學(xué)研究通訊135397-402(1986)；Gross等，生化藥理學(xué)，40343-350(1990)。但該分子和密切相關(guān)化合物的治療用途受到對(duì)蛋白激酶C和其它蛋白激酶缺乏特異性的局限。Ruegg，U.T.和Burgess，G.M.，藥理科學(xué)趨勢10218-220(1989)。選擇性的缺乏導(dǎo)致了這類分子無法接受的毒性。
另一類有關(guān)staurosporine的化合物，雙吲哚馬來酰亞胺是近期研究的焦點(diǎn)。Davis等，F(xiàn)EBS Lett.25961-63(1989)；Twoemy等，生物化學(xué)及生物物理學(xué)研究通訊1711087-1092(1990)；Toullec等，生物化學(xué)雜志26615771-15781(1991)；Davis等，藥物化學(xué)雜志35994-1001(1992)；Bit等，藥物化學(xué)雜志3621-29(1993)。與對(duì)其它蛋白激酶相比，這類化合物中的一些對(duì)蛋白激酶C顯示出選擇性。
雖然已發(fā)現(xiàn)了對(duì)蛋白激酶C表現(xiàn)出特異性的化合物，但該化合物對(duì)于同功酶的選擇性卻很低。例如對(duì)staurosporine的同功酶選擇性分析顯示，它除對(duì)ζ同功酶具有較差抑制作用外，對(duì)同功酶基本上未顯示出選擇性(與同功酶相比)。McGlynn等，細(xì)胞生物化學(xué)雜志，49239-250(1992)；Ward，N.E.和O’Brain，C.A.分子藥理學(xué)41387-392(1992)。PKC選擇性化合物3-[1-(3-二甲氨基丙基)-吲哚-3-基]-4-(1H-吲哚-3-基)-1H-吡咯-2，5-二酮的研究表明對(duì)鈣依賴性的同功酶有低微選擇性。Toullec等，生物化學(xué)雜志26615771-15781(1991)。隨后對(duì)該化合物的研究觀察到與β-1和β-2同功酶相比，對(duì)α同功酶具有無差別的或低微的選擇性。Martiny-Baron等，生物學(xué)化學(xué)雜志2689194-9197(1993)；Wilkinson等，生物化學(xué)雜志294335-337(1993)。因此，雖然進(jìn)行了數(shù)年的研究，確定了與其它蛋白激酶相比較，抑制蛋白激酶C的數(shù)類化合物，但仍有治療有效的同功酶選擇性抑制劑的需求。
本發(fā)明提供新的高效蛋白激酶C抑制劑。與其它蛋白激酶相比，本發(fā)明的化合物對(duì)蛋白激酶C具有選擇性，而且，十分出人意料地是其具有高度的同功酶選擇性。作為選擇性抑制劑，這些化合物可用于治療糖尿病癥及其并發(fā)癥、局部缺血、炎癥、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心血管疾病、皮膚病和癌癥。
發(fā)明概述本發(fā)明提供式I化合物
其中W是O，-S-或NH；R1獨(dú)立地是氫，鹵素，C1-C4烷基，羥基，C1-C4烷氧基，鹵代烷基，硝基，-NH(C1-C4烷基)，-N(C1-C4烷基)2或-NHCO(C1-C4烷基)；R2是氫，CH3CO-，NH2或羥基；z是-(CH2)p-或-(CH2)p-O-(CH2)p-；R6是-NH(CF3)或-N(CF3)(CH3)；m獨(dú)立地是0，1，2或3；且p獨(dú)立地是0，1或2。
還提供新的上述化合物中間體。這些中間體是式II的化合物。
其中V是-O-或N-CH3；W是O，-S-或-NH；R1獨(dú)立地是氫，鹵素，C1-C4烷基，羥基，C1-C4烷氧基，鹵代烷基，硝基，-NH(C1-C4烷基)，-N(C1-C4烷基)2或-NHCO(C1-C4烷基)；z是-(CH2)p-或-(CH2)p-O-(CH2)p-；R6是-NH(CF3)或-N(CF3)(CH3)；m獨(dú)立地是0，1，2或3；且p獨(dú)立地是0，1或2。
本發(fā)明另一方面提供一種抑制蛋白激酶C的方法，該方法包括給需此治療的哺乳動(dòng)物施用藥物有效量的式I化合物。本發(fā)明還包括選擇性抑制β-1和β-2蛋白激酶C同功酶的方法，包括給需此治療的哺乳動(dòng)物施用藥物有效量的式I化合物。
本發(fā)明還提供治療疾病的方法，據(jù)證明蛋白激酶C在這些疾病如局部缺血、炎癥、中樞系統(tǒng)疾病、心血管疾病、皮膚病和癌癥中起作用，該方法包括給需治療的哺乳動(dòng)物施用藥物有效量的式I化合物。
本發(fā)明尤其可用于治療糖尿病并發(fā)癥。因此，本發(fā)明還提供一種治療糖尿病并發(fā)癥的方法，包括給需此治療的哺乳動(dòng)物施用藥物有效量的式I化合物。
最后，本發(fā)明提供包含式I化合物與一種或多種可藥用賦形劑、載體或稀釋劑的藥物組合物。
發(fā)明詳述和優(yōu)選實(shí)施方案為達(dá)到本文所公開和討論的發(fā)明目的，將術(shù)語和縮略語定義如下術(shù)語“鹵素”代表氟、氯、溴或碘。
術(shù)語“C1-C4烷基”代表1-4個(gè)碳原子的環(huán)狀、直鏈或支鏈烷基，如甲基、乙基、正丙基、異丙基、環(huán)丙基、正丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基等。鹵代烷基是被一個(gè)或多個(gè)鹵素原子取代的這類烷基。鹵代烷基的例子是三氟甲基。
C1-C4烷氧基是通過-O-鍵與母體結(jié)構(gòu)共價(jià)鍵合的C1-C4烷基。
本說明書中采用的術(shù)語“離去基”是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所理解的。通常，離去基是任意增強(qiáng)為置換連接的原子的親電性的基團(tuán)或原子。優(yōu)選的離去基團(tuán)是triflate、甲磺酸酯、甲苯磺酸酯、亞氨酸酯、氯化物、溴化物和碘化物。如果烷基化試劑包含氨基酸殘基(即X、W和Y聯(lián)合形成-(CH2)n-AA-)，相連于羧基的離去基團(tuán)優(yōu)選是五氟苯酯或?qū)ο趸锦ァ?br> 本說明書中使用的術(shù)語“羧基保護(hù)基”指羧酸基的一種酯衍生物，在反應(yīng)發(fā)生在化合物的其它功能基上時(shí)，常用于阻斷或保護(hù)羧酸基。采用的羧基保護(hù)基種類并沒有嚴(yán)格限定，只要衍生的羧酸在隨后反應(yīng)條件下是穩(wěn)定的并且可在不破壞分子其余結(jié)構(gòu)情況下在適當(dāng)時(shí)機(jī)除去。T.W.Greene和P.Wuts，有機(jī)合成中的保護(hù)基，John Wiley和Sons，New York，N.Y，1991，第5章，列出了常用的保護(hù)基。還參見Haslam，有機(jī)化學(xué)中的保護(hù)基，J.G.W.McOmie，Ed.，Plenum Press，New York，N.Y.，1973。相關(guān)的術(shù)語是“保護(hù)的羧基”，是指羧基-保護(hù)基。
本說明書中采用的術(shù)語“羥基保護(hù)基”是指羥基的一種醚或酯衍生物，在反應(yīng)發(fā)生在化合物的其它功能基上時(shí)，常用于阻斷或保護(hù)羥基。采用的羥基保護(hù)基種類并沒有嚴(yán)格限定，只要衍生的羥基在反應(yīng)條件下是穩(wěn)定的并且可在不破壞分子其余結(jié)構(gòu)情況下在適當(dāng)時(shí)機(jī)除去。T.W.Greene和P.Wuts，有機(jī)合成中的保護(hù)基，John Wiley和Sons，New York，N.Y.，1991，其中列出了常用的保護(hù)基。優(yōu)選的羥基保護(hù)基是叔丁基二苯基甲硅烷氧基(TBDPS)，叔丁基二甲基甲硅烷氧基(TBDMS)，三苯甲基，甲氧基三苯甲基，或者烷基或芳基酯。相關(guān)的術(shù)語是“保護(hù)的羥基”，是指羥基保護(hù)基。
本說明書中使用的術(shù)語“氨基保護(hù)基”是指氨基的取代基，在反應(yīng)發(fā)生在化合物的其它功能基上時(shí)，常用于阻斷或保護(hù)氨基。采用的羧基保護(hù)基種類并沒有嚴(yán)格限定，只要衍生的氨基在隨后反應(yīng)條件下是穩(wěn)定的并且可在不破壞分子其余結(jié)構(gòu)情況下在適當(dāng)時(shí)機(jī)除去。T.W.Greene和P.Wuts，有機(jī)合成中的保護(hù)基，第7章，列出了常用的保護(hù)基。還參見J W.Barson，有機(jī)化學(xué)中的保護(hù)基，第2章。優(yōu)選的氨基保護(hù)基是叔丁氧羰基、鄰苯二酰胺(pthalimide)、環(huán)烷基和芐氧羰基。相關(guān)術(shù)語“保護(hù)的氨基”是被所定義的氨基保護(hù)基取代的氨基。
本說明書中使用的術(shù)語“-NH保護(hù)基”指氨基保護(hù)基的亞類，它們?cè)诜磻?yīng)發(fā)生在化合物的其它功能基上時(shí)，常用于阻斷或保護(hù)-NH功能。采用的羧基保護(hù)基種類并沒有嚴(yán)格限定，只要衍生的氨基在反應(yīng)條件下是穩(wěn)定的并且可在不破壞分子其余結(jié)構(gòu)情況下在適當(dāng)時(shí)機(jī)除去。T.W.Greene和PWuts，有機(jī)合成中的保護(hù)基，第7章，第362-385頁列出了常用的保護(hù)基。優(yōu)選的-NH保護(hù)基是氨基甲酸酯、酰胺、烷基或芳基磺酰胺。相關(guān)術(shù)語“保護(hù)的-NH”是被所定義的-NH保護(hù)基取代的基團(tuán)。
本文的術(shù)語“藥物有效量”表示能夠抑制哺乳動(dòng)物中PKC活性的本發(fā)明化合物的量。當(dāng)然，本發(fā)明所施用的化合物的具體劑量取決于具體的周圍環(huán)境，包括所施用的化合物、施用途徑、所醫(yī)治的特定病癥和類似的考慮。化合物可通過各種途徑施用，包括經(jīng)口服、直腸、經(jīng)皮、皮下、局部、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)或鼻內(nèi)途徑。對(duì)各種適應(yīng)癥，本發(fā)明化合物的代表性每日劑量為約0.01mg/kg-約20mg/kg，優(yōu)選的每日劑量是大約0.05至10mg/kg，理想的是約0.1mg/kg-約5mg/kg。但局部施用的代表性劑量為每cm2感染組織約1-約500μg。優(yōu)選的化合物施用量范圍為約30-約300μg/cm2，更優(yōu)選為約50-約200μg/cm2，最優(yōu)選在約60-約100μg/cm2。
本文使用的術(shù)語“治療”描述的是為戰(zhàn)勝疾病、病癥或紊亂對(duì)患者的管理或護(hù)理，包括施用本發(fā)明的化合物以防止癥狀或并發(fā)癥的發(fā)作，緩解癥狀或并發(fā)癥，消除患者疾病、病癥或紊亂。
術(shù)語“同功酶選擇性”是指與蛋白激酶C同功酶α、γ、δ、ε、ζ和η相比，優(yōu)勢抑制蛋白激酶Cβ-1或β-2同功酶。通常，化合物在抑制PKCβ-1或β-2同功酶的所需劑量和同樣抑制α蛋白激酶C同功酶所需的劑量間顯示的差異最小為8倍(優(yōu)選10倍)。化合物在整個(gè)抑制范圍內(nèi)都顯示出差異，可例舉IC50，即50％抑制時(shí)的差異。這樣，同功酶選擇性的化合物以低的多的濃度，和較低的毒性抑制蛋白激酶C的β-1和β-2同功酶，其原因是它們對(duì)其它PKC同功酶的低抑制。
如上所述，本發(fā)明提供選擇性抑制蛋白激酶C的式I化合物。在本發(fā)明優(yōu)選的化合物是那些其中Z是-(CH2)p-；且R6是NH(CF3)或N(CH3)(CF3)，或者m獨(dú)立地是0、1、2或3，且p是1的式I化合物。
由于它們的酸性部分，式I化合物包括其可藥用的堿加成鹽。這類鹽包括那些由無機(jī)堿如氫氧化銨及堿金屬和堿土金屬氫氧化物、碳酸鹽、碳酸氫鹽等衍生的鹽，以及由堿性有機(jī)胺，如脂族胺和芳香胺、脂族二胺、羥基烷胺等衍生的鹽。因此，用于制備本發(fā)明的鹽的這類堿包括氫氧化銨、碳酸鉀、碳酸氫鈉、氫氧化鈣、甲胺、二乙胺、亞乙基二胺、環(huán)己胺、乙醇胺等。
由于堿性部分，式I化合物還可作為可藥用的酸加成鹽形式存在。常用于形成這類鹽的酸包括無機(jī)酸，如鹽酸、氫溴酸、氫碘酸、硫酸和磷酸，以及有機(jī)酸，如對(duì)甲苯磺酸、甲磺酸、草酸、對(duì)溴苯磺酸、碳酸、琥珀酸、檸檬酸、苯甲酸、乙酸及相關(guān)的無機(jī)和有機(jī)酸。這類可藥用鹽包括硫酸鹽、焦硫酸鹽、硫酸氫鹽、亞硫酸鹽、亞硫酸氫鹽、磷酸鹽、一氫磷酸鹽、二氫磷酸鹽、偏磷酸鹽、焦磷酸鹽、鹽酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽、乙酸鹽、丙酸鹽、癸酸鹽、辛酸鹽、丙烯酸鹽、甲酸鹽、異丁酸鹽、庚酸鹽、丙炔酸鹽、草酸鹽、丙二酸鹽、琥珀酸鹽、癸二酸鹽、富馬酸鹽、馬來酸鹽、2-丁炔-1，4-二酸鹽、 3-己炔-2，5-二酸鹽、苯甲酸鹽、氯代苯甲酸鹽、羥基苯甲酸鹽、甲氧基苯甲酸鹽、鄰苯二甲酸鹽、二甲苯磺酸鹽、苯乙酸鹽、苯丙酸鹽、苯丁酸鹽、檸檬酸鹽、乳酸鹽、馬尿酸鹽、B-羥基丁酸鹽、乙醇酸鹽、馬來酸鹽、酒石酸鹽、甲磺酸鹽、丙磺酸鹽、萘-1-磺酸鹽、萘-2-磺酸鹽、扁桃酸鹽等。
除可藥用鹽外，本發(fā)明還包括其它鹽。它們可在化合物的純化中、其它鹽的制備中或者化合物或中間體的鑒別和定性中作為中間體。
式I化合物的可藥用鹽也可以各種溶劑化物形式存在，如與水、甲醇、乙醇、二甲基甲酰胺、乙酸乙酯等形成的溶劑化物?？梢灾苽溥@類溶劑化物的化合物。這類溶劑化物可由結(jié)晶的溶劑、原有的制備或結(jié)晶溶劑或者與溶劑偶然得到。這類溶劑化物也在本發(fā)明的范圍之中。
式I化合物可以各種立體異構(gòu)體形式存在；例如W可在取代的亞烷基部分含有手性碳原子?；衔镆话阒苽涑赏庀w，并可方便地以外消旋體形式使用，但如果需要也可以采用常規(guī)技術(shù)分離或合成單一的對(duì)映體。這類外消旋體和單一對(duì)映體及人們的化合物也構(gòu)成了本發(fā)明的一部分。
本發(fā)明還包括可藥用的式I化合物藥物前體。藥物前體是化學(xué)改性的藥物，在其作用位點(diǎn)是生物失活的，但當(dāng)其經(jīng)一種或多種酶促或者的其它體內(nèi)過程的作用下降解或修飾為母體生物活性形式。藥物前體應(yīng)具有與母體化合物不同的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，易于透過粘膜上皮而吸收，較好的成鹽性質(zhì)或溶解度和/或改善的系統(tǒng)穩(wěn)定性(例如延長的血漿半衰期)。這類代表性的化學(xué)改性包括1)可通過酯酶或脂酶裂解的酯或酰胺衍生物；2)可被特異性或非特異性蛋白酶識(shí)別的肽；或者3)通過藥物前體或改性藥物前體的膜選擇性在作用位點(diǎn)積累的衍生物；或者上述1-3的任意組合。例如在H.Bundgaard，藥物前體設(shè)計(jì)(1985)中描述了選擇和制備合適藥物前體衍生物的常規(guī)方法。
某些雙吲哚-N-馬來酰亞胺衍生物的合成記述于Davis等的美國專利5057614中，將其引入本文作為參考。通常，本發(fā)明的化合物可如下進(jìn)行制備路線1
R1，m和鹵素如前面所定義。鹵素優(yōu)選氯、溴或碘?；衔颕II優(yōu)選是2，3-二氯N-甲基馬來酰亞胺。
化合物III與吲哚，化合物IV之間的反應(yīng)是常見的Grignard反應(yīng)。該反應(yīng)在惰性有機(jī)溶劑如甲苯中、在室溫和反應(yīng)混合物的回流溫度間進(jìn)行。最重要的是，路線1中描述的反應(yīng)取決于溶劑條件。當(dāng)在甲苯THF乙醚溶劑系統(tǒng)中進(jìn)行時(shí)，反應(yīng)獲得化合物V的收率大于80％，純度高于95％。用氯化銨，NH4Cl從反應(yīng)混合物中沉淀產(chǎn)物。可采用普通技術(shù)分離得到的中間體，化合物V。
然后，可運(yùn)用本領(lǐng)域已知的技術(shù)和Brenner等在四面體442887-2892(1988)中的描述堿水解雙-3，4(3’-吲哚基)-1N-甲基-吡咯-2，5-二酮，化合物V，使其轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的式VI酸酐?；衔颲優(yōu)選在25℃-回流溫度與5N KOH的乙醇溶液反應(yīng)。
式V化合物通常比式VI化合物穩(wěn)定。因此，化合物V優(yōu)選按照路線2反應(yīng)生成式I化合物。當(dāng)然，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員知道式VI化合物也可按照路線2反應(yīng)。
路線2
Z，R6和m如前面所定義。L是良好的離去基團(tuán)，如氯、溴、碘、甲磺?；?、甲苯磺?；取也可以是羥基或其它通過本領(lǐng)域已知的技術(shù)易于轉(zhuǎn)化為良好離去基的前體。例如羥基可方便地轉(zhuǎn)化為磺酸酯如甲磺酸酯，如通過羥基與甲磺酰氯反應(yīng)生成甲磺酸酯離去基。
路線2代表的反應(yīng)可采用任何已知的制備N-取代的吲哚的方法完成。該反應(yīng)通常包括約等摩爾量的兩種試劑，雖然也可以是其它比例，但優(yōu)選其中烷基化試劑是過量的情況。該反應(yīng)最好在極性非質(zhì)子溶劑中，使用堿金屬鹽或在其它本領(lǐng)域適宜的烷基化條件中進(jìn)行。當(dāng)離去基是溴或氯時(shí)，可加入催化量的碘鹽，如碘化鉀加速反應(yīng)。反應(yīng)條件包括二甲基甲酰胺或四氫呋喃中的六甲基二硅疊氮化鉀(potassium hexamethyldisilazide)，二甲基甲酰胺中的氫化鈉。
反應(yīng)優(yōu)選在緩慢逆加入(reverse addition)碳酸銫的乙腈、二甲基甲酰胺(DMF)或四氫呋喃(THF)溶液下進(jìn)行。反應(yīng)溫度優(yōu)選在約室溫至約反應(yīng)混合物的回流溫度之間。
本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)知道路線2描述的反應(yīng)可使用式VIIa化合物L(fēng)-Y’L-X’VIIaX’和Y’是保護(hù)的羧基，保護(hù)的羥基或者保護(hù)的胺。路線2的烷基化后，X’和Y’可轉(zhuǎn)化為能夠偶聯(lián)形成權(quán)利要求化合物的部分結(jié)構(gòu)。該方法是制備其中W是-S-、-O-或NH的式I化合物的優(yōu)選方法。X’和Y’形成各種醚、硫醚或氨基醚衍生物的偶聯(lián)是本領(lǐng)域已知的，記述于Ito等，Chem.PharmBull.41(6)1066-1073(1993)；Kato等，J Chem.Pharm.Bull.34486(1986)Goodrow等，合成1981457；Harpp等，美國化學(xué)會(huì)志932437(1971)；和Evans等，有機(jī)化學(xué)雜志501830(1985)。
本領(lǐng)域普通技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到路線2的反應(yīng)可采用適宜的保護(hù)基作為兩步合成反應(yīng)進(jìn)行。即采用適宜的保護(hù)基，式V和VI化合物的每個(gè)吲哚基氮的烷基化可按照本文所述的分兩步進(jìn)行(在緩慢逆加入下烷基化一個(gè)吲哚基，然后通過烷基化第二個(gè)吲哚基閉合大環(huán))。
最意想不到的是當(dāng)烷基化在緩慢逆加入到Cs2CO3的極性非質(zhì)子溶劑中時(shí)，可以相當(dāng)高的收率制備本發(fā)明化合物。緩慢逆加入包括將化合物與烷基化試劑的混合物與堿以0.1毫升/小時(shí)-2.0毫升/小時(shí)的速率混合?；旌衔镏忻恳辉噭┑臐舛葹榧s1.5摩爾-約0.001摩爾。緩慢加入導(dǎo)致反應(yīng)容器中試劑的濃度為約0.01微摩爾-約1.5摩爾。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)知道加入的速率越快，則反應(yīng)中可用的試劑濃度越低?；衔飪?yōu)選以約0.14毫升/小時(shí)速率加入，化合物和烷基化試劑為0.37摩爾。優(yōu)選加入過量的Cs2Co3--最優(yōu)選以Cs2Co3與烷基化試劑為4∶1的比例加入。優(yōu)選的極性非質(zhì)子溶劑是乙腈、二甲基甲酰胺(DMF)、丙酮、二甲亞砜(DMSO)、二惡烷、二甘醇二甲醚、四氫呋喃(THF)或者其它試劑在其中溶解的極性非質(zhì)子溶劑。反應(yīng)在約0℃-回流溫度范圍內(nèi)進(jìn)行。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到化合物和烷基化試劑的混合物的比例并不十分重要。但試劑優(yōu)選以彼此0.5-3當(dāng)量的比率混合。最優(yōu)選試劑以1∶1混合。
當(dāng)V是N-CH3時(shí)，化合物II通過堿水解轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的酸酐(V是O)。堿水解包括將化合物與堿，如氫氧化鈉或氫氧化鉀在C1-C4醇(優(yōu)選乙醇)、DMSO/水、二惡烷/水或者乙腈/水中在約25℃-優(yōu)選約回流溫度范圍內(nèi)進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)物的濃度沒有嚴(yán)格限定。
酸酐(V是O)通過氨解轉(zhuǎn)化為式I的馬來酰亞胺。氨解包括將酸酐與過量六甲基二硅氮烷或銨鹽(乙酸銨、溴化銨或氯化銨)和C1-C4醇(優(yōu)選甲醇)在進(jìn)行非質(zhì)子溶劑如DMF在室溫下反應(yīng)。六甲基二硅氮烷或銨鹽優(yōu)選以大于約5∶1當(dāng)量的酸酐的比率反應(yīng)。
路線3還概括了另一種制備式I化合物的方法。當(dāng)W是-NH時(shí)，該方法尤其有用。
路線3
Ac是乙?；?。R6、Z和m如前述所定義?；衔颲I和VIII的烷基化在先前所述的、本領(lǐng)域已知的條件下進(jìn)行?；衔颕X與α-鹵代酮、化合物X的烷基化發(fā)先前所述的條件下發(fā)生。酸酐向馬來酰亞胺，化合物XI的轉(zhuǎn)化在先前所述的條件下發(fā)生。例如酸酐通過與六甲基二硅氮烷和甲醇在惰性有機(jī)溶劑如DMF中在室溫下反應(yīng)之中為雙吲哚馬來酰亞胺。
OAc表示的被保護(hù)的羥基易于水解形成醇(例如在碳酸鉀的含水甲醇和THF中)。所得的醇通過本領(lǐng)域已知的方法，如在0℃使醇與甲磺酰氯在三乙胺中反應(yīng)轉(zhuǎn)化為離去基。在50℃，離去基在DMF中被疊氮化物，如疊氮化鈉取代。通過運(yùn)用Lindlar催化劑在H2存在下將所得疊氮化物還原為胺。大環(huán)通過分子內(nèi)席夫堿閉合。席夫堿在標(biāo)準(zhǔn)條件下，如NaCNBH3或其它還原試劑下還原生成式I大環(huán)分子。
本發(fā)明的中間體是按照路線4制備的。該路線在制備其中W是-O-的化合物中尤其有用。
路線4
R8是N3、NH-保護(hù)基、胺保護(hù)基或羥基保護(hù)基；m獨(dú)立地是0、1、2或3；L是良好的離去基，如氯、溴、碘、甲磺?；图妆交酋；取優(yōu)選是甲磺?；?。R8優(yōu)選是被保護(hù)的羥基，最優(yōu)選是-O三苯甲游基。路線4代表大環(huán)分子連接部分的立體選擇性合成方法。S-對(duì)映體如上所示；當(dāng)然，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)知道互補(bǔ)對(duì)映體或?qū)τ丑w的混合物也可以類似方式制備。另外，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員還應(yīng)認(rèn)識(shí)到與甲基取代的環(huán)氧化物或格林試劑的類似反應(yīng)可用于制備包含甲基取代的亞烷基的各種接頭。
在上面的反應(yīng)中，用格林試劑將環(huán)氧化物、化合物(XIV)打開。該反應(yīng)在銅配合劑的存在下進(jìn)行；當(dāng)然也可以使用其它烷基化試劑。該反應(yīng)在惰性溶劑中在-30℃-反應(yīng)混合物的回流溫度范圍內(nèi)進(jìn)行。該反應(yīng)產(chǎn)生化合物(XV)，其無需進(jìn)一步純化即可用于下步反應(yīng)?；衔?XV)在本領(lǐng)域已知的制備醚的一般條件下烷基化。路線4所示的反應(yīng)是威廉遜制醚反應(yīng)。使用NaH，NaOH或KOH生成醇鈉，然后用烯丙基溴烷基化產(chǎn)生二烯化合物(XVI)。運(yùn)用普通技術(shù)將化合物(XVI)轉(zhuǎn)化為醇，化合物(XVII)。例如化合物(XVI)可在低溫下用臭氧處理轉(zhuǎn)化為臭氧化物。然后，臭氧化物用NaBH4，LiAlH4，BH3或者用過量H2催化氫化還原生成醇，化合物(XVII)?；衔?XVII)的羥基部分可運(yùn)用普通技術(shù)，如將醇與甲磺酰氯在三乙胺中反應(yīng)轉(zhuǎn)化為離去基L。
在上述所有反應(yīng)路線中，反應(yīng)優(yōu)選在有適宜保護(hù)基的條件下進(jìn)行。尤其是在烷基化和/或?；陂g，R1優(yōu)選是被保護(hù)的，然后脫保護(hù)。另外，如果R6要形成-NH(CF3)，則該反應(yīng)最好在有氨基保護(hù)基下進(jìn)行。當(dāng)然，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員知道如果采用適宜的反應(yīng)條件、阻斷試劑等，這其中的許多反應(yīng)可在沒有保護(hù)基下進(jìn)行。當(dāng)大環(huán)包含羥基結(jié)構(gòu)時(shí)，在吲哚的烷基化或?；陂g優(yōu)選將羥基以叔丁基聯(lián)苯基甲硅烷氧基(TBDPS)或三苯甲基(三苯甲游基)保護(hù)?？刹捎闷胀夹g(shù)將所得式I化合物分離和純化。
路線1-4的化合物和所述反應(yīng)所需的任何其它試劑或是本領(lǐng)域已知的有市售的化合物；或者可采用本領(lǐng)域已知的方法制備。例如化合物III可按照Edge等在Chem.and Ind.130(1991)中描述的技術(shù)制備；化合物IV優(yōu)選通過將適宜取代的吲哚與烷基鹵化鎂，如乙基溴化鎂以已知方式反應(yīng)來制備。
下面提供所實(shí)施例和制劑僅用于說明本發(fā)明。本發(fā)明的范圍不可僅以實(shí)施例組成的范圍來解釋。為有助于本領(lǐng)域技術(shù)人員的理解，下面給出代表性化合物的結(jié)構(gòu)以說明本文采用的命名方法
在下面的實(shí)施例和制備中，熔點(diǎn)、核磁共振光譜、質(zhì)譜、硅膠高壓液相色譜、N，N-二甲基甲酰胺、披鈀碳、四氫呋喃和乙酸乙酯分別縮寫為M.Pt，NMR，MS，HPLC，DMF，Pd/C，THF和EtOAc。術(shù)語“NMR”和“MS”表示與目的結(jié)構(gòu)一致的光譜。
制備例12，3-雙-(3’-吲哚基)-呋喃-1，4-二酮將乙醇鈉(3.56g，50mmol)加到含2，3-二氯馬來酸酐(5.56g，33.3mmol)甲胺鹽酸鹽(3.50g，55.0mmol)的40ml乙酸中。該混合物在CaCl2干燥管中25℃下攪拌16小時(shí)，然后回流4小時(shí)。將冷卻的混合物傾入水(50ml)中，用EOAc萃取三次(3×75ml)。合并的有機(jī)萃取液用100ml份的飽和NaHCO3水溶液、水和鹽水洗，并干燥(MgSO4)。減壓蒸發(fā)溶劑。殘余物在乙醇中結(jié)晶，得到3.82g(64％)白色結(jié)晶，2，3-N-甲基馬來酰亞胺。濃縮母液，殘余物進(jìn)行徑向制備層色譜(Chromatotron，Harrison Research)，獲得另外0.81g 2，3-二氯N-結(jié)晶馬來酰亞胺，收率為77％。
在1小時(shí)期間，在N2下，往吲哚(10.5g，90mmol)的175ml干燥甲苯溶液中滴加乙基溴化鎂溶液(1.0MTHF，90ml，90mmol)。滴加完畢后，將亮綠色溶液在40℃加熱30分鐘，然后冷卻到25℃。用30分鐘時(shí)間加入2，3-二氯N-甲基馬來酰亞胺(3.8g，21mmoL)的50ml甲苯溶液。反應(yīng)混合物在100℃加熱3小時(shí)，然后冷卻到25℃，加入100ml 20％的檸檬酸水溶液使反應(yīng)停止。反應(yīng)物分層，水相用EtOAc(50ml)萃取。合并的有機(jī)層用無水MgSO4干燥。減壓蒸發(fā)溶劑。殘余物加到30ml丙酮中并使其在5℃放置40小時(shí)。收集固體并用冰冷乙醚洗，得到5.25g(73％)紅色固體3，4-雙-(3’-吲哚基)-1-甲基吡咯-2，5-二酮，M.Pt.276-278℃。
往3，4-雙-(3’-吲哚基)-1-甲基吡咯-2，5-二酮的150ml乙醇溶液中加入5NKOH(50ml)。該混合物在25℃攪拌4小時(shí)，用150ml水稀釋。減壓蒸發(fā)大部分乙醇。然后將混合物酸化至pH1。將沉淀的產(chǎn)物過濾并用水洗。粗產(chǎn)物溶在少量CH2Cl2中，并緩慢濾過兩英寸的硅膠柱，用50％EtOAc的己烷溶液洗脫，得到紅色固體狀標(biāo)題混合物(3.10g，79％)。M.Pt.225-228℃制備例21-(叔丁基二甲硅烷氧基)-4-(叔丁基聯(lián)苯基甲硅烷氧基)-丁-3-醇往3-丁烯-1-醇(15g，0.21mol)的無水CH2Cl2(110ml)溶液中加入咪唑(28.6g，0.42mol，2eq)，然后加入叔丁基二甲硅烷氯化物(32g，0.22mol)。90分鐘后，TLC(10％EtOAc/己烷)指示反應(yīng)完成。將CH2Cl2溶液轉(zhuǎn)移到分液漏斗中，用CH2Cl2(110ml)稀釋，用水(200ml)和鹽水(200ml)洗。收集有機(jī)相，經(jīng)MgSO4干燥，過濾并除去溶劑，得到油(1-(O-TBDMS)-3-丁烯)，該油可加到下步反應(yīng)中。MS將上述的油溶在丙酮(400ml)和水(50ml)的混合物中。然后加入N-甲基嗎啉-N-氧化物(85.2g，0.63mol，3eq)。將所得漿狀物冷卻到0℃，10分鐘后加入催化量的OsO4(0.3g)。將所得漿狀物攪拌過夜，期間逐漸升溫至室溫。用TLC(25％EtOAc/己烷)指示反應(yīng)完成。用亞硫酸氫鈉使反應(yīng)混合物停止反應(yīng)，用乙醚(1L)稀釋，用水(400ml)和鹽水(400ml)洗。收集有機(jī)層，水層用乙醚萃取(2×500ml)。將合并的有機(jī)層干燥、過濾并濃縮，得到油狀4-(O-TBDMS)-1，2-丁二醇，該產(chǎn)物可加到下步反應(yīng)中。
將上述的油溶解在無水CH2Cl2(250ml)中。攪拌下，往該溶液中加入固體咪唑(30g，0.44mol，2.5eq)。所得溶液冷卻到0℃。冷卻15分鐘后，用45分鐘滴加叔丁基聯(lián)苯基甲硅烷氯化物(50g，0.18mol，leq)的CH2Cl2(50ml)溶液。滴加完畢后，在0℃繼續(xù)攪拌2.5小時(shí)。將溶液轉(zhuǎn)移到分液漏斗中，用CH2Cl2(250ml)稀釋，用水、鹽水洗，經(jīng)MgSO4干燥并過濾。減壓蒸出溶劑得到油狀粗產(chǎn)物。該粗產(chǎn)物通過硅膠短柱洗脫(10％EtOAc/己烷)純化。真空除去洗脫溶劑，得到粘稠油狀的標(biāo)題中間體(78.1g，總收率93％)。MS制備例31-(叔丁基二甲硅烷氧基)-3-(3-碘丙氧基)-4-(叔丁基聯(lián)苯基甲硅烷氧基)-丁烷在N2氣氛下，往制備4的醇的二氯甲烷(20ml)/環(huán)己烷(100ml)溶液中加入三氯乙酰亞氨酸烯丙酯(allyl trichloroacetimidate)(17.82g，88mmol.2.2eq)，然后加入三氟甲磺酸(50μL/g原料，0.92ml)。20小時(shí)后，過濾溶液，濾液用飽和NaHCO水溶液、水和鹽水洗。收集有機(jī)層并經(jīng)MgSO4干燥。除去溶劑得到油，該油通過閃式硅膠色譜，用己烷和極性增至含5％乙酸乙酯的數(shù)升己烷溶液洗脫純化，得到19.27g烯丙醚，1-(叔丁基二甲硅烷氧基)-3-(丙烯基氧)-4-(叔丁基聯(lián)苯基甲硅烷氧基)-丁烷(收率97％亮棕色油)。MS在氮?dú)夥障?，往上述烯丙?14.16g，28.38mmol，1eq)的THF(60ml)溶液中滴加9-BBN(9-硼雙環(huán)[3.31]壬烷，0.5M THF溶液，60ml，30mmol，1.1eq)。3小時(shí)后，反應(yīng)的TLC(10％EtOAc的己烷溶液)顯示原料已被耗盡。往該溶液中加入3M NaOH水溶液(10.41ml，31.22mmol，1.1eq)，然后緩慢滴加(1.5小時(shí))30％過氧化氫(10.3ml，90.82mmol，3.2eq)。將用過氧化物停止反應(yīng)期間的反應(yīng)溫度保持在50℃以下(冰浴)。
30分鐘后，加入氯化鈉直至溶液飽和。移取有機(jī)層；水層用乙醚萃??；合并的有機(jī)層干燥并過濾；濾液濃縮得到油。粗產(chǎn)物油經(jīng)閃式硅膠色譜，用10％EtOAc/己烷和極性增至20％EtOAc/己烷的約1.5升溶劑洗脫純化后，得到9.53g淺黃色油(收率65％)。MS。
在0℃和劇烈攪拌下，往上述醇的無水乙醚(150ml)溶液中加入三乙胺(2.93g，28.91mmol，1.5eq)，然后滴加甲磺酰氯(3.31g，28.91mmol，1.5eq)。在0℃保持3小時(shí)后，TLC(10％EtOAc的己烷溶液)指示原料被耗盡。將反應(yīng)用乙醚稀釋，用水、鹽水洗，經(jīng)MgSO4干燥，并除去溶劑。所得油濾過硅膠板，并用25％EtOAc/己烷洗脫，濃縮洗脫液。往所得油的丙酮(200ml)溶液中加入NaHCO3(0.17g，1.93mmol，0.1eq)和NaI(28.88g，192.7mmol，10eq)。在氮?dú)夥障率覝財(cái)嚢?0分鐘后，用水浴將反應(yīng)加熱到50℃，2.5小時(shí)后，TLC(10％EtOAc的己烷溶液)指示甲磺酸酯已被耗盡。反應(yīng)混合物用乙醚稀釋(500ml)，用冷的飽和的Na2SO3水溶液、水、鹽水洗，干燥(MgSO4)，除去溶劑。所得油濾過硅膠板，用5％EtOAc的己烷溶液洗脫，得到10.3g無色油狀的純凈的標(biāo)題混合物(收率85％)。
制備例4(±)3，4-[(N，N-1，1’-(3”-3-叔丁基聯(lián)苯基甲硅烷氧亞甲基)己烷)-雙-(3，3’-吲哚基)]-1-(甲基)-吡咯-2，5-二酮在60℃，在15小時(shí)內(nèi)，用注射泵將含3-叔丁基聯(lián)苯基甲硅烷氧基亞甲基-1.6-二溴己烷二溴化物(5.64g，11mmol，類似于制備例2的苯甲酰衍生物制備)的雙-(3，3’-吲哚基)-1-(甲基)-吡咯-2，5-二酮(3.41g，10.0mmol)的DMF(50ml)溶液加到Cs2CO3(11.2g，34.3mmol)的DMF(350ml)漿狀物中。添加完4小時(shí)后，將反應(yīng)冷卻到室溫，傾入水中(1.5L)，用CH2Cl2(3×300ml)萃取。有機(jī)相用水、鹽水洗，過濾并濃縮。濃縮物用閃式色譜，用10％-25％乙酸乙酯/己烷洗脫純化，得到2.95g紅色油狀的大環(huán)化合物3，4-[(N，N-1，1’-(3”-3-叔丁基聯(lián)苯基甲硅烷氧亞甲基)己烷)-雙-(3，3’-吲哚基)]-1-(甲基)-吡咯-2，5-二酮(收率43％)。MS。
制備例5(S)4-叔丁基聯(lián)苯基甲硅烷氧基-3-(烯丙基氧)丁酸甲酯在氮?dú)夥蘸蛿嚢柘?，?S)4-叔丁基聯(lián)苯基甲硅烷氧基-3-(羥基)-丁酸甲酯(20.0g，53.7mmol)的環(huán)己烷(400ml)溶液中加入三氯乙酰亞氨酸烯丙酯(21.74g，1.7.4mmol)，然后在30分鐘內(nèi)分五次加入三氟甲磺酸(1ml，50ml/g醇)。70小時(shí)后，過濾生成的固體，濾餅用環(huán)己烷洗，真空除去揮發(fā)物。所得油放在旋塞硅膠上并用己烷洗，產(chǎn)物用10％乙酸乙酯/己烷洗。NMR指示有殘留亞氨酸酯的存在(計(jì)算量為10％)；該產(chǎn)物在進(jìn)一步使用中無需純化。得到24.76g殘余物，其中約22.2g為目的產(chǎn)物(收率100％)。MS。
制備例6(S)4-叔丁基聯(lián)苯基甲硅烷氧基-3-(2-碘代乙氧基)-1-碘代丁烷在-75℃和N2氣氛下，用40分鐘將DIBAL-H(231ml，1.0M，231mmol于甲苯中)滴加到(S)4-叔丁基聯(lián)苯基甲硅烷氧基-3-(烯丙基氧)-丁酸甲酯(23.8g，57mmol)的無水THF(1.0L)溶液中。攪拌1.5小時(shí)后，使該混合物溫?zé)嶂?10℃，用5％水的甲醇溶液和大量硅藻土使反應(yīng)中止。將中止的反應(yīng)混合物濾過一層硅藻土；濾液濃縮并分配到乙醚和20％檸檬酸溶液中。乙醚層干燥并真空濃縮。殘余的油濾過一層硅膠，用氯仿洗脫，得到20.6g(S)4-叔丁基聯(lián)苯基甲硅烷氧基-3-烯丙基氧-丁烷-1-醇(93％)。
在-78℃，往(S)4-叔丁基聯(lián)苯基甲硅烷氧基-3-烯丙基氧-丁烷-1-醇(20.6g，53.6mmol)的甲醇(500ml)溶液中通約12分鐘臭氧。待反應(yīng)混合物變成淡藍(lán)色后，往反應(yīng)容器中加入NaBH4(12.2g，321mmol，6eq)。使反應(yīng)升溫至室溫。真空除去揮發(fā)物。殘余物濾過旋塞硅膠，用乙酸乙酯洗脫得到16.4g(79％)無色油狀的(S)4-叔丁基聯(lián)苯基甲硅烷氧基-3-(2-羥基-乙氧基)-丁烷-1-醇。
在0℃氮?dú)夥障?，?S)4-叔丁基聯(lián)苯基甲硅烷氧基-3-(2-羥基-乙氧基)-丁烷-1-醇(15.7g，40.4mmol)的乙醚(600ml)溶液中加入三乙胺(16.8ml，121mmol)，然后加入甲磺酰氯(9.38ml，121mmol)。3小時(shí)后，過濾溶液；濾液用水(2x)、鹽水(2x)洗，經(jīng)Na2SO4干燥并真空濃縮。殘余物得到可直接使用的有色油狀的21.9g雙甲磺酸酯(＞99％)。將雙甲磺酸酯溶在丙酮(1.4L)中，該丙酮是用碳酸鉀蒸餾過的。往該溶液中加入NaI(90.4g，603mmol)和0.05eq NaHCO3(170mg，2mmol)。該反應(yīng)混合物在56℃保持24小時(shí)，然后過濾；濾液真空濃縮。殘余物分配到乙醚和10％Na2SO3中，乙醚層用鹽水洗，經(jīng)Na2SO4干燥，并濃縮得到17.9g(73.2％)無色油狀的(S)4-叔丁基聯(lián)苯基甲硅烷氧基-3-(2-碘代-乙氧基)-碘代丁烷。總收率為54％。MSMW＝608.39；實(shí)測559(M-叔丁基；FD，CHCl3)。
制備例7(S)-3-(叔丁基聯(lián)苯基甲硅烷氧基亞甲基)-1.6-二溴己烷按照制備外消旋二溴化物，3-(叔丁基聯(lián)苯基甲硅烷氧甲基)-1，6-二溴己烷中描述的相同方法，在0℃將(S)-(-)-3-(叔丁基聯(lián)苯基甲硅烷氧甲基)-1，6-已二醇(4.85g，12.53mmol)與N-溴代琥珀酰亞胺(5.35g，30.1mmol)和三苯膦(7.87g，30.1mmol)在CH2CL2(150ml)中反應(yīng)，得到澄明的無色油狀化合物(S)-(-)-3-(叔丁基聯(lián)苯基甲硅烷氧甲基)-1，6-二溴己烷4.81g(75％)，由TLC(Rf＝0.8，10％EtOAc的己烷溶液)表明它是單一的。該化合物的TLC特性和1H光譜在各方面均與外消旋異構(gòu)體一致。MS。
1H NMR(300NHz，CDCl3)1.06(s，9H)，1.35-2.10(m，7H)，3.55(m，4H)，3.56(app d，2H，J＝4Hz)，740和7.64(m，10H)制備例81-(叔丁基二甲硅烷氧基)-3-(2-碘代乙氧基)-4-(叔丁基聯(lián)苯基)-丁烷在氮?dú)夥障?，將烯丙?-(叔丁基二甲硅烷氧基)-3-(烯丙基氧)-4-(叔丁基聯(lián)苯基)-丁烷(21.6g，43.4mmol)溶于甲醇(500ml)并冷卻到-78℃。向反應(yīng)中吹入臭氧，11分鐘后TLC(9己烷/1乙酸乙酯)表明已完成。加入硼氫化鈉(9.9g，6eq)，5分鐘后，使反應(yīng)溫?zé)岬绞覝兀婵粘ゼ状?。將殘余物懸浮在乙?800ml)中。乙醚用水洗，水層再用乙醚回洗。合并的有機(jī)層用鹽水洗，干燥(Na2SO4)，過濾并真空濃縮得到油狀物。用5％乙酸乙酯/己烷使該油狀物通過硅膠板，然后用25％乙酸乙酯/己烷洗脫產(chǎn)物，得到11.0g(收率50％)淺黃色油狀的醇，1-(叔丁基二甲硅烷氧基)-3-(2-(羥基)乙氧基)-4-(叔丁基聯(lián)苯基)-丁烷。MS.NMR.
在氮?dú)夥铡?℃下，往醇，1-(叔丁基二甲硅烷氧基)-3-(2-(羥基)乙氧基)-4-(叔丁基聯(lián)苯基)-丁烷(11.0g，21.9mmol)的無水乙醚(200ml)溶液中加入三乙胺(4.6ml，1.5eq)和甲磺酰氯(2.5ml，1.5eq)。1.5小時(shí)后，TLC(5％乙酸乙酯/二氯甲烷)監(jiān)測反應(yīng)完成。反應(yīng)物用乙醚(250ml)稀釋，用水(2x)、鹽水(2x)洗，干燥(Na2SO4)，過濾并真空濃縮，得到油。用5％乙酸乙酯/己烷使該油狀物通過硅膠板，然后用25％乙酸乙酯/己烷洗脫產(chǎn)物，得到11.6g(收率91％)的油狀甲磺酰酯，1-(叔丁基二甲硅烷氧基)-3-(2-(甲磺酰氧基)乙氧基)-4-(叔丁基聯(lián)苯基)-丁烷。MS.NMR.
在氮?dú)夥障拢谆酋ｕ?-(叔丁基二甲硅烷氧基)-3-(2-(甲磺酰氧基)乙氧基)-4-(叔丁基聯(lián)苯基)-丁烷(11.6g，20mmol)的丙酮(300ml)溶液中加入碘化鈉(44g，15eq)和碳酸氫鈉(170mg，0.1eq)。將混合物回流18小時(shí)，然后真空下除去丙酮。所得殘余物懸浮于乙醚中，用水(2x)洗，并用乙醚再回洗水相。合并的乙醚相用10％亞硫酸鈉溶液洗、鹽水(2x)洗，干燥(MgSO4)，過濾并真空濃縮，得到10.7g(收率87％)油狀的標(biāo)題碘化物，該產(chǎn)物無需純化即可用于下步反應(yīng)。MS.NMR.
制備例9
3，4-[(N，N’-1，1’-((2”-乙氧基)-3(O)-4-(羥基)-丁烷-雙-(3，3’-吲哚基)]-1(H)-吡咯-2.5-二酮在氮?dú)夥障?，?3，3’-吲哚基)-1-(甲基)-吡咯-2，5-二酮(17.9g，52.5mmol，3eq)的二甲基甲酰胺(250ml)溶液中加入碳酸銫(68.4g，4eq)。往所得懸浮液中加入碘化物，1-(叔丁基二甲硅烷氧基)-3-(2-碘代乙氧基)-4-(叔丁基聯(lián)苯基甲硅烷氧基)-丁烷(10.7g，17.5mmol)。該反應(yīng)在室溫?cái)嚢?8小時(shí)。TLC(5％乙酸乙酯/己烷)顯示碘化物消失。將反應(yīng)物傾入乙酸乙酯(1200ml)，用1N HCl(400ml)洗，然后用乙酸乙酯回洗(2x)。將合并的乙酸乙酯部分用飽和碳酸氫鈉溶液洗(2x)，干燥(MgSO4)，過濾并真空濃縮。通過用二甲苯共沸除去二甲基甲酰胺。所得紅色膠狀物加到二氯甲烷和乙腈中攪拌，得到固體懸浮物。濃縮，再加入多量的二氯甲烷，冷卻并過濾得到紅色固體。通過再次在二氯甲烷中研磨和然后再在乙酸乙酯中從該固體中提取出部分目的產(chǎn)物。將濾液真空濃縮，并將所得殘余物吸附于硅膠，應(yīng)用閃式柱色譜。用5己烷/1乙酸乙酯洗脫除去二烷基化的副產(chǎn)物，然后用3己烷/1乙酸乙酯洗脫得到8.2g(57％)單烷基化產(chǎn)物，3-[(N-1-(2-乙氧基-(3-(O)-4-(叔丁基聯(lián)苯基甲硅烷氧基)-1-(叔丁基二甲硅烷氧基)-丁烷))-吲哚-3-基]-4-[吲哚-3-基]-1N(甲基)-吡咯-2，5-二酮。MS.NMR.
在氮?dú)夥蘸?℃下，往叔丁基二甲硅烷醚，3-[(N-1-(2-乙氧基-(3-(O)-4-(叔丁基聯(lián)苯基甲硅烷氧基)-1-(叔丁基二甲硅烷氧基)-丁烷))-吲哚-3-基]-4-[吲哚-3-基]-1N(甲基)-吡咯-2，5-二酮(8.2g，9.9mmol)的甲醇(450ml)溶液中加入對(duì)甲苯磺酸(0.16g，0.085eq)。2小時(shí)后，TLC(50％乙酸乙酯/己烷)顯示反應(yīng)接近完成。用固體碳酸氫鈉(0.14g)中止反應(yīng)。真空除去甲醇。所得殘余物溶于乙酸乙酯，用0.1N氫氧化鈉、鹽水(2x)洗，干燥(MgSO4)，過濾并真空濃縮得到紅色泡沫物。該泡沫物吸附于硅膠，置于硅膠板上。用2己烷/1乙酸乙酯洗脫除去殘留的原料，然后用1己烷/1乙酸乙酯和1己烷/2乙酸乙酯洗脫，得到6.4g(91％)醇，3-[(N-1-(2-乙氧基-(3-(O)-4-(叔丁基聯(lián)苯基甲硅烷氧基)-1-(羥基)-丁烷))-吲哚-3-基]-4-[吲哚-3-基]-1N(甲基)-吡咯-2，5-二酮。MS.NMR.
在氮?dú)夥蘸?℃下，往醇，3-[(N-1-(2-乙氧基-(3-(O)-4-(叔丁基聯(lián)苯基甲硅烷氧基)-1-(羥基)-丁烷))-吲哚-3-基]-4-[吲哚-3-基]-1N(甲基)-吡咯-2，5-二酮(6.36g，8.9mmol)的無水乙醚(500ml)溶液中加入三乙胺(1.9ml，1.5eq)和甲磺酰氯(1.0ml，1.5eq)。3小時(shí)后，再加入三乙胺(1.25ml，1.0eq)和甲磺酰氯(0.7ml，1.0eq)。1小時(shí)后，TLC(50％乙酸乙酯/己烷)顯示反應(yīng)完成。該反應(yīng)物用乙醚(250ml)稀釋，用水、0.1N HCl和鹽水洗(2x)。將乙醚液干燥(MgSO4)，過濾并真空濃縮，得到7.0g甲磺酸酯，3-[(N-1-(2-乙氧基-(3-(O)-4-(叔丁基聯(lián)苯基甲硅烷氧基)-1-(甲磺酰氧基)-丁烷))-吲哚-3-基]-4-[吲哚-3-基]-1N(甲基)-吡咯-2，5-二酮。MS在氮?dú)夥障?，往甲磺酸酯?-[(N-1-(2-乙氧基-(3-(O)-4-(叔丁基聯(lián)苯基甲硅烷氧基)-1-(甲磺酰氧基)-丁烷))-吲哚-3-基]-4-[吲哚-3-基]-1N(甲基)-吡咯-2，5-二酮(7.0g，8.9mmol)的丙酮(200ml)溶液中加入碘化鈉(13.3g，10eq)和碳酸氫鈉(75mg，0.1eq)。該混合物在50℃攪拌13小時(shí)。真空濃縮反應(yīng)物，殘余物溶于乙醚中，用10％亞硫酸鈉溶液洗。分層后，醚層用10％亞硫酸鈉溶液、水、鹽水洗(2x)，干燥并真空濃縮。殘余物結(jié)果硅膠板，用1己烷/1乙酸乙酯和1己烷/2乙酸乙酯洗，得到7.6g紅色固體狀碘化物，3-[(N-1-(2-乙氧基-(3-(O)-4-(叔丁基聯(lián)苯基甲硅烷氧基)-1-(碘代)-丁烷))-吲哚-3-基]-4-[吲哚-3-基]-1N(甲基)-吡咯-2，5-二酮(兩步的定性收率)。MS.NMR.
在氮?dú)夥障拢?5小時(shí)，往碳酸銫(12.0g，4eq)的二甲基甲酰胺(1L)懸浮液中經(jīng)注射泵加入溶在二甲基甲酰胺(25ml)中的碘化物，3-[(N-1-(2-乙氧基-(3-(O)-4-(叔丁基聯(lián)苯基甲硅烷氧基)-1-(碘代)-丁烷))-吲哚-3-基]-4-[吲哚-3-基]-1N(甲基)-吡咯-2，5-二酮(7.6g，9.2mmol)。添加完畢3小時(shí)后，真空濃縮反應(yīng)物。殘余物溶于乙酸乙酯(700ml)，用水(2×300ml)洗，水層用乙酸乙酯回洗(2×200ml)。合并的乙酸乙酯部分用鹽水洗(2×200ml)，干燥(MgSO4)，過濾并真空濃縮紅紫色殘余物。將殘余物吸附于硅膠并應(yīng)用于閃式柱色譜。用3己烷/1乙酸乙酯洗，然后用1己烷/乙酸乙酯洗，得到5.2g(82％)大環(huán)分子，3，4-[(N，N’-1，1’-((2”-乙氧基)-3-(O)-4-(叔丁基聯(lián)苯基甲硅烷氧基)-丁烷)-雙-(3，3’-吲哚基)]-1(H)-吡咯-2，5-二酮。MS.NMR.
將N-甲基馬來酰亞胺、3，4-[(N，N’-1，1’-((2”-乙氧基)-3-(O)-4-(叔丁基聯(lián)苯基甲硅烷氧基)-丁烷)-雙-(3，3’-吲哚基)]-1(H)-吡咯-2，5-二酮在5NKOH(150ml)和乙醇(300ml)中的懸浮液在室溫?cái)嚢?5小時(shí)，然后在60℃攪拌1小時(shí)。該反應(yīng)物真空濃縮(150ml)，殘余物懸浮于水中，冷卻到5℃，用濃鹽酸酸化(pH3)。該紅色水懸浮液用乙酸乙酯萃取(4×200ml)，干燥并真空濃縮，得到3.3g紅紫色固體狀粗產(chǎn)物酸酐醇，2，3-[(N，N’-1，1’-((2”-乙氧基)-3-(O)-4-(羥基)-丁烷)-雙-(3，3’-吲哚基)]-呋喃-1，4-二酮。MS.
在氮?dú)夥障?，?，3-[(N，N’-1，1’-((2”-乙氧基)-3-(O)-4-(羥基)-丁烷)-雙-(3，3’-吲哚基)-呋喃-1，4-二酮(3.3g，7.5mmol)的二甲基甲酰胺(250ml)溶液中加入1，1，1，3，3，3-六甲基二硅氮烷(32ml，2eq)和甲醇(3ml，10eq)。該反應(yīng)物在室溫?cái)嚢?6小時(shí)，然后在60℃攪拌2小時(shí)。真空除去二甲基甲酰胺，所得殘余物溶于乙腈(250ml)。加入1N HCl(50ml)。將反應(yīng)攪拌15分鐘。濃縮反應(yīng)物，并將其分配到乙酸乙酯(1L)和水(250ml)中。沉淀的固體產(chǎn)物是醇馬來酰亞胺，3，4-[(N，N’-1，1’-((2”-乙氧基)-3(O)-4-(羥基)-丁烷)-雙-(3，3’-吲哚基)]-1(H)-吡咯-2，5-二酮，0.92g(28％)產(chǎn)物。將少量產(chǎn)物(50mg)吸附于硅膠并運(yùn)用閃式柱色譜。用二氯甲烷、5％乙腈/二氯甲烷、然后是10％乙腈/二氯甲烷洗脫，得到38mg分析純的產(chǎn)物。將乙酸乙酯濃縮并進(jìn)行色譜，得到另外8％的粗產(chǎn)物。MS1H NMR(d6-DMSO)δ1.96(1H，m)；2.09(1H，m)；3.31(1H，m)；3.40(1H，m)；3.51(1H，m)；3.62(1H，m)；3.89(1H，m)；4.18(3H，m)；4.35(1H，m)，4.68(1H，t，J＝2Hz)；7.11(2H，m)；7.19(2H，m)；7.44(1H，s)7.46(1H，d，J＝9Hz)；7.51(1H，s)7.53(1H，d，J＝9Hz)；7.79(1H，d，J＝8Hz)；7.83(1H，d，J＝8Hz)；10.91(1H，s).
制備例103，4-[(N，N’-1，1’-((2”-乙氧基)-3(O)-4-(N，N-二甲氨基)-丁烷)-雙-(3，3’-吲哚基)]-1(H)-吡咯-2，5-二酮HCl鹽在氮?dú)夥障?，往醇?，4-[(N，N’-1，1’-((2”-乙氧基)-3(O)-4-(羥基)-丁烷)-雙-(3，3’-吲哚基)]-1(H)-吡咯-2，5-二酮(472mg，1.07mmol)的無水二氯甲烷(140ml)懸浮液中加入吡啶(260μl，3eq)和甲磺酸酐(242mg，1.3eq)。4小時(shí)后，該反應(yīng)物用二氯甲烷稀釋，用0.1N HCl洗(2x)并過濾除去原料(54mg)。二氯甲烷部分用鹽水洗(2x)，干燥并濃縮得到紅紫色固體狀的甲磺酸酯粗品。使該產(chǎn)物吸附于硅膠并上樣于閃式柱，順次用二氯甲烷、5％乙腈/二氯甲烷和10％乙腈/二氯甲烷洗脫，得到288mg(收率52％)甲磺酸酯，3，4-[(N，N’-1，1’-((2”-乙氧基)-3(O)-4-(甲磺酰氧基)-丁烷)-雙-(3，3’-吲哚基)]-1(H)-吡咯-2，5-二酮。MS.NMR.
往甲磺酸酯，3，4-[(N，N’-1，1’-((2”-乙氧基)-3(O)-4-(甲磺酰氧基)-丁烷)-雙-(3，3’-吲哚基)]-1(H)-吡咯-2，5-二酮(304mg，0.59mmol)的四氫呋喃(20ml)溶液中加入8.9M二甲胺的四氫呋喃(7ml，100eq)溶液。在密封管中加熱24小時(shí)后，(65℃)，該反應(yīng)物用乙酸乙酯(200ml)稀釋，鹽水洗(2x)，干(燥并濃縮得到固體狀的二甲胺衍生物粗品。使該反應(yīng)物吸附于硅膠并上樣于閃式柱，順次用3乙酸乙酯/1己烷、乙酸乙酯和2％異丙胺/乙酸乙酯洗脫，得到193mg(收率70％)的二甲胺衍生物，經(jīng)HPLC檢測純度為90％。采用反相大小排阻色譜法，用85乙腈/15(0.01％TFA/水)洗脫純化，得到純度大于95％的三氟乙酸鹽形式的二甲胺衍生物，3，4-[(N，N’-1，1’-((2”-乙氧基)-3(O)-4-(N，N-二甲氨基)-丁烷)-雙-(3，3’-吲哚基)]-1(H)-吡咯-2，5-二酮。
通過將3，4-[(N，N’-1，1’-((2”-乙氧基)-3(O)-4-(N，N-二甲氨基)-丁烷)-雙-(3，3’-吲哚基)]-1(H)-吡咯-2，5-二酮的三氟乙酸鹽懸浮在乙酸乙酯中，用0.1NNaOH溫和地洗滌(5×50ml)將其轉(zhuǎn)化為HCl鹽。該乙酸乙酯部分用鹽水洗(2x)，干燥并濃縮得到游離堿，3，4-[(N，N’-1，1’-((2”-乙氧基)-3(O)-4-(N，N-二甲氨基)-丁烷)-雙-(3，3’-吲哚基)]-1(H)-吡咯-2，5-二酮。往該游離堿，3，4-[(N，N’-1，1’-((2”-乙氧基)-3(O)-4-(N，N-二甲氨基)-丁烷)-雙-(3，3’-吲哚基)]-1(H)-吡咯-2，5-二酮的無水甲醇(50ml)懸浮液中加入1N HCl的無水乙醚溶液(13ml，50eq)。蒸發(fā)乙醚，殘余物在真空下干燥，得到143mg(收率52％)紅色固體狀的3，4-[(N，N’-1，1’-((2”-乙氧基)-3(O)-4-(N，N-二甲氨基)-丁烷)-雙-(3，3’-吲哚基)]-1(H)-吡咯-2，5-二酮鹽酸鹽。MS1H NMR(d6-DMSO)δ2.03(1H，m)；2.26(1H，m)；2.68(6H，t，J＝5Hz)；3.24(1H，m)；3.28，(1H，m，after D2O shake)；3.64(1H，m)；3.77(2H，m)；4.07-4.38(4H，m)；7.08(2H，m)；7.17(2H，m)；7.43(3H，m)；7.52(1H，d，J＝8Hz)；7.79(2H，m)；10.33(1H，bs)；10.92(1H，s)
實(shí)施例13，4-[(N，N’-1，1’-((2”-乙氧基)-(3(O)-4-(N-三氟甲氨基)-丁烷)-雙-(3，3’-吲哚基)]-1(H)-吡咯-2，5-二酮在氮?dú)夥障?，將以類似于制備?0的方法制備的3，4-[(N，N’-1，1’-((2”-乙氧基)-3(O)-4-(N-甲氨基)-丁烷)-雙-(3，3’-吲哚基)]-1(甲基)-吡咯-2，5-二酮(20mg，0.04mmol)溶于含三乙胺(6.1μl，0.044mmol)的THF(10ml)中。往該溶液中加入二硫化碳(3微升，0.05mmol)，在15分鐘后，加入碘甲烷。經(jīng)TLC檢測(10％MeOH在CH2Cl2中)，反應(yīng)在12小時(shí)后完成。該反應(yīng)混合物用乙酸乙酯稀釋，用水、鹽水洗，干燥并濃縮得到二硫代氨基甲酸酯(23mg，預(yù)期質(zhì)量)IS/MS 559(M++1)558。
往二硫代氨基甲酸酯的二氯甲烷溶液中加入四丁基二氫三氟化銨(tetrabutylammonium dihydrogentrifluoride)和N-溴代琥珀酰亞胺。經(jīng)色譜后處理和純化，得到3，4-[(N，N’-1，1’-((2”-乙氧基)-3(O)-4-(N，N+(三氟甲基)甲氨基)-丁烷)-雙-(3，3’-吲哚基)]-1(甲基)-吡咯-2，5-二酮，將其轉(zhuǎn)化為N-H馬來酰亞胺。
三氟甲胺衍生物也可以如下制備往單甲胺的DMSO溶液中加入二溴二氟甲烷和四(二甲胺)-乙烯。進(jìn)行普通的后處理得到所需的三氟甲胺衍生物。該三氟甲胺衍生物可按照前述轉(zhuǎn)化為N-H馬采酰亞胺。
如上所述，本發(fā)明的混合物是有效的蛋白激酶C抑制劑。與其它激酶相比，這些化合物對(duì)蛋白激酶C具有選擇性。本發(fā)明化合物選擇性抑制蛋白激酶C的能力在鈣-鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶分析、酪蛋白激酶II分析、cAMP-依賴性蛋白激酶催化的亞單位分析和蛋白-酪氨酸激酶分析中測定。
鈣-鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶分析(CaM)鈣-鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶分析記述于Journal or Neuroscience，3818-831(1983)。分析成分的總體積為250μl55mM HEPES(4-(2-羥乙基)-1-哌嗪-乙磺酸)，pH7.5，2.75mM二硫代蘇糖醇，2.2mM EGTA(亞乙基雙(氧亞乙基次氮基)四乙酸，用于空白緩沖劑)，1.1mM氯化鈣(Sigma，St，Louis，Missouri)(用于對(duì)照緩沖劑)，10mM氯化鎂(Sigma，St.Louis，Missouri)，200μg/ml HL型組蛋白(Worthington)，10μlDMSO或DMSO/抑制劑和30μM(γ-32p)ATP(Dupont)。該反應(yīng)通過加入鈣-鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶(從大鼠腦勻漿分離)引發(fā)，在室溫保溫10分鐘，通過加入0.5ml冰冷的三氯乙酸停止反應(yīng)(Amresco)，然后加入100μl1mg/ml牛血清白蛋白(Sigma，St.Missouri)。通過真空過濾在玻璃纖維濾器上收集沉淀并以β閃爍計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)定量。
緩沖液成分對(duì)照緩沖液空白緩沖液200 mM HEPES 3125μl 625μlpH 7.550mM DTT 625μl125μl組蛋白 1250μl 250μl100mM鈣 125μl----100mM EGTA ---- 50μlDI水 2375μl 450μl分析成分165μl緩沖液
25μl調(diào)鈣蛋白10μl DMSO或DMSO/抑制劑25μl激酶25μl AT32P。
酪蛋白激酶II分析(CK-II)酪蛋白激酶II分析記述于Neurochem，Res.，13829-836(1988)。分析成分的總體積為250μl20mM Tris-HCl，pH7.5，5mM氟化鈉，50mg/ml酪蛋白(Sigma，St，Louis，Missouri)，10mM氯化鎂(Sigma，St.Louis，Missouri)，10μl DMSO或DMSO/抑制劑和30μM(γ-32p)ATP(Dupont)。通過加入酪蛋白激酶II(從大鼠腦勻漿分離)引發(fā)反應(yīng)，在室溫保溫10分鐘，通過加入0.5ml冰冷的三氯乙酸停止反應(yīng)(Amresco)，然后加入100μl1mg/ml牛血清白蛋白(Sigma，St.Missouri)。通過真空過濾在玻璃纖維濾器上收集沉淀并以β閃爍計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)定量。
按序加入的分析成分175μl緩沖液10μl DMSO或DMSO/抑制劑25μl AT32P(在300mM氯化鎂中)25μl酶。
如下制備緩沖液(終體積＝3.5ml20次分析的量)500μl每份 200mM Tris-HClpH 7.550mM氟化鈉50mg/ml酪蛋白+2ml DI水總體積3.5mlcAMP-依賴性蛋白激酶催化的亞單位分析(PKA)分析成分總體積為250μl20mM HEPES(Sigma，St.Louis，Missouri)緩沖液pH7.5，200μg/ml組蛋白型HL(Worthington)，10mM氯化鎂(Sigma，St.Louis，Missouri)，10μl DMSO或DMSO/抑制劑和30μM(γ-32p)ATP(Dupont)。該反應(yīng)通過加入牛心臟cAMP-依賴性激酶催化的亞單位(Sigma，St. Louis，Missouri)引發(fā)，在30℃保溫10分鐘，通過加入0.5ml冰冷的三氯乙酸停止反應(yīng)(Amresco)，然后加入100μl lmg/ml牛血清白蛋白(Sigma)。使用TOMTECTM通過真空過濾在玻璃纖維濾器上收集沉淀并以β閃爍計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)定量。除在分析中不使用磷脂或二酰基甘油和組蛋白底物是cAMP-依賴性催化的亞單位酶特異性的外，該分析與蛋白激酶C(PKC)酶分析相同。
蛋白酪氨酸激酶分析(src)分析成分如下10μl Raytide10μl激酶4μl DMSO或DMSO/抑制劑6μl200 mM HEPES pH 7.510μl AT32P該分析記述于Onogene Science，Inc.Cat.#PK02和Pk03(1990)。
出人意料地，本發(fā)明的化合物還是同功酶選擇性抑制劑，即化合物選擇性地抑制蛋白激酶Cβ-1和β-2同功酶。該同功酶選擇性在PKC酶分析中得以測定。
PKC酶分析PKC酶＝α、βI、βII、γ、δ、ε、η和ζ。
分析總體積為250μl，成分如下含有120μg/ml磷脂酰絲氨酸(Avanti極性脂質(zhì))和足量的二?；视?Avanti極性脂質(zhì))、在20mM HEPES(Sigma，St.Louis，Missouri)緩沖液中(pH 7.5)將酶活化到最大活性的泡囊，940mM氯化鈣(Sigma，St.Louis，Missouri)(僅用于分析α、β-1、β-2和γ酶)，1mM EGTA(適用于所有的酶)，10mM氯化鎂(Sigma，St.Louis，Missouri)和30μM(γ-32p)ATP(Dupont)。對(duì)于所有的酶均使用HL型組蛋白(Worthington)或髓磷脂基礎(chǔ)蛋白為底物。該反應(yīng)通過加入蛋白激酶C開始，在30℃保溫10分鐘，通過加入0.5ml冰冷的三氯乙酸停止反應(yīng)(Amresco)，然后加入100μl 1mg/ml牛血清白蛋白(Sigma，St.Louis，Missouri)。使用TOMTECTM通過真空過濾在玻璃纖維濾器上收集沉淀并以β閃爍計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)定量。
本發(fā)明化合物抑制蛋白激酶C的IC50值低于100μm。此外，本發(fā)明化合物選擇性抑制β-1和β-2蛋白激酶C同功酶并對(duì)于這些同功酶的IC50值低于10μm。
作為蛋白激酶C抑制劑，本發(fā)明化合物用于治療其中已證明蛋白激酶C在病理學(xué)中起作用的疾病。在這一領(lǐng)域所知道的病癥包括糖尿病及其并發(fā)癥，局部缺血，炎癥、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，心血管疾病，阿爾茨海默氏癥，皮膚病和癌癥。
據(jù)顯示，蛋白激酶C抑制劑阻斷炎癥反應(yīng)，如嗜中性粒細(xì)胞氧化爆發(fā)、T淋巴細(xì)胞的CD3下調(diào)和氟波醇誘導(dǎo)的爪水腫。Twoemy，B.等，生物化學(xué)及生物物理學(xué)研究通訊，1711087-1092(1990)；Mulqueen，M.J.等，Agents Actions，3785-89(1992)。因此，作為PKC抑制劑，本發(fā)明的化合物可用于治療炎癥。
蛋白激酶C活性在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中起重要作用。Huang，K.P.Trend，Neurosci.12425-432(1989)。此外，蛋白激酶C抑制劑還顯示出阻止病灶部位觀察到的損傷和中樞缺血性腦損傷和腦水腫。Hara，H.等，J.Cereb.Blood Flow Metab.10646-653(1990)。最近，還證明蛋白激酶C與阿爾茨海默氏癥有關(guān)。Shimohama，S.等，Neurology 431407-1413(1993)。因此，本發(fā)明的化合物可用于治療阿爾茨海默氏癥和局部缺血性腦損傷。
已知蛋白激酶C活性與細(xì)胞生長、腫瘤助長和癌癥有關(guān)。Rotenberg，S.A和Weinstein，I.B.Biochem.Mol.Aspects Sel.Cancer，125-73(1991).Ahmad等，分子藥理學(xué)43，858-862(1993)。還已知蛋白激酶C抑制劑的抑制劑能有效地防止動(dòng)物中的腫瘤生長。Meyer，T.等，國際癌癥雜志，43851-856(1989)；Akinagaka，S.等，癌癥研究，514888-4892(1991)。本發(fā)明的化合物還用作多藥逆轉(zhuǎn)(MDR)劑，當(dāng)與其它化療劑聯(lián)合服用時(shí)，使它們更有效。
蛋白激酶C活性在心血管疾病中也起重要作用。據(jù)顯示，脈管系統(tǒng)中增高的蛋白激酶C活性引起血管收縮性增強(qiáng)和高血壓。Bilder，G.E.等，J.Pharmacol.Exp.Ther.252526-530(1990)。由于蛋白激酶C抑制劑顯示出嗜中性粒細(xì)胞氧化爆發(fā)的抑制作用，蛋白激酶C抑制劑還用于治療心血管局部缺血和改善局部缺血后的心臟功能。Muid，E.E.等，F(xiàn)EBS Lett.293169-172(1990)；Sonoki，H.等，Kokyu-To Junkan，37669-674(1989)。
對(duì)蛋白激酶C在血小板功能中的作用已進(jìn)行了研究，顯示升高的蛋白激酶C水平與對(duì)激動(dòng)劑的反應(yīng)性增高有關(guān)。Bastyr III，E.J.和Lu，糖尿病雜志，42(增補(bǔ)1)97A(1993)。PKC涉及微血管滲透性的血小板活性因子調(diào)節(jié)的生化途徑。Kobayashi等，Amer.Phys.Soc.H1214-H1220(1994)。據(jù)證明，高效蛋白激酶C抑制劑可影響激動(dòng)劑誘導(dǎo)的血小板凝集。Toullec，D等，生物化學(xué)雜志，26615771-15781(1991)。蛋白激酶C抑制劑還阻斷加到誘導(dǎo)的平滑肌細(xì)胞增殖。Matsumoto，H.和Sasaki，Y.生物化學(xué)和生物物理學(xué)研究通訊，158105-109(1989)。因此，本發(fā)明化合物可用于治療心血管疾病、動(dòng)脈粥樣硬化和再狹窄。
蛋白激酶C的異?；瘜W(xué)與皮膚病，如銀屑病有關(guān)。Horm，F(xiàn).等，J.InvestDermatol.88220-222(1987)；Raynaud，F(xiàn).和Evain-Brion，D.，英國皮膚科學(xué)雜志，124542-546(1991)。銀屑病以角化細(xì)胞的異常增殖為特征。已知蛋白激酶C抑制劑以它們作為PKC抑制劑產(chǎn)生作用的相似方法抑制角化細(xì)胞的增殖。Hegemann，L.等，Arch.Dermatol Res.283456-460(1991)；Bollab，W.B.等，J.Invest.Dermatol，100240-246(1993)。因此，作為PKC抑制劑的化合物可用于治療銀屑病。
蛋白激酶C與糖尿病的幾個(gè)方面都有關(guān)。蛋白激酶C的過度活性與胰島素發(fā)信號(hào)缺損而導(dǎo)致II型糖尿病中觀察到的胰島素抗性有關(guān)。A.等，生物化學(xué)雜志，26510226-10231(1990)；Chen，K.S.等，Trans.Assoc.AmPhysicians，104206-212(1991)；Chin，J.E.等，生物化學(xué)雜志，2686338-6347(1993)。此外，研究還表明當(dāng)患高血糖癥時(shí)，組織中蛋白激酶C活性的顯著增高易患糖尿病并發(fā)癥。Lee，T.-S.等，J.Clin.Invest.、8390-94(1989)；Lee，T.-S.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，865141-5145(1989)；Craven，P.A.和DeRubertis，F(xiàn).R.，J.Clin.Invest.871667-1675(1989)；Wolf.B.A.等，J.Clin，Invest.8731-38(1991)；Tesfamariam，B.等，J.Clin.Invest.871643-1648(1991)。
本發(fā)明的化合物還具有同功酶選擇性。與其它蛋白激酶C同功酶，即α、β、γ、δ、ε、η和ζ相比，這些化合物優(yōu)勢抑制蛋白激酶C的β-1和β-2同功酶。通常，正如在PKC分析中測定所表明的，化合物抑制PKC β-1或β-2同功酶所需的劑量與同樣抑制α蛋白激酶C同功酶所需的劑量之間的差異最小為10倍。因此，本發(fā)明化合物以低得多的濃度抑制蛋白激酶C的β-1和β-2同功酶，同時(shí)微弱抑制其它PKC同功酶。
由于這種選擇性，本發(fā)明的化合物尤其可用于治療那些其中與蛋白激酶C同功酶β-1和β-2相關(guān)的疾病。例如糖尿病中發(fā)現(xiàn)的血糖水平升高導(dǎo)致血管組織中β-2同功酶的同功酶特異性升高。Inoguchi等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，891059-11065(1992)。人血小板中β同功酶的糖尿病相關(guān)性升高與它們對(duì)激動(dòng)劑的反應(yīng)變化是一致的。Bastyr III，E.J.和Lu，J糖尿病，42(增補(bǔ)1)97A(1993)。據(jù)顯示，蛋白激酶C的β同功酶選擇性磷?；司S生素D受體。Hsieh等，Proc.Natl Acad.Sci.USA，889315-9319(1991)；Hsieh等，生物化學(xué)雜志，26815118-15126(1993)。此外，新近的研究表明β-2同功酶引起紅白血病細(xì)胞增殖，而在這些相同的細(xì)胞中，α同功酶與巨核細(xì)胞的分化有關(guān)。Murray等，生物化學(xué)雜志，26815847-15853(1993)。
優(yōu)選在服用前將式I化合物進(jìn)行配制。因此，本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是含有式I化合物和一種或多種可藥用載體、稀釋劑或賦形劑的藥物組合物。
本發(fā)明的藥物制劑采用本領(lǐng)域已知的方法，使用熟知的和簡便易得的成分。在本發(fā)明組合物的制備中，通常將活性成分與載體混合，或用載體稀釋，或包封在膠囊、囊劑、紙或其它容器形式的載體中。當(dāng)載體用作稀釋劑時(shí)，它可以是固體、半固體或液體物質(zhì)，它們作為活性成分的載體、賦形劑或介質(zhì)。因此，組合物可以是片劑、丸、粉末、錠劑、囊劑、扁囊劑、酏劑、懸浮劑、乳劑、溶液劑、糖漿、氣霧劑(作為固體或在液體介質(zhì)中)、軟和硬明膠膠囊、栓劑、無菌注射液和無菌包裝粉末。
適宜的載體、賦形劑和稀釋劑的實(shí)例包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、金合歡膠、磷酸鈣、藻酸鹽、西黃蓍膠、明膠、硅酸鈣、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、纖維素、水糖漿、甲基纖維素、羥基苯甲酸甲酯和丙酯、滑石、硬脂酸鎂和礦物油。另外，制劑中還包括潤滑劑、潤濕劑、乳化劑和助懸劑，防腐劑、甜味劑或芳香劑?？蓪⒈景l(fā)明的組合物配制成給藥于患者后快速、緩慢或延遲釋放活性成分的制劑。組合物優(yōu)選配制成單位劑量形式的，每劑含約1-約500毫克，更優(yōu)選約5-約300毫克活性成分。但應(yīng)清楚的是服用的治療劑量由醫(yī)師根據(jù)有關(guān)情況決定，這些情況包括所醫(yī)治的病癥、給藥化合物的選擇及給藥途徑的選擇，因此上述的劑量范圍并不以任何方式對(duì)本發(fā)明構(gòu)成限定。術(shù)語“單位進(jìn)行形式”指適于作為被醫(yī)治的人或哺乳動(dòng)物的單位劑量的物理上分離的單位，每單位含計(jì)算產(chǎn)生所需治療作用的預(yù)定量的活性成分和適宜的藥物載體。
除上述的制劑外，本發(fā)明的化合物也可以局部給藥。局部制劑是軟膏劑、霜?jiǎng)┖湍z。
軟膏劑通常使用(1)油脂性基質(zhì)，即由固定油或烴，例如白凡士林或礦物油組成的基質(zhì)，或者(2)吸附性基質(zhì)，即由無水物質(zhì)或可吸附水的物質(zhì)，如無水羊毛脂組成的基質(zhì)。通常，在配制完無論是油脂性的或吸附性的基質(zhì)后，按照所需濃度加入一定量的活性成分(化合物)。
霜?jiǎng)┦怯?水乳液。它們由油相(內(nèi)相)和水相(連續(xù)相)組成，油相包括典型的固定油和烴等，如蠟、凡士林、礦物油等；水相包括水和所有水溶性物質(zhì)，如加成鹽。使用乳化劑穩(wěn)定兩相，例如使用表面活性劑，如月桂基硫酸鈉；親水膠質(zhì)，如膠質(zhì)粘土、V字膠(veegum)遙等。一般配制成乳液后，加入一定量的活性成分以獲得所需濃度。
凝膠包括選自油脂性基質(zhì)、水或乳液-懸浮液基質(zhì)的基質(zhì)。往基質(zhì)中加入膠凝劑，在基質(zhì)中形成母質(zhì)，增強(qiáng)其粘度。膠凝劑的實(shí)例是羥丙基纖維素、丙烯酸聚合物等。通常，在加入膠凝劑之前將活性成分按所需濃度加到制劑中。
摻入局部制劑中的化合物的量不十分嚴(yán)格；僅僅是濃度應(yīng)在足以方便制劑以釋放所需量化合物的量應(yīng)用于疾患組織面的范圍內(nèi)。
應(yīng)用于疾患組織的局部制劑的常規(guī)量取決于患面組織的大小和制劑中化合物的濃度。通常，制劑以提供約1-約500μg化合物/cm2患面的量應(yīng)用于患面組織?；衔锏膽?yīng)用量優(yōu)選在約30-約300μg/cm2，更優(yōu)選在約50-約200μg/cm2，最優(yōu)選在約60-約100μg/cm2。
下述制劑實(shí)施例僅是說明性的，而不是以任何方式限定本發(fā)明的范圍。
制劑1用下列成分制備硬明膠膠囊量(mg/囊)活性物質(zhì) 250淀粉，干燥的 200硬脂酸鎂 10總計(jì) 460mg
將上述成分混合，以460mg的量填充到硬明膠膠囊中。
制劑2用下列成分制備片劑量(mg/囊)活性物質(zhì)250微晶纖維素 400二氧化硅，霧化的10硬脂酸 5總計(jì)665mg將成分混合，壓制成片劑，片重665mg。
制劑3制備含下列成分的氣霧劑量(mg/囊)活性物質(zhì) 0.25乙醇 29.75拋射劑22(二氯二氟甲烷) 70.00總計(jì) 100.00將活性物質(zhì)與乙醇混合。該混合物加到一份拋射劑22中，冷卻到-30℃，轉(zhuǎn)移到填充裝置中。然后將所需量的填入不銹鋼容器并用剩余的拋射劑稀釋。然后將閥門安裝到容器上。
權(quán)利要求
1.下式的化合物及其可藥用鹽或溶劑化物
其中W是O，-S-或NH；R1獨(dú)立地是氫，鹵素，C1-C4烷基，羥基，C1-C4烷氧基，鹵代烷基，硝基，-NH(C1-C4烷基)，-N(C1-C4烷基)2或-NHCO(C1-C4烷基)；R2是氫，CH3CO-，NH2或羥基；z是-(CH2)p-或-(CH2)p-O-(CH2)p-；R6是-NH(CF3)或-N(CF3)(CH3)；m獨(dú)立地是0，1，2或3；且p獨(dú)立地是0，1或2。
2.權(quán)利要求1的化合物，其中R2是氫。
3.權(quán)利要求2的化合物，其中W是-O-。
4.權(quán)利要求3的化合物，它是下式化合物
其中Z是-CH2-；R6是-NH(CF3)或N(CF3)(CH3)。
5.一種治療糖尿病及其并發(fā)癥的方法，包括給需此治療的哺乳動(dòng)物施用治療量的權(quán)利要求1-4的任一項(xiàng)化合物。
6.一種抑制蛋白激酶C的方法，包括給需此治療的哺乳動(dòng)物施用藥學(xué)上有效量的權(quán)利要求1-4的任一項(xiàng)化合物。
7.一種治療中樞局部缺血性腦損傷的方法，包括給需此治療的哺乳動(dòng)物施用治療有效量的權(quán)利要求1-4的任一項(xiàng)化合物。
8.一種治療心血管局部缺血的方法，包括給需此治療的哺乳動(dòng)物施用治療有效量的權(quán)利要求1-4的任一項(xiàng)化合物。
9.一種治療炎癥的方法，包括給需此治療的哺乳動(dòng)物施用治療有效量的權(quán)利要求1-4的任一項(xiàng)化合物。
10.一種治療再狹窄的方法，包括給需此治療的哺乳動(dòng)物施用治療有效量的權(quán)利要求1-4的任一項(xiàng)化合物。
11.一種治療動(dòng)脈粥樣硬化的方法，包括給需此治療的哺乳動(dòng)物施用治療有效量的權(quán)利要求1-4的任一項(xiàng)化合物。
12.一種治療銀屑病的方法，包括給需此治療的哺乳動(dòng)物施用治療有效量的權(quán)利要求1-4的任一項(xiàng)化合物。
13.一種治療阿爾茨海默氏癥的方法，包括給需此治療的哺乳動(dòng)物施用治療有效量的權(quán)利要求1-4的任一項(xiàng)化合物。
14.一種治療癌癥的方法，包括給需此治療的哺乳動(dòng)物施用治療有效量的權(quán)利要求1-4的任一項(xiàng)化合物。
15.一種藥物制劑，它含有權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的化合物和一種或多種可藥用賦形劑、載體或稀釋劑。
16.一種制備權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的化合物的方法，包括將下式化合物
其中V是-O-或N-CH3；W是O，-S-或-NH；R1獨(dú)立地是氫，鹵素，C1-C4烷基，羥基，C1-C4烷氧基，鹵代烷基，硝基，-NH(C1-C4烷基)，-N(C1-C4烷基)2或-NHCO(C1-C4烷基)；z是-(CH2)p-或-(CH2)p-O-(CH2)p-；R6是-NH(CF3)或-N(CF3)(CH3)；m獨(dú)立地是0，1，2或3；且p獨(dú)立地是0，1或2；與過量的試劑混合物和C1-C4醇在極性非質(zhì)子溶劑中反應(yīng)，所述試劑選自六甲基二硅氮烷或銨鹽。
17.權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的化合物，用作藥物。
全文摘要
本發(fā)明涉及新的式(Ⅰ)雙吲哚馬來酰亞胺大環(huán)衍生物。本發(fā)明還涉及它們的制備方法、藥物制劑和用于抑制哺乳動(dòng)物中蛋白激酶C的方法。
文檔編號(hào)A61K31/407GK1185742SQ96194257
公開日1998年6月24日 申請(qǐng)日期1996年3月28日 優(yōu)先權(quán)日1995年3月30日
發(fā)明者小W·F·黑思, M·R·吉?jiǎng)谏? J·H·麥多那爾德, C·J·里托 申請(qǐng)人:伊萊利利公司